一种基于固态双凝胶的微生物三维群落结构分析芯片及应用

摘要

本发明提供了一种用于微生物三维群落结构分析和种间通讯研究的微流控芯片。该芯片为双层结构，采用塑模法制备，下层主要由液体注入孔、用于第一次包裹的微管道和用于第二次包裹的宽管道构成；上层含有微阀门，可以对位于下层的芯片管道进行开闭控制。本发明通过两种固态凝胶对三种不同的微生物进行双重包裹，形成固态微生物三维空间结构。通过改变芯片进液流速，可以对固态凝胶微球的堆积包裹方式进行改变，从而能够方便地对不同种微生物之间的三维空间距离进行调节。

说明书

技术领域

本发明属于环境生物学分析领域，具体涉及一种通过两种多孔固态凝胶对微生物进行双重包裹，从而建立固态微生物三维群落结构的微流控芯片。

背景技术

微生物在自然界中以群落的形式生存，群落内的不同种微生物通过种间相互作用进行信息的传递，并通过对不同底物的代谢过程行使生物学功能。环境微生物群落的种群结构、多样性和群落功能始终处于动态变化中，对环境生态系统的平衡起着至关重要的作用。

近年来，利用生物相容性材料对微生物种群进行三维培养成为环境微生物学领域的研究热点之一，该方法可以将多种具有不同代谢途径、功能的微生物“组装”在一起进行培养，从而体现其协同代谢作用，模拟环境中真实的微生物协同生活、代谢作用。例如将几种分泌不同酶和底物的微生物进行三维培养，构成模拟生物群落，其分泌物通过酶促反应生产具有一定环境学功能的产物，这种三维模拟生物群落分析方法也成为很多药物或环境毒理分析的新的研究平台。但是，现有的微生物三维结构建立方法存在很多问题，例如常用的水凝胶空间支持结构的建立成本较高，步骤繁琐，凝胶孔径较小不利于微生物间信息传递，而且无法按照需要对微生物群落间的物理距离进行改变，此外自动化操作的缺失使得误差极大，重复性差，这些缺陷都亟待新的技术方法加以解决。

微流控芯片技术在环境生物学领域发展迅速，利用已成熟的芯片加工制造方法，以及微液滴(Droplet)技术，可以在芯片内构建微生物培养腔，并将单个微生物包裹在直径为20-200μm的微球内，从而对单个微生物实现 精确操控和生长代谢分析。微生物在具有多孔结构的微球内部，仍可以接触和吸收外界的环境刺激因子、细胞因子和营养物质等。此外，固态凝胶为疏松多孔结构，可以提供微生物生长所需空间，因此该方法能够保证微生物的正常生长和代谢。基于该技术原理的微流控芯片研究平台能够突破很多技术瓶颈，此外，在微流控芯片内进行微生物的培养和操控，可以有效避免外界污染，芯片的自动化控制也使得对微小的微生物操控更加精确。

目前，利用固态凝胶对环境微生物进行二次固态包裹从而构建芯片内的三维微生物群落的研究尚处于空白。本发明的微流控芯片可以自动化控制微生物的包裹、培养以及芯片内三维群落的形成和分析，能够模拟自然环境中真实的微生物三维群落状态，对环境生物学研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种可以对三种微生物进行两次固态凝胶包裹，形成固态三维空间结构，可用于微生物三维群落结构分析和微生物种间通讯研究的微流控芯片。

本发明的技术方案为：

一种基于固态双凝胶的微生物三维群落结构分析芯片,该微生物三维群落结构分析芯片为双层结构，包括管道流通层12和微阀门层11；在功能上分为凝胶微球包裹单元、凝胶微球堆积单元和固态凝胶二次包裹单元。

所述的微阀门层11包括含有气压控制的微阀门5和阀门管道，微阀门5对芯片管道流通层中的管道进行开启或闭合控制。

所述的管道流通层12包括三种微生物与低熔点液态琼脂糖凝胶的混合液注入孔1、2、3，硅与表面活性剂的注入孔4，液态海藻糖凝胶的注入孔6，氯化钙溶液的注入孔7，硅油及表面活性剂的注入孔8，固态微生物三维 群落凝胶的收集孔9，用于液体流通和凝胶微球包裹的微管道，以及用于凝胶微球堆积和固态凝胶二次包裹的宽管道。所述的芯片内的微管道深度为40～60.0μm，宽度为40～50μm，为光滑平直的凹槽；宽管道的深度为40～60.0μm，宽度为600～800μm。

所述的微生物三维群落结构分析芯片的材料为光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。

所述的微生物三维群落结构分析芯片的液体流通层12和微阀门层11分别经过365nm紫外光照射10～20分钟，等离子体处理2～5分钟后，再通过对接实现不可逆的封接键合。

