基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于聚氨基酸的纳米粒子的制备方法。首先以疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯为原料，反应得到对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子；然后以对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物，反应制备疏水性胺基化合物；再以疏水性胺基化合物作为引发剂，开环聚合α‑氨基酸‑N‑羧基内酸酐化合物得到基于聚氨基酸的聚合物；最后将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后加入聚合物的丙酮溶液，搅拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。得到的载药靶向纳米粒子具有很高的稳定性，其可以与靶向分子结合很好地富集到肿瘤部位，并对包括人乳腺癌在内的多种固体肿瘤具有很好地治疗作用和低的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚合物粒子，具体涉及一种基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法。

背景技术

聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA）是一种FDA批准的生物可降解聚合物，被广泛地应用于手术缝合线、组织工程支架、药物控制释放载体等生物医用领域。基于PLGA的生物可降解纳米粒子和微米粒子已成为实现药物靶向长效治疗的最重要载体之一。例如，多种包载蛋白药物和多肽药物的PLGA微球如Depot^®，Decapeptyl^®，Somatulline^®，Nutropin^®，Depot^®，已被临床用于治疗前列腺癌、肢端肥大症、生长激素缺乏症。PLGA纳米粒子和微米粒子通常是用乳化-溶剂挥发法或纳米沉淀法制备，这通常要用表面活性剂来稳定分散的小液滴，减小表面张力和防止絮积。聚乙烯醇（PVA）、泊洛沙姆（poloxamer）和聚丙烯吡咯烷酮（PVP））等表面活性剂因具有在水溶液中粘度高，能很好地吸附在分散小液滴的表面等优点而成为制备PLGA纳米粒子和微米粒子最常用的表面活性剂。但这些表面活性剂存在不能生物降解、体内存在潜在的毒性、缺少功能基团等缺点。例如，PVA不仅可能致癌，而且动物实验发现皮下或静脉注射PVA会导致高血压、器官损伤、贫血、中枢神经抑制等问题（J.>

最近，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）作为一种生物相容性表面活性剂被广泛用于纳米粒子制备（Biomaterials 33; 4889-4906, 2012）。例如，用TPGS制备得到了一系列包裹紫杉醇等药物的PLGA、聚乳酸（PLA）、聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）纳米粒子；这些纳米粒子的粒径可控制在200-800nm之间。与传统PVA乳化剂相比，TPGS展现出了更好的乳化效果和包载效率。研究还发现TPGS乳化剂能通过抑制肿瘤细胞表面P-糖蛋白功能来阻止抗癌化疗药物被细胞泵出，从而大大增强抗癌药物（阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇等）对耐药肿瘤细胞的毒性。而且，TPGS还被发现本身就有抗癌活性，能抑制移植在裸鼠身上的人肺癌细胞的生长。但用TPGS乳化的PLGA等纳米微球通常稳定性较低，而且表面很难进行功能化。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于聚氨基酸的纳米粒子，可用来作为纳米药物载体。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

（1）以疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯为原料，在无水二氯甲烷和吡啶中，反应得到对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子；然后以对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物，在无水二氯甲烷和吡啶中，反应制备疏水性胺基化合物；

（2）以疏水性胺基化合物作为引发剂，开环聚合α-氨基酸-N-羧基内酸酐化合物得到基于聚氨基酸的聚合物；所述α-氨基酸-N-羧基内酸酐化合物为γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基内酸酐；

（3）将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙酮溶液，搅拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。

上述技术方案中，步骤（1）中，疏水性羟基化合物包括维他命E、胆固醇、香豆素、胆酸、喜树碱、伊立替康；二胺化合物选自以下化合物中的一种：乙二胺、丁二胺、辛二胺、赖氨酸甲酯、赖氨酸乙酯、鸟氨酸甲酯、鸟氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺；步骤（1）中，疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩尔比为1∶2∶5；对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、乙二胺和吡啶的摩尔比为1∶20∶20。

上述技术方案中，步骤（1）中，制备对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子时，在0℃度条件下滴加对硝基苯基氯甲酸酯，再在30℃反应24小时；制备疏水性胺基化合物时，反应温度为室温，时间为24小时。

