一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒及其制备方法和应用、一种载药纳米粒子

摘要

本发明公开了一种海藻酸钠‑植物甾醇‑乳糖酸靶向纳米粒及其制备方法和应用、一种载药纳米粒子，此靶向纳米粒以植物甾醇作为载体的基本骨架，植物甾醇作为疏水配基，构建两亲性的抗肿瘤药物载体‑海藻酸钠‑植物甾醇纳米粒，同时将乳糖酸通过酯化作用连接在纳米粒上，作为具有靶向作用的信号分子。该靶向纳米粒能够包载治疗肿瘤的药物形成载药纳米粒子，并将其靶向输送到肝癌细胞中，增加肝癌组织和细胞中的药物浓度，减少药物对正常组织的损害，提高药物的利用率，从而达到更好的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒及其制备方法和应用及一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒包载盐酸多柔比星制成的载药纳米粒子。

背景技术

癌症是世界上死亡率极高的一种疾病，其中肝癌被称为“癌中之王”，据不完全统计，全世界每年有超过700000人被诊断为肝癌患者，大约有600000人死于肝癌，我国的肝癌发病人数约占全球的55％，每年的死亡率达20.4/10万。肝癌组织和细胞不规则的脉管系统，组织间液高压等构成肝癌复杂的生理屏障，传统的抗癌药物由于药物的分子量低，在体内容易扩散，对肝癌细胞的选择性差，因此在杀死肝癌细胞的同时也对正常的组织和细胞产生毒副作用。同时在体内是非特异性分布，经代谢等步骤过程后，只有少部分药物进入肝靶向细胞。

因此，开发一种具有肝靶向功能的纳米药物载体十分有必要，目前公认的纳米药物载体包括脂质体、脂质微粒、纳米囊和纳米球以及聚合物胶束等。其中，脂质体因具有良好的组织相容性、安全性、靶向性、缓释性、实用性等特点而倍受关注，据不完全统计，已经有16个脂质体药物成功上市。

近年来，科学家在对原有的处方工艺技术的不断改良下，已获得长循环脂质体、免疫脂质体、温度敏感脂质体等。但是针对脂质体的不稳定性、包封率低等缺点，近年来针对纳米药物载体的研究已经向低毒、低免疫性、高包封率、高稳定性等的纳米球发展，此类的研究具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒，此靶向纳米粒以植物甾醇作为载体的基本骨架，植物甾醇作为疏水配基，构建两亲性的抗肿瘤药物载体-海藻酸钠-植物甾醇纳米粒，同时将乳糖酸通过酯化作用连接在纳米粒上，作为具有靶向作用的信号分子。

本发明还提供了一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的制备方法，该制备方法步骤简单。

本发明还提供了海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒在制备具有肝靶向功能的纳米药物载体中的应用，可定向的将抗肿瘤的药物输送到肝癌细胞中，从而达到更好的治疗效果。

本发明还提供了一种载药纳米粒子，通过海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒采用物理渗透的方法包载盐酸多柔比星制得。

本发明采取的技术方案为：

一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒，海藻酸钠作为载体的基本骨架，植物甾醇作为疏水配基，乳糖酸作为具有靶向作用的信号分子，三者通过酯键连接，并在水中超声自组装成核壳式纳米颗粒。

本发明还提供了上述海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(a)通过二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶介导的酯化反应将植物甾醇连到海藻酸钠上，形成海藻酸钠-植物甾醇聚合物；

(b)将乳糖酸活化，然后与海藻酸钠-植物甾醇进行聚合物反应，制备连有乳糖酸的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子；

(c)将海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子在水中超声自组装成核壳式纳米颗粒。

步骤(a)中，所述海藻酸钠、植物甾醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：(1～2)：(0.2～0.22)：(0.1～0.12)。

所述步骤(a)进一步包括：在25～30℃反应24～48小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，形成海藻酸钠-植物甾醇聚合物。

所述步骤(b)具体包括：先将乳糖酸在碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶作用下活化，然后与海藻酸钠-植物甾醇进行聚合物反应。

所述海藻酸钠-植物甾醇聚合物和乳糖酸质量之比为(1.5～2.0)：1。

所述乳糖酸、碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：(0.2～0.22)：(0.1～0.12)。

所述聚合反应的温度为25～30℃，时间为24～48小时。

所述聚合反应后进一步包括使用透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子。

所述步骤(c)具体包括：海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子溶于水，36～38℃下超声震荡40～55小时，自组装成具有靶向功能的核壳式纳米颗粒。

