一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯度康百汀

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯度康百汀。本发明提供的规模化生产康百汀的工艺中的种子培养基主要由白砂糖、甘油、KH

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯度康百汀。

背景技术

康百汀又称为美伐他汀，是一种真菌的次生代谢产物，属HMG-COA还原酶抑制剂，其作用是竞争性抑制HMG-CoA还原酶，该酶是胆固醇生物合成的限速酶。康百汀于1976年由AkiraEndo从真菌PenicilliumCitrinum发现，并于1976年由A.G.Brown从Penicillium brvicompactum中单独分离出来，其分子式为C₂₃H₂₄O₅，分子量为390.52。

康百汀可以有效的降低体内的胆固醇，其衍生物普伐他汀在降低胆固醇方面具有更强的药性。康百汀可以通过其结构某个特定碳的羟基化转化为普伐他汀，即康百汀可以作为普伐他汀生产的中间体或初始材料。作为普伐他汀的前体或原料，康百汀的质量和产量直接影响转化菌的转化效率和普伐他汀的纯度。因此，研究和开发高质量和产量的康百汀生产工艺是仍是目前研究的重点。

刘家勤发表了一篇题目为“美伐他汀摇瓶培养基的优化初探”的论文，该论文研究表明：当培养基的配方为葡萄糖66g/L、麦芽糖37g/L、豆粕15g/L、玉米浆13g/L、硫酸铵1.3g/L、甘油40g/L、聚氧化丙烯聚氧化乙烯甘油醚2.5g/L、饮用水适量时，发酵菌种的发酵单位可以提高75％。

徐蓉等发表了一篇题目为“桔青霉产美伐他汀发酵条件优化和小罐放大”的论文，该论文研究了不同碳、氮源，无机盐，初始pH值和接种量等因素对桔青霉HD-32-2产美伐他汀生产能力的影响，该论文着重对4种发酵培养基组分进行正交试验，形成最优的发酵培养基为葡萄糖80g/L、麦芽糖20g/L、黄豆饼粉11g/L和磷酸氢二钾5g/L，其余与初始培养基相同，优化后的发酵培养比初始培养的发酵水平提高了3倍。

李敏发表了一篇题目为“美伐他汀提取工艺研究”的论文，该论文公开了干法和湿法浸提两种美伐他汀的提取工艺。干法提取美伐他汀的步骤为发酵液用稀酸处理后过滤，湿菌丝通过气流干燥，干燥方式有进风140℃气流干燥、进风80℃气流干燥和进风160℃闪蒸三种，美伐他汀的环化在气流干燥的同时完成，干燥后的菌渣(含水量低于5％)用于萃取等后续的工艺。干法提取美伐他汀所获得的美伐他汀粗品收率仅为60％。而湿法浸提提取 美伐他汀的步骤为发酵液中的菌丝经过滤得到后，用乙酸丁酯，浸提4小时，浸提比例为1∶7；第二次浸提时间为2小时，物料比为1∶4；提取浓缩液真空减压蒸馏的方式进行，生产过程中适宜的闭环温度为70-80℃，时间为6小时。通过实验确定浸提的最佳溶剂、最佳条件，所获得的美伐他汀粗品收率为70％。

因此，研究和开发高产量和高纯度、适合规模化生产的康百汀生产工艺仍是目前研究的重点。

发明内容

为了解决现有技术中康百汀生产工艺存在的不足，本发明的目的在于提供一种生产成本低、高产量、高纯度和适合规模化生产的一种规模化生产康百汀的工艺，以解决上述缺陷。

本发明提供了一种规模化生产康百汀的工艺，包括以下步骤：

S1将纯种桔青霉接种于种子培养基中进行种子培养，然后接种在发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；