上述技术方案中，步骤（2）中，疏水性胺基化合物、α-氨基酸-N-羧基内酸酐化合物的摩尔比为1∶3～25；疏水性胺基化合物的分子量大于240；步骤（2）中，制备基于聚氨基酸的聚合物时，反应温度是25～50℃，反应时间为12～72小时。

上述技术方案中，步骤（3）中，将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后在EDC/NHS催化条件下，与短肽、单糖、叶酸、生物素或者抗体分子反应，制得含靶向分子表面活性剂；然后含靶向分子表面活性剂中逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙酮溶液，得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子；步骤（3）中，在室温下搅拌挥发除去有机溶剂，离心收集得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。

本发明公开的基于聚氨基酸的聚合物的化和结构式可以为：

，

，。

疏水功能小分子R₁作为憎水的头，水溶的聚（γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸）和聚（β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸）的聚氨基酸链段作为亲水的尾巴，其中x为2～5，n为3～20；R₁分子量大于240>

疏水性羟基化合物包括维他命E、胆固醇、香豆素、胆酸、喜树碱、伊立替康等，其结构式如下：

，，，， ，等；

二胺化合物结构为，选自以下化合物中的一种：乙二胺、丁二胺、辛二胺、赖氨酸甲酯、赖氨酸乙酯、鸟氨酸甲酯、鸟氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺等，其具体结构如下：

，，，，，，，等

其中y为2，4，8。

上述制备过程可表示如下：

（1）中间体对硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水小分子（R₁-4-NC）的制备：在0℃条件下，将对硝基苯基氯甲酸酯的二氯甲烷溶液滴加到疏水性羟基化合物和吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，将反应液转移到30℃油浴中反应24小时后过滤将除去吡啶盐，旋蒸除去二氯甲烷得到粗产品。将粗产品溶解在石油醚中，然后在-5℃度离心除去不溶物，再旋蒸除去溶剂得到黄色油状的中间体R₁-4-NC；末端氨基的疏水小分子（R₁-NH₂）的制备：将对硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水小分子（R₁-4-NC）溶解在无水二氯甲烷溶液中，用恒压滴液漏斗10秒每滴滴加到二胺和吡啶的溶液中，室温反应24小时后，用去离子水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷，真空干燥24小时，得到产品。干燥后，抽滤除去硫酸镁，收集有机相滤液，旋转蒸发除去二氯甲烷，并真空干燥24小时，得到末端氨基的疏水小分子（R₁-NH₂）；

（2）将步骤（1）制备的末端氨基的疏水小分子（R₁-NH₂）溶解在无水二氯甲烷或二甲基甲酰胺中并置于密闭反应器中，再将γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Glu-NCA）或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Asp-NCA）的二氯甲烷或二甲基甲酰胺溶液在氮气环境下快速加入到引发剂溶液中，然后在25～50℃反应12～72小时。反应结束后，将反应液用冰乙醚沉淀，离心，真空干燥，得到基于聚氨基酸的聚合物；

末端氨基的疏水小分子（R₁-NH₂）与γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Glu-NCA）或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Asp-NCA）的摩尔比根据需要控制在1:3～25。所用有机溶剂可以是二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮，本发明优选二氯甲烷。

上述制备方法可表示如下：

本发明公开的由上述末端氨基的疏水小分子（R₁-NH₂）引发γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Glu-NCA）或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基内酸酐（EG_x-Asp-NCA）聚合制备的聚合物，其分子量为0.5～6.5>

（3）先将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水等溶剂中，然后在EDC/NHS催化条件下，与短肽、单糖、叶酸、生物素、抗体等生物活性分子反应，制得含靶向分子等生物活性分子的表面活性剂；然后向该表面活性剂的水溶液中逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物相容性聚合物的丙酮溶液，再在室温下搅拌挥发除去有机溶剂，离心收集到表面含有靶向分子等生物活性分子的多功能性纳米粒子。由于上述聚合物由功能性疏水小分子和亲水聚氨基酸组成，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。同时憎水功能性疏水小分子头和亲水聚氨基酸尾巴都有大分子结构和大表面积，具备成为优良表面活性剂的基本特征。而且，聚合物亲水链段长度能通过调节聚氨基酸的聚合度来控制，从而得到不同亲疏水比例的聚合物，可方便制备具有不同乳化性能的聚合物。另外，聚氨基酸亲水链段的末端含有胺基，可用来引入靶向分子等生物活性分子，从而制得多功能的纳米药物载体，负载药物用于肿瘤的安全高效治疗。