本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒在制备具有肝靶向功能的纳米药物载体中的应用。

本发明还提供了一种载药纳米粒子，所述载药纳米粒子由海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒采用物理渗透的方法包载盐酸多柔比星制得。

所述载药纳米粒子的制备方法包括以下步骤：盐酸多柔比星溶于二甲基乙酰胺溶液，加入三乙胺，盐酸多柔比星与三乙胺的物质的量之比为1：(3.0～3.9)，然后将其与海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒在避光条件下反应，反应结束后，经pH＝7.4，1/15mol/L、20～30℃的磷酸缓冲液透析，再经微孔滤膜过滤、冻干，即可制得载药纳米粒子。

所述盐酸多柔比星在二甲基乙酰胺溶液中的浓度为1.0～1.1mol/L。

所述盐酸多柔比星与所述海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳粒子的质量之比为(1.5～3.0)：1。

所述避光条件下反应的反应温度为4℃，时间为36～72小时。

所述微孔滤膜的孔径为1.0um。

所述透析所用透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子。

与现有技术相比，本发明通过自组装的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸的纳米药物载体作为肝靶向药物载体，能够将抗癌药物靶向的输送到肝癌细胞中，增加肝癌组织和细胞中的药物浓度，减少药物对正常组织的损害，提高药物的利用率。具有安全性、有效性、靶向性等，为将来其作为一种新型药物载体应用于临床提供理论基础。

附图说明

图1为海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的透射电镜图；

图2为海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒子的粒径分布图；

图3为载药纳米粒子在不同PH值环境下，其药物释放量与时间的关系图；

图4为盐酸多柔比星、载药纳米粒子一和载药纳米粒子二与HepG2细胞作用后的体外细胞实验图，图中DOX.HCl为盐酸多柔比星；PA/DOX为载药纳米粒子二；GPA/DOX为载药纳米粒子一。

具体实施方式

实施例1

一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(a)海藻酸钠-植物甾醇合成：通过二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)介导的酯化反应将植物甾醇连到海藻酸钠上，海藻酸钠、植物甾醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：1：0.2：0.1，在30℃反应24小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，形成海藻酸钠-植物甾醇聚合物。

(b)海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸的制备：先将乳糖酸在碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)下活化，然后与海藻酸钠-植物甾醇聚合物反应，海藻酸钠-植物甾醇聚合物和乳糖酸质量之比为1.5：1，乳糖酸、碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：0.2：0.1，在25℃反应48小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，制备连有乳糖酸的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子。

(c)上述两种聚合物溶于水，在37℃下超声震荡48小时。两种聚合物分子分别自组装形成非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒和海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒。

实施例2

一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(a)海藻酸钠-植物甾醇合成：通过二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)介导的酯化反应将植物甾醇连到海藻酸钠上，海藻酸钠、植物甾醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：1.5：0.21：0.11，在28℃反应32小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截 留分子量为8000～14000的大分子，形成海藻酸钠-植物甾醇聚合物。

(b)海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸的制备：先将乳糖酸在碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)下活化，然后与海藻酸钠-植物甾醇聚合物反应，海藻酸钠-植物甾醇聚合物和乳糖酸质量之比为1.8：1，乳糖酸、碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：0.21：0.11，在28℃反应35小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，制备连有乳糖酸的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子。

(c)上述两种聚合物溶于水，在36℃下超声震荡55小时。两种聚合物分子分别自组装形成非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒和海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒。

实施例3

一种海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(a)海藻酸钠-植物甾醇合成：通过二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)介导的酯化反应将植物甾醇连到海藻酸钠上，海藻酸钠、植物甾醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：2：0.22：0.12，在25℃反应48小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，形成海藻酸钠-植物甾醇聚合物。

(b)海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸的制备：先将乳糖酸在碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)下活化，然后与海藻酸钠-植物甾醇聚合物反应，海藻酸钠-植物甾醇聚合物和乳糖酸质量之比为2.0：1，乳糖酸、碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲基氨基吡啶之间的物质的量之比为1：0.22：0.12，在30℃反应24小时，通过透析袋透析3次，所述透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，制备连有乳糖酸的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸聚合物分子。

(c)上述两种聚合物溶于水，在38℃下超声震荡40小时。两种聚合物分子分别自组装形成非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒和海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒。

实施例4

一种载药纳米粒子，所述载药纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

采用物理渗透的方法进行包载。将盐酸多柔比星溶于二甲基乙酰胺(DMAC)，加入三乙胺，盐酸多柔比星与三乙胺的物质的量之比为1：3，盐酸多柔比星在DMAC中的浓度为1.0mol/L，然后将其与实施例1制备得到的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒，4℃条件下避光反应48小时，盐酸多柔比星与海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳粒子的质量之比为1.5：1。

