冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法

摘要

本发明提供一种冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型，如下式(5)所示，并提供了该预测模型的建立方法。本发明通过模型验证证实该模型能准确、客观、定量的反应冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的死亡情况，为草莓风险评估模型研究提供数据基础，有利于草莓的品质控制和风险预警、评估。Y

说明书

技术领域

本发明涉及一种冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)为革兰氏阴性肠杆菌，属于沙门氏菌乙组，能导致多种宿主动物肠道疾病，可以通过被污染的饮用水及食物进入人体，引起腹泻、呕吐、肠炎等疾病，严重时可致人死亡，其致病机理在于鼠伤寒沙门氏菌进入人体肠道后，通过入侵小肠上皮细胞及在肠毒素、内毒素的作用下，能够引起肠膜水肿、充血、组织炎症。沙门氏菌普遍存在动物粪便中，并通过农业设施中的灌溉水、施肥等途径传播。2015年9月，美国因沙门氏菌污染紧急召回墨西哥进口黄瓜事件再次引起公众对食源性微生物疾病的关注，该次事件已造成超过285人患病，其中53人入院，1人死亡。2008年美国爆发鼠伤寒沙门氏菌中毒事件，原因是西红柿污染。2012年2月英国出现西瓜大规模中毒事件，也与沙门氏菌感染有关[2]。

我国草莓种植面积从1985年的0.33万平方公顷增加至2009年的9.01万平方公顷，总产量达到220.6万吨，占世界总产量的35.7％，是世界草莓生产第一大国[2]。居民草莓消费量近年来逐渐增加，2007年鲜果消费总量约为177万吨，2009年初步估计已超过200吨，按13亿人口计算，人均消费量接近1.5kg[3]。然而，成熟后草莓果实娇嫩，含水量达到95％，采摘、加工、运输、销售过程中极易受机械伤害而渗出汁液，为有害微生物生长提供丰富的营养物质，常温条件下草莓储藏期仅1-2天[4]。

近年来，我国各省市生食果蔬类的沙门氏菌阳性率调查结果显示，果蔬中沙门氏菌的阳性率平均值为3.38％，个别地区沙门氏菌污染较为严重达到10％[5-8]。虽然我国尚缺少草莓表面鼠伤寒沙门氏菌污染率和污染水平的相关报道，但施肥、灌溉等过程可能造成细菌污染，且春季草莓成熟季节较温暖的温度可造成果实表面的细菌增长，对居民健康造成风险。目前国内鲜见有关草莓表面沙门氏菌的定量风险评估研究，也缺少根据科学研究结果对消费者家庭环节提出的健康消费指导。

预测微生物模型是风险评估的重要数据基础，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的预测模型是风险评估中的数据缺陷，因此，本发明对春季冷藏储藏条件下鼠伤寒沙门氏菌的数量变化规律进行模型拟合，建立微生物预测方程，为风险评估模型研究提供数据基础。

发明内容

本发明提供一种冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法，可以通过模型预测冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的死亡情况，模型预测值与实验数据偏差较小，可较好的拟合细菌死亡与时间关系。

本发明采用的技术方案是：

一种冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)鼠伤寒沙门氏菌活化培养，得到细菌培养液

(2)新鲜草莓用体积分数75％的酒精浸泡灭菌，灭菌后的草莓浸泡于细菌培养液中接种；

(3)接种后的草莓于冷藏温度下储藏，测定不同储藏时间下草莓上的菌株数；所述冷藏温度为4℃；

(4)将细菌计数后进行对数转换，用式(2)的线性模型进行细菌死亡曲线拟合

Y_red＝log₁₀>t-log₁₀>0＝c+d×t>

其中，t为冷藏温度下储藏时间，单位为小时，且t小于72小时；Nt(CFU/g)为t时的细菌数，N0(CFU/g)为样品初始带菌量；Yred为t时细菌对数值变化量，a,b分别为线性方程待拟合的参数；