也可以不加入靶向分子，制备得到纳米粒子，可以负载多种药物，用于多种疾病的体内治疗。

本发明还公开了一种药物，包括疏水药以及上述方法制备的基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子；疏水药包括紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、伊立替康、长春新碱、拓扑替康、贝洛替康、长春瑞滨。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

1. 本发明用基于聚氨基酸的聚合物作为高分子表面活性剂与PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物相容性聚合物制备的多功能纳米药物载体的表面由聚氨基酸链段构成，很好克服了现有大多纳米粒子表面由聚乙二醇构成所带来的不能生物降解、容易引发过敏反应和很难进行纳米粒子表面修饰等问题；亲水聚氨基酸链不仅具有很好的生物降解性，而且其末端的胺基能方便在纳米粒子表面引入靶向分子和穿模肽等生物活性分子，从而增强纳米药物在病灶处的富集量。

2. 本发明公开的基于聚氨基酸的生物可降解聚合物作为高分子表面活性剂能很好克服现有高分子表面活性剂（PVA，poloxamer，PVP等）不具有生物可降解性、生物相容性不好、很难进行官能化修饰等缺点；以其作为表面活性剂与PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物可降解聚合物聚合制备药物载体，成功解决了现有载体存在的不能生物降解、体内存在潜在的毒性、缺少功能基团等缺点，取得了意想不到的技术效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一 引发剂维他命E氨基（VE-NH₂）的合成

（1）中间体VE-4-NC的制备：氮气环境下，将对硝基苯基氯甲酸酯（4-NC，1.98 g, 9.8mmol）的二氯甲烷（30 mL）溶液在0℃条件下以5秒一滴的速度滴加到维他命E（VE，2.12 g,4.9 mmol）和吡啶（1.98 mL, 24.5 mmol）的二氯甲烷（10 mL）溶液中。滴加完毕后，转移到30℃油浴中反应24小时。反应后，过滤除去副产物吡啶盐，再用旋转蒸发仪旋干滤液，得到淡黄色粘稠的VE-4-NC粗产品。然后用石油醚（b.p: 60-90 ℃）溶解粗产品，离心除去杂质，旋蒸、最后真空干燥得到黄色粘稠油状产品VE-4-NC，产率93.4%；

（2）引发剂维他命E氨基（VE-NH₂）的制备：氮气环境下，将步骤（1）制备的对硝基苯基氯甲酸酯活化的VE-4-NC（0.6>2，产率78.1%。

VE-NH₂核磁表征；¹HNMR>3):>2CH₂NH₂);>2CH₂NH₂);>3)₃CH₂CH₂-);>3)₃-);1.77(t,-Ph(CH₃)₃CH₂CH₂-);1.52(m,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-);1.37-1.07(m,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-;s,-C(CH₃)O-);0.87-0.83(d,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-)。

将维他命E更换为胆固醇，可以制备引发剂胆固醇氨基（Chol-NH₂）；¹H NMR>3):>2)₂CHOCONH-);>2CH₂NH₂);>2CH₂NH₂);>2CH(-CH₂)>

实施例二 维他命E-聚（γ-二乙二醇单甲醚-L-谷氨酸）（VE-poly(EG₂-Glu)）的合成

将引发剂维他命E氨基VE-NH₂（1.16>2-Glu-NCA）（3.71>

VE-poly(EG₂-Glu)>1H>3):>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-);>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-);>2CH₂NH-;>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-);>3)₃CH₂CH₂-,>2CH₂-);>3)₃-);>2CH₂-);>3)₃CH₂CH₂-);>3(CH(CH₃)CH₂CH_2>CH2)3-);>3(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-;>3)(CH₂)-);>3(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-)。

将引发剂维他命E氨基VE-NH₂更换为引发剂胆固醇氨基（Chol-NH₂），得到淡黄色固体Chol-poly(EG₂-Asp)_19.1，产率62.1%。¹H>3):>2)₂CHOCONH-);>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-)>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-);>2CH₂NH-;>3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-)。

用相似的方法，通过选用不同单体（EG_x-Glu-NCA或EG_x-Asp-NCA）和控制单体/引发剂的投料比，可以制备得到一系列聚合度不同的VE-poly(EG_x-Glu)_n和VE-poly(EG_x-Asp)_n两亲性聚合物，其表征见表1。