S2往步骤S1中得到的发酵液中加入上述发酵液总重量2-8％的硅藻土，过滤，收集滤饼；加入上述滤饼6-10倍量的乙酸丁酯在30-50℃下萃取，过滤，得滤液；

S3往步骤S2得到的滤液中加入上述滤液重量1-3倍活性炭，搅拌1-2h，过滤，将滤液加热至90-120℃，反应6-12h后，将滤液在40-80℃下真空浓缩体积至1/4-3/4后，温度降至5-10℃结晶6-10h，过滤，将晶体在60-70℃下干燥至干燥失重≤1％，得康百汀粗品；

S4往步骤S3得到的康百汀粗品中加入上述康百汀粗品2-4倍的丙酮溶液溶解，活性炭脱色，降温结晶，即得；

所述种子培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油30-50g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>

所述发酵培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油30-40g/L、黄豆粉5-10g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>

进一步地，所述种子培养基主要由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂P0₄1.3g/L、MgSO₄·7H₂O>

进一步地，所述发酵培养基主要由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>

进一步地，所述种子培养基中维生素溶液由生素B₁>2>

进一步地，所述种子培养基中维生素溶液由生素B₁>2>

进一步地，所述发酵培养基中植物提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积比3-6∶1-2组成。

进一步地，所述发酵培养基中植物提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积比4∶1组成。

进一步地，所述种子培养条件为：温度为26±1℃，压强为0.04-1.08MPa，空气流量为0.4-1.1vvm，搅拌转速为80-120rpm，培养周期为60±3h。

进一步地，所述发酵培养基的培养条件为：温度为26±2℃，压强为0.04-1.08MPa，空气流量为0.6-1.2vvm，搅拌转速为150-250rpm，发酵生产周期为200-300h。

另外，本发明还提供了所述的规模化生产康百汀的工艺获得的高纯度康百汀。

本发明提供的桔青霉购于成都摩尔生物医药有限公司。本发明提供的小槐花提取液的制备工艺为：将小槐花洗净，加入上述小槐花重量比4-6倍的水，加热提取2-3次，每次1-2h，过滤，合并滤液，即得。本发明提供的余甘子提取液的制备工艺为：将余甘子洗净，粉碎，加入上述粗粉4-6倍的水，加热提取3-4次，每次2-3h，过滤，合并滤液，即得。

本发明提供的种子培养基和发酵培养基可以有效的增强桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率。经试验发现，本发明实施例1-3组康百汀的平均产量为10.67mg，其平均产量与对照组相比提高了96.5％，实施例1-3组康百汀的平均比生产率为28.5％，其平均比生产率与对照组相比提高了100.7％，而对比例1-4组的康百汀的平均产量均比本发明实施例1-3组的产量低，说明本发明提供的维生素溶液和由小槐花提取液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液均可有效增强桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率，可以有效的提高康百汀的产量。

本发明提供的发酵培养基中植物提取液还可以降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度。经试验发现，本发明实施例1-3组的康百汀平均纯度为99.3％，其平均纯度与对照组相比提高了2.16％；实施例1-3组康百汀的平均总杂质含量为0.35％，其平均杂质含量与对照组相比降低了71.54％。而对比例2-4组的康百汀平均纯度比本发明实施例1-3组低，平均总杂质含量比本发明实施例1-3组高，说明本发明提供的由小槐花提取液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液可以有效的降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度。

本发明提供的规模化生产康百汀的工艺中的培养基可以有效的增强桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率，从而提高康百汀的产量，同时还可以降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度，是一种生产成本低、高产量、高纯度和适合规模化生产的康百汀生产工艺。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：

(1)本发明提供的种子培养基和发酵培养基可以有效的提高桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率，可以有效的提高康百汀的产量；

(2)本发明提供的发酵培养基可以降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度，更有利于产业化生产。

具体实施方式：

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖45g/L、甘油30g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖45g/L、甘油30g/L、黄豆粉5g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺：

S1将桔青霉接种在上述种子培养基中进行种子培养，所述培养条件为：温度为26℃，压强为0.04MPa，空气流量为0.5vvm，搅拌转速为100rpm，培养周期为62h；然后接种于上述发酵培养基中进行发酵培养，所述培养条件为：温度为28℃，压强为0.06MPa，空气流量为0.8vvm，搅拌转速为200rpm，发酵生产周期为250h，得发酵液；