线性拟合求出c、d。

线性拟合求出c、d后，可以得到细菌对数值变化量与时间的关系如下式(5)，即为冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型

Y_red＝log>t-log>0＝-0.220-0.012×t>

进一步，本发明使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)，编号ATCC14028，由浙江省农业科学院农产品质量标准研究所提供。

所述步骤(1)中，鼠伤寒沙门氏菌活化培养的步骤是：鼠伤寒沙门氏菌株保存于1ml冷冻管中，储存于-80℃冰箱，使用前取出，融化后吸取1ml菌液培养于300mL NB肉汤培养基中，37℃条件下震荡培养12h，得到细菌浓度为108CFU/ml的细菌培养液备用。

所述步骤(2)中，新鲜草莓用体积分数75％的酒精浸泡灭菌，一般将新鲜无伤口的草莓浸泡于体积分数75％的酒精溶液中2分钟，以杀灭表面微生物，取出后用无菌水反复冲洗，直至无酒精味后置于无菌烧杯中备用。

所述步骤(2)中，灭菌后的草莓浸泡于细菌培养液中接种，具体步骤一般为：灭菌后的草莓用细菌培养液浸没浸泡30分钟后将草莓取出置于无菌塑料盘上，于生物安全柜中静置30分钟，确保菌液接种至草莓表面，得到接种后的草莓。

所述步骤(3)中，冷藏温度下储藏，本发明选取冰箱冷藏温度4℃模拟草莓表面鼠伤寒沙门氏菌数量变化过程。

储藏时间考虑消费者日常储存草莓的平均最长时间，选取72小时为最长时间周期。

所述步骤(3)中，测定不同储藏时间下草莓上的菌株数，一般每隔一段时间取出草莓样品，采用平板计数法计数。

更具体的，按以下方法进行计数：取出草莓样品后，迅速转移至含有20ml生理盐水的均质袋中，用拍击式均质器拍打均质袋中的草莓1-2min，制成样品匀液，使用无菌枪头吸取1ml样品匀液加入9mL生理盐水试管稀释，漩涡混匀后制成1:10的样品匀液，再用生理盐水稀释2次，分别制成1：100、1：1000的样品匀液，用无菌枪头吸取0.1mL不同稀释度样品匀液，分别对应均匀涂布在10-1、10-2、10-3稀释度编号的XLD琼脂平板上，将涂布后的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36±1℃培养24±2h后计数。这是本领域技术人员公知的平板计数法。

一般每个时间点做3个重复实验，取3次实验平均值。

本发明所述方法还可以包括以下步骤(5)

(5)线性拟合求出c、d后，对模型进行验证，进一步，模型验证包括内验和外验，所述内验采用相关系数(R2)及标准误平方根(RMSE)作为内验结果来验证模型拟合度；所述外验是利用预测模型预测冷藏温度下不同储藏时间下草莓上的菌株数对数值变化量，然后进行验证实验，将实际测量值与预测值进行比较，利用方程(3)及(4)计算Ross提出的偏差因子Bf及精确因子Af，用于模型外验结果，以评价模型的准确性。

$>B_f={10}^{[\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\log \left(\frac{pred}{obs}\right)/n]}---\left(3\right)$>

$>A_f={10}^{\left[\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\right|\log \left(\frac{pred}{obs}\right)|/n]}---\left(4\right)$>

其中，n为实验组数，pred为线性方程预测得出细菌对数值变化量；obs为验证试验中细菌对数值变化量的观测值。Bf用于检验预测的准确度，若Bf>1，表示预测结果大于实际结果，反之亦然。Af用于检验预测的精确度，即预测值与观测值偏差的绝对值。

本研究中细菌的变化量以平均数及标准偏差的形式表示，以Microsoft Excel 2010(微软公司，雷德蒙，华盛顿州)进行数据处理。本研究以OriginPro 8.1软件(OriginLab，北安普敦，马萨诸塞州)中的线性拟合功能对数据进行拟合。

