基于簇毛麦基因组survey测序基础的高通量分子标记开发及应用

摘要

簇毛麦(Haynaldia villosaL，2n=14，VV)是普通小麦的二倍体野生近缘物种，具有抗生物胁迫和非生物胁迫等众多优异性状，是普通小麦改良的三级基因库，因而定位、转移和利用簇毛麦中优异基因可以有效地拓宽栽培小麦的遗传基础。高通量开发覆盖簇毛麦全基因组特异分子标记不仅可以有效鉴定普通小麦背景中的簇毛麦染色质，分析普通小麦染色体组与簇毛麦染色体之间的共线性关系，而且还可以加快将簇毛麦优异基因向普通小麦转移与利用的进程。目前，虽有一些关于簇毛麦各染色体特异分子标记的报道，但相对甚少，因此本研究将利用二代测序技术，高通量的开发簇毛麦各染色体的特异分子标记;同时，利用2VS染色体上的特异分子标记和涉及2VS染色体的结构变异体初步对簇毛麦2VS染色体上控制颖脊刚毛基因进行细胞学定位。 1.簇毛麦全基因组特异分子标记的开发 本研究首先利用二代测序技术(HiSeq2500)对簇毛麦全基因进行了survey测序及组装。以中国春D亚基因组已公布的注释基因为参考基因，利用其编码序列分别与中国春A、B和D亚基因组以及簇毛麦V基因组序列进行Blastn分析，确定其外显子的位置;然后计算内含子的大小，选取内含子差异合适的簇毛麦两端外显子序列进行跨内含子（Intron Targeting，IT）标记的开发。本研究总共开发了1624对IT分子标记，其中分布于簇毛麦1V、2V、3V、4V、5V、6V和7V染色体的IT分子标记分别为266对、323对、211对、151对、328对、138对和199对。利用这些引物在中国春、簇毛麦、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体的DNA中进行PCR扩增，结果发现1589对IT分子标记在三个DNA模板中均有扩增位点，35对IT分子标记没有任何扩增位点，有多态性扩增位点的IT标记为841对，多态率为51.79％。表明利用全基因组测序可以高通量的开发簇毛麦全基因组特异分子标记。 2.簇毛麦各染色体/臂特异IT分子标记的定位 为了能够将841对具有多态性的IT分子标记定位到特定的簇毛麦染色体上，本研究首先利用这些分子标记在本实验室前期创制的普通小麦-簇毛麦二体异添加系（DA1V、DA3V-DA7V）和代换系(Sub2V)的DNA模板中进行PCR扩增，结果将135对、175对、120对、89对、140对、71对和111对多态性分子标记分别定位到了簇毛麦1V、2V、3V、4V、5V、6V和7V染色体上。然后继续结合本实验室前期所创制的T1VL·1DS、T1VS·1DL、T2VL·2DS、T2VS·2DL、T4VL·4DS、T4VS·4DL、T5VS·5DL、T6VL·6AS、T6VS·6AL整臂易位系材料，根据多态性分子标记在这些材料中的扩增结果，将多态性分子标记定位到具体的簇毛麦染色体臂上，1VL、2VL、3VL、4VL、5VL、6VL、7VL染色体分别定位到了88对、118对、76对、86对、89对、71对和60对;1VS、2VS、3VS、4VS、5VS、7VS染色体分别定位到了47对、57对、44对、3对、51对和51对。根据扩增条带的数目，将841对IT分子标记划分为三种类型:类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ，分别扩增出的条带数目为4条、3条和2条，其中类型Ⅰ为共显性标记，可用于分子标记辅助选择育种中基因型的选择。 3.簇毛麦2VS染色体控制颖脊刚毛基因的细胞学定位 利用本实验室已经创制的涉及簇毛麦2VS染色体的整臂易位系、纯合小片段顶端易位系和大片段易位系，结合本研究开发的57对可以追踪簇毛麦2VS染色体的IT分子标记，将2VS分成了三个染色体区段，初步构建了2VS物理图谱，将控制颖脊刚毛的基因定位到了本研究新构建的2VS物理图谱第三区段内。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．2细胞学标记鉴定

1．3生化标记鉴定

2分子标记的发展和在染色体工程中的应用

2．1以分子杂交为基础的分子标记技术的发展和在染色体工程中的应用

2．2以聚合酶链式反应(PCR反应)为基础的分子标记技术的发展和在染色体工程中的应用

2．3基于DNA芯片和测序为基础的分子标记技术的发展和在染色体工程中的应用

3高通量测序的发展和应用

3．1 Sanger测序技术

3．2二代测序技术

3．3三代测序技术

3．4高通量测序在小麦育种中的应用

4簇毛麦

4．1簇毛麦的优异性状

4．2簇毛麦特异分子标记开发的研究进展

5本研究的目的意义

6技术路线

第二章研究报告

1材料与方法

1．1研究材料

1．2测序与组装

1．3引物设计

1．4 DNA模板制备

1．5 PCR扩增和产物检测

1．6染色体制片

1．7基因组原位杂交

2结果与分析

2．1涉及簇毛麦1V-7V添加系与代换系材料的鉴定

2．2簇毛麦各染色体特异IT分子标记的开发

2．3簇毛麦各染色体特异IT分子标记的筛选

2．4簇毛麦各染色体特异IT分子标记在各染色体臂的定位

2．5簇毛麦特异IT标记在2VS上的应用

3讨论

3．1簇毛麦染色体组与普通小麦D基因组共线性分析

3．2簇毛麦不同类型分子标记之间的多态性比较

3．3簇毛麦特异分子标记在染色体工程中的应用

全文结论

创新点

参考文献

附录

致谢