S2往步骤S1中得到的发酵液中加入上述发酵液总重量5％的硅藻土，过滤，收集滤饼；加入上述滤饼8倍量的乙酸丁酯在45℃下萃取，过滤，得滤液；

S3往步骤S2得到的滤液中加入上述滤液重量2倍活性炭，搅拌2h，过滤，将滤液加热至100℃，反应8h后，将滤液在60℃下真空浓缩体积至1/4，温度降至8℃结晶8h，过滤，将晶体在65℃下干燥至干燥失重≤1％，得康百汀粗品；

S4往步骤S3得到的康百汀粗品中加入上述康百汀粗品4倍的丙酮溶液溶解，活性炭脱色，降温结晶，即得。

实施例2、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

实施例3、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖55g/L、甘油50g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖55g/L、甘油40g/L、黄豆粉10g/L、KH₂PO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

对比例1、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

与实施例2的区别在于，维生素溶液中没有添加维生素C，增加维生素B₁和维生素B₂的含量。

对比例2、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

与实施例2的区别在于，植物提取液为小槐花提取液。

对比例3、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

与实施例2的区别在于，植物提取液为余甘子提取液。

对比例4、

所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH₂PO₄>4·7H₂O>1>2>

所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O>

所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。

与实施例2的区别在于，所述植物提取液中小槐花提取液和余甘子提取液的体积比为1∶1。

试验例一、康百汀的产量检测试验

1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子培养基和发酵培养基。

2、试验方法：

将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子培养基和发酵培养基，分别设置实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组和对比例4组，其中以种子培养基不加维生素溶液、发酵培养基不加植物提取液的实施例2制备的种子培养基和发酵培养基作为对照组，将不同组的培养基在同一条件下制备康百汀，采用15L发酵罐，装液量7L，菌丝接种体积分数为10％，

每12h取样分析。

测定康百汀的生物量和产物量，计算康百汀的比生长率。其中：生物量测定：采用菌丝干重法，取20ml发酵液离心后收集菌体至滤纸上，80℃烘至恒重称量；产物量的测定：采用高效液相色谱法(HPLC)法测定，比生产率是指单位菌体生产的产物量，比生产率＝产物量/生物量。

3、试验结果

试验结果如表1所示。

表1康百汀的产量检测试验

由表1可知，本发明实施例1-3组康百汀的平均产量为10.67mg/ml，其平均产量与对照组相比提高了96.5％，实施例1-3组康百汀的平均比生产率为28.5％，其平均比生产率与对照组相比提高了100.7％，其中实施例2为最佳实施例。而对比例1-4组的康百汀的平均产量均比本发明实施例1-3组的产量低，说明本发明提供的维生素溶液和由小槐花提取液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液均可有效的增强桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率，可以有效的提高康百汀的产量。

试验例二、康百汀的质量检测试验

1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子培养基和发酵培养基。

2、试验方法：

将实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子培养基和发酵培养基，分别设置实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例2组、对比例3组和对比例4组，其中以发酵培养基不加植物提取液的实施例2制备的种子培养基和发酵培养基作为对照组。将不同组的培养基在同一条件下制备康百汀，采用高效液相色谱法(HPLC)法测定康百汀的纯度和杂质含量。

3、试验结果

试验结果如表2所示。

表2康百汀的质量检测试验

由表2可知，本发明实施例1-3组的康百汀平均纯度为99.3％，其平均纯度与对照组相比提高了2.16％；实施例1-3组康百汀的平均总杂质含量为0.35％，其平均杂质含量与对照组相比降低了71.54％，其中实施例2为最佳实施例。而对比例2-4组的康百汀平均纯度比本发明实施例1-3组低，平均总杂质含量比本发明实施例1-3组高，说明本发明提供的由小槐花提取液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液可以有效的降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度。