本发明还提供冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型，如下式(5)所示：

Y_red＝log>t-log>0＝-0.220-0.012×t(5)

其中，t为冷藏温度下储藏时间，Nt(CFU/g)为t时的细菌数，N0(CFU/g)为样品初始带菌量；Yred为t时细菌对数值变化量。

本发明在建立模型时发现，在冷藏条件下，随时间延长，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌死亡速率呈现线性规律，细菌较少趋势十分平缓，冷藏温度下果蔬表面沙门氏菌的存活能力较强，尤其是成熟度较高的草莓样品。本发明中利用线性方程拟合细菌对数值减少量(log Nt–logN0)与时间(t)关系，两者呈现较为显著的的线性关系，模型的校正相关系数R2为0.93，残差平方和较低，表明模型预测值与实验数据偏差较小，可较好的拟合细菌对数值变化量与时间关系。

利用本发明提供的预测模型预测冷藏下不同储藏时间下草莓上的菌株数，然后进行验证实验，将细菌对数值变化量的实际测量值与预测值进行比较，计算得出偏差因子为1.002，位于Ross提出的可接受范围0.9-1.05内。模型精度因子为1.13，表示预测值与观测值间仅误差13％。验证实验结果表明该线性方程可用于冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌对数值变化量的预测。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型，并通过模型验证证实该模型能准确、客观、定量的反应冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的变化情况，为草莓风险评估模型研究提供数据基础，有利于草莓的品质控制和风险预警、评估。

附图说明

图1草莓表面鼠伤寒沙门氏菌在冷藏条件下的死亡趋势图。

图2冷藏储藏时草莓表面鼠伤寒沙门氏菌对数值变化量随时间变化的线性方程拟合图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做详细的介绍：

1、材料与方法

(1)菌株和细菌培养

本实验使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)，编号ATCC14028，由浙江省农业科学院农产品质量标准研究所提供。

菌株保存于1ml冷冻管中，储存于-80℃冰箱，使用前取出，融化后吸取1ml菌液培养于300mlNB肉汤培养基(购于陆桥技术股份有限公司)中，37℃条件下震荡培养12h，得到细菌浓度为108CFU/ml的细菌培养液备用。

(2)样品准备和接种

新鲜草莓购于附近超市，去除蒂头后逐一称重，选取大小均一的草莓(7±0.3g/个)进行实验。将草莓浸泡于体积分数75％的酒精溶液中2分钟以杀灭表面微生物，取出后用无菌水反复冲洗，直至无酒精味后置于无菌烧杯中备用。

量取200ml细菌培养液倒至放置草莓的烧杯中，浸泡30分钟后将草莓取出置于无菌塑料盘上，于生物安全柜中静置30分钟以确保菌液接种至草莓表面。

(3)冷藏条件储藏

本实验选取冰箱冷藏温度4℃模拟草莓表面鼠伤寒沙门氏菌数量变化过程，储存时间考虑消费者日常储存草莓的平均最长时间，选取72小时为周期，每隔8小时取出2个草莓样品为平行试验，分别迅速转移至含有20ml生理盐水的均质袋中。整个实验重复3次，取3次实验平均值。

(4)微生物分析

用拍击式均质器拍打均质袋中的草莓1-2min，制成样品匀液，使用无菌枪头吸取1ml样品匀液加入9mL生理盐水试管稀释，漩涡混匀后制成1:10的样品匀液，再次稀释2次，制成1：100、1：1000的样品匀液，用无菌枪头吸取0.1mL不同稀释度样品匀液对号接种在10-1、10-2、10-3稀释度编号的XLD琼脂平板上(每个编号设三个重复)。将玻璃涂布棒用酒精灼烧，冷却后再用玻璃涂布棒将菌液在平板上均匀涂布，从低浓度向高浓度涂布，将涂布好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36±1℃培养24±2h后计数。