采用上述微生物三维群落结构分析芯片构建并收集微生物固态三维凝胶结构，具体包括以下步骤：

(1)将三种不同的微生物分别与加热至41℃的液态的低熔点琼脂糖凝胶及液体培养基混合后，分别通过混合液注入孔1、2、3注入微管道，同时以与混合液相同的进液速度将硅及表面活性剂的混合液通过注入孔4注入微管道，在硅及表面活性剂混合液的作用下形成包含三种微生物的琼脂糖凝胶微液滴。闭合微阀门5使宽管道处于关闭状态，位于宽管道内的琼脂糖凝胶微液滴被微阀门阻挡、截留；堆积的琼脂糖凝胶微液滴经室温静置后凝固为琼脂糖凝胶微球，实现对三种微生物的一次固态包裹。所述的低熔点琼脂糖凝胶在高温时为液态，在温度降至室温时凝固成多孔凝胶态。

(2)开启微阀门5，通过注入孔6注入海藻糖凝胶溶液，使其充满琼脂糖凝胶微球之间的间隙空间。通过注入孔7注入氯化钙溶液，在氯化钙溶液的作用下使海藻糖凝胶固化并形成多孔胶状固态结构，从而将含有微生物的琼脂糖凝胶微球固定于所在的三维空间位置，形成海藻糖凝胶包裹形成三 维堆积结构的固态微生物凝胶微球10，实现对三种微生物的二次固态包裹。

(3)通过收集孔9收集固态微生物凝胶微球，并置于培养液中，培养液可通过两种固态凝胶的多孔结构渗透进入三维凝胶内部，对包裹其中的微生物进行三维培养，通过添加荧光染料可以用于微生物三维群落结构和群落种间通讯研究。

本发明通过改变芯片进液流速以及对凝胶微球的堆积包裹方式进行改变，可以调节不同种微生物之间的三维空间距离。

本发明的有益效果：本发明提供的微流控芯片可以显著降低微生物、试剂和培养液的消耗量；芯片内的微阀门可由电脑控制系统进行精确操控。在芯片内通过两种不同的多孔固态凝胶对三种微生物进行双重包裹，可以模拟自然界中微生物三维结构生长的真实状态，可用于对微生物三维群落结构和种间通讯的研究。

附图说明

图1为本发明的微流控芯片设计图。

图2为芯片内固态凝胶包裹形成微生物三维群落示意图。

图3为芯片管道横截面示意图。

图中:1-3混合液注入孔；4注入孔；5微阀门；6注入孔；7注入孔；8注入孔；9收集孔；10固态微生物凝胶微球；11阀门层；12管道流通层。

具体实施方式

图1所示为用于微生物三维群落结构及种间通讯分析的微流控芯片结构图。通过向1号、2号和3号微孔内分别向微流控芯片的微管道内注入含有三种不同微生物的低熔点琼脂糖凝胶混合液，同时以等速通过4号微孔注入硅油及表面活性剂，可在微管道内形成分别包裹三种微生物的液态琼脂糖 凝胶微液滴。而后，向5号微孔中增加气压(不超过15psi)，使芯片阀门层中的微阀门处于闭合状态，位于宽管道内的琼脂糖凝胶微液滴被微阀门所阻挡、截留。堆积的琼脂糖凝胶微液滴经室温静置后，固化为疏松的多孔固态琼脂糖凝胶微球，将微生物包裹在微球内，实现对三种微生物的一次固态包裹。重新开启微阀门，经由6号孔向芯片内注入液态海藻糖凝胶溶液，使其充满琼脂糖凝胶微球之间的间隙空间。再通过7号孔注入氯化钙溶液与宽管道内的液态海藻糖凝胶溶液相混合，同时通过8号孔注入硅及表面活性剂混合液，在芯片宽管道内形成液态海藻糖凝胶液段，在氯化钙作用下包裹琼脂糖凝胶微球的海藻糖凝胶将固化为疏松多孔的固态结构，形成固态维结构，实现对三种微生物的二次固态包裹。

通过9号孔收集含有三种微生物的固态凝胶并置于培养液中，培养液可通过两种固态凝胶的多孔结构渗透进入三维凝胶的内部，对包裹其中的微生物进行三维培养，通过添加荧光染料可进行微生物三维群落结构分析和群落种间通讯的研究。

芯片管道和微阀门均采用PDMS为材料制备，制备方法为：

(1)硅片制备：利用Prianha溶液煮沸清洗单晶硅片30～60分钟，经氮气吹干后，将负光刻胶倾倒在硅片表面，在旋涂机上进行甩涂，80℃烘焙40～60分钟固化；

(2)微阀门模具制备：将正光刻胶倾倒在硅片表面，在旋涂机上甩涂，转速为2000转/分钟，115℃烘焙10～20分钟固化后缓慢冷却至室温；

(3)紫外曝光：在甩涂后的硅片表面放置带有液体流通管道和微阀门结构的掩膜板，利用紫外曝光机进行365nm紫外照射处理3～5分钟；

(4)硅片显影：利用显影液对曝光后的单晶硅片进行清洗显影10～30 分钟，利用异丙醇溶液清洗硅片表面，氮气吹干；

(5)芯片浇注：将聚二甲基硅氧烷的单体和固化剂按体积比5:1和20:1混合，分别倾倒在管道流通层和微阀门层硅片模具上，80℃烘焙40～60分钟使其固化；

(6)芯片封接：将固化后的PDMS与硅片模具剥离并打孔后，利用氧离子体处理管道流通层和微阀门层PDMS芯片的表面2～5分钟后，将两层芯片对接键合，80℃烘焙8～12小时，完成芯片构建。