在pH＝7.4，1/15M的磷酸缓冲液中透析3天，所用透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，并每隔4小时换一次新鲜介质，最后将所得的溶液经1.0um微孔滤膜过滤、冻干，即可得到包载有药物的载药纳米粒子一。

采用与上述相同的方法，只是将海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒替换为非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒，制得包载有药物的载药纳米粒子二。

实施例5

一种载药纳米粒子，所述载药纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

采用物理渗透的方法进行包载。将盐酸多柔比星溶于二甲基乙酰胺(DMAC)，加入三乙胺，盐酸多柔比星与三乙胺的物质的量之比为1：3.5，盐酸多柔比星在DMAC中的浓度为1.0mol/L，然后将其与实施例2制备得到的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒，4℃条件下避光反应60小时，盐酸多柔比星与海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳粒子的质量之比为2.0：1。

在pH＝7.4，1/15M的磷酸缓冲液中透析3天，所用透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，并每隔4小时换一次新鲜介质，最后将所得的溶液经1.0um微孔滤膜过滤、冻干，即可得到包载有药物的载药纳米粒子一。

采用与上述相同的方法，只是将海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒替换为非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒，制得包载有药物的载药纳米粒子二。

实施例6

一种载药纳米粒子，所述载药纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

采用物理渗透的方法进行包载。将盐酸多柔比星溶于二甲基乙酰胺(DMAC)，加入三乙胺，盐酸多柔比星与三乙胺的物质的量之比为1：3.9，盐酸多柔比星在DMAC中的浓度为1.1mol/L，然后将其与实施例3制备得到的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒，4℃条件下避光反应72小时，盐酸多柔比星与海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳粒子的质量之比为3.0：1。

在pH＝7.4，1/15M的磷酸缓冲液中透析3天，所用透析袋能够截留分子量为8000～14000的大分子，并每隔4小时换一次新鲜介质，最后将所得的溶液经1.0um微孔滤膜过滤、冻干，即可得到包载有药物的载药纳米粒子一。

采用与上述相同的方法，只是将海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒替换为非靶向功能的海藻酸钠-植物甾醇纳米粒，制得包载有药物的载药纳米粒子二。

实施例7

海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸的表征及载药纳米粒的载药、释药性能测试

1.透射电镜检测纳米载体的大小及形态

将实施例1制备得到的海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒溶液滴于载有碳膜的铜网上，用滤纸吸干表面液体，用pH＝6.0的2％磷钨酸负染，25-32℃自然干燥后在透射电镜下对纳米粒的形态进行观察，结果如图1所示，利用激光动态光散射仪对海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的粒径分布进行观察， 结果如图2所示。

使用实施例4制得的载药纳米粒子一和载药纳米粒子二进行以下实验：

2.载药纳米粒的体外释放测试

采用不同pH值的PBS缓冲液作为释放介质，pH值分别为7.4、6.5和5.5，探究载药纳米粒子一在不同环境下的药物释放效率。如图3所示，比较发现，在低pH值的环境下载药纳米粒子一的释放效率更高，大多数肿瘤组织的pH比正常组织低，约为5.0-6.0之间，可以说明肿瘤组织更能有效的促进载药纳米粒子一中药物的释放。

3.体外细胞毒实验

此实验采用的是肝癌细胞膜表面特异的脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)过表达的HepG2细胞。

取对数生长期HepG2细胞，调整浓度为1×10⁴/ml，接种于96孔板。分别将含有相同药物浓度的游离盐酸多柔比星、载药纳米粒子一和载药纳米粒子二与HepG2细胞作用24、48、72h，取出培养板，每孔加入CCK8>

4.激光共聚焦实验

此实验采用的是肝癌细胞膜表面特异的脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)过表达的HepG2细胞。

细胞培养基中加入含有相同药物浓度的游离的盐酸多柔比星、载药纳米粒子一和载药纳米粒子二，在激光共聚焦显微镜下，观察HepG2细胞中盐酸多柔比星的分布情况。实验结果是，加入游离盐酸多柔比星的细胞，药物只要分布于细胞核中；加入载药纳米粒子一和载药纳米粒子二的细胞，药物主要分布在细胞膜上，且加入载药纳米粒子一的细胞荧光强度比不连接乳糖酸的载体的荧光强度要强。该结果表明，细胞对三种药物的摄取方式存在差异，更进一步表明了海藻酸钠-植物甾醇-乳糖酸靶向纳米粒的靶向功能。