(5)模型建立

本研究中的细菌模拟生长条件较简单，仅考虑固定温度下的细菌数量变化，因此可考虑运用常用初级预测模型中的指数方程进行拟合，指数方程对数转换后即为线性方程。因此，可将细菌计数后进行对数转换，按照线性方程(1)计算细菌对数值变化量(Ygro)

Y_red＝log₁₀N_t-log₁₀N₀>

其中，Nt(CFU/g)为t时的细菌数，N0(CFU/g)为样品初始带菌量。

以线性模型进行生长曲线拟合，如方程(2)所示。

Y_red＝log₁₀N_t-log₁₀N₀＝c+d×t>

其中，t为细菌培养时间，c,d分别为线性方程参数。

(6)模型验证

相关系数(R2)及标准误平方根(RMSE)作为内验结果验证模型拟合度。另外，如方程(3)及(4)所示，再做4组验证实验结果用于计算Ross提出的偏差因子Bf及精确因子Af，用于模型外验结果[12]。

$>B_f={10}^{[\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\log \left(\frac{pred}{obs}\right)/n]}---\left(3\right)$>

$>A_f={10}^{\left[\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\right|\log \left(\frac{pred}{obs}\right)|/n]}---\left(4\right)$>

其中，n为实验组数，pred为线性方程预测得出细菌对数值变化量；obs为验证试验中细菌对数值变化量的观测值。Bf用于检验预测的准确度，若Bf>1，表示预测结果大于实际结果，反之亦然。Af用于检验预测的精确度，即预测值与观测值偏差的绝对值。

(7)数据分析

本研究中细菌的生长量以平均数及标准偏差的形式表示，以Microsoft Excel 2010(微软公司，雷德蒙，华盛顿州)进行数据处理。本研究以OriginPro 8.1软件(OriginLab，北安普敦，马萨诸塞州)中的线性拟合功能对数据进行拟合。

2、结果与讨论

(1)冷藏条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的死亡规律

对照试验显示草莓样品初始带菌量约为4.5log CFU/g。图1为草莓表面鼠伤寒沙门氏菌在冷藏储藏条件下的死亡曲线图，如图1所示，在72小时储藏时间内，草莓表面细菌减少量仅为1.8log CFU/g，六组实验数据的误差区间较大，细菌较少趋势十分平缓，但可以发现，随时间延长，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌死亡速率呈现线性规律。对比相关文献可发现，成熟草莓表面沙门氏菌在4℃下的死亡速率较慢，Nguyen等人[13]同样发现4℃情况下26小时内草莓表面沙门氏菌仅减少1log CFU/g，且细菌较少速率在储存后期趋于平缓。Hsu等人[14]也发现绿叶香菜表面沙门氏菌在冷藏温度下24天内的减少量仅为0.8log CFU/g。结合本研究结果，可看出冷藏温度下果蔬表面沙门氏菌的存活能力较强，尤其是成熟度较高的草莓样品。

利用线性方程拟合细菌对数值变化量(log Nt–logN0)与时间(t)关系，如图2所示，可观察到较为显著的线性关系。方程(5)为线性拟合结果，描述细菌对数值变化量与时间关系。方差分析结果如表1所示。模型的校正相关系数为0.93，残差平方和较低，表明模型预测值与实验数据偏差较小，可较好的拟合细菌减少量与时间关系。

Y_red＝log₁₀N_t-log₁₀N₀＝-0.220-0.012×t>

表1 死亡模型方差分析结果

(2)模型验证

同样条件下再做4组验证，将细菌对数值变化量的预测值与实际观测值比较，实验结果如表2所示。计算得出偏差因子为1.002，位于Ross提出的可接受范围0.9-1.05内。模型精度因子为1.13，表示预测值与观测值间仅误差13％。验证实验结果表明该线性方程可用于冷藏4℃条件下储藏72小时内草莓表面鼠伤寒沙门氏菌对数值变化量的预测。

表2 4组验证实验的观测值和模型预测值