表1 聚合物V E-poly(EG_x-Glu)_n和VE-poly(EG_x-Asp)_n的制备和表征

用相似的方法，选用不同的引发剂如香豆素胺基化合物（Cou-NH₂）、胆酸胺基化合物（CA-NH₂）、喜树碱胺基化合物（CPT-NH₂）、伊立替康胺基化合物（INT-NH₂）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）、艾日布林（Eri）和十六烷基胺（THDA），开环聚合NCA单体可制得一系列疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物，其表征见表2。

表2 疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物的制备和表征

实施例三 用VE-poly(EG_x-Glu)_n为高分子表面活性剂制备PLGA纳米粒子

PLGA纳米粒子（PLGA NPs）的制备：以VE-poly(EG₂-Glu)₅为高分子表面活性剂为例，将0.9>2-Glu)₅水溶液（0.45>2-Glu)₅的PLGA纳米粒子。纳米粒子的粒径和粒径分布可用动态光散射测量分别为135>2-Glu)₅聚氨基酸链段可通过X射线光电子能谱观察到N峰的出现得到证实。而且，纳米粒子表面含有表面活性剂的量可用氢谱核磁具体测得，通过比较表面活性剂上EG₂在>2-Glu)₅。通过调节VE-poly(EG₂-Glu)₅为高分子表面活性剂的浓度为0.15，030>

实施例四 表面含有靶向分子的PLA纳米粒子的制备

先将靶向分子连接到高分子表面活性剂的亲水聚氨基酸链段的末端。以连接ACUPA短肽靶向分子到VE-poly(EG₃-Glu)_14.4聚合物为例，首先将聚合物末端胺基转化为羧基，具体方法如下：将VE-poly(EG₃-Glu)_14.4（900>3-Glu)_14.4-COOH，产率78.1%。接着，用EDC/NHS活化VE-poly(EG₃-Glu)_14.4-COOH末端羧基，将VE-poly(EG₃-Glu)_14.4-COOH（680mg，0.15>3-Glu)_14.4-NHS，产率87.1%。最后，将制得的VE-poly(EG₃-Glu)_14.4-NHS与含氨基的ACUPA靶向分子反应，具体的，先将ACUPA（44.7>3-Glu)_14.4-NHS（585mg，0.13>3-Glu)_14.4-ACUPA聚合物，产率77.9%。然后，按照实施例三类似的方法用VE-poly(EG₃-Glu)_14.4-ACUPA为高分子表面活性剂制备得到表面含有ACUPA靶向分子的PLA纳米粒子，该纳米粒子表面含有的靶向分子密度可以通过调节高分子表面活性剂的浓度来控制。

用相似方法可以将其它靶向分子如cRGD、iRGD、AP、奥曲肽、TAT、Angiopep-2、iRGD、T7、Cilengitide、抗体及其片段、半乳糖（Gal）、叶酸、生物素等连接到纳米粒子表面，从而实现纳米粒子的表面功能化和作为药物载体包载药物后纳米药物的靶向输送。

表3 用VE-poly(EG2-Glu)₅表面活性剂制备PLGA纳米粒子（PLGA>

实施例五 表面可逆交联且含有转铁蛋白（Tf）靶向分子的PCL纳米粒子的制备

首先将转铁蛋白的N-糖苷链氧化制备醛基官能化的转铁蛋白（Tf-CHO），将转铁蛋白（Tf，25 mg）溶解在900 µL的醋酸钠（0.1 M，pH 5.5）溶液中，再向其加入225 µL高碘酸钠溶液（50 mM），在室温下反应1 h后。反应后，在4℃条件下用Sephadex G-25色谱柱（1.8 × 25cm）提纯（流动相为醋酸钠（0.1 M，pH 5.5）溶液），制备得到Tf-CHO。将Chol-poly(EG₂-Asp)_19.1的末端胺基转化为羧基，接着，用EDC/NHS活化；接着与Tf-CHO反应得到靶向聚合物；然后，用靶向聚合物为高分子表面活性剂制备PCL纳米粒子，将0.9>

实施例六 纳米粒子对疏水药物的装载及体外释放

用纳米粒子包载疏水药物紫杉醇（PTX）为例，先将PTX和PLGA（理论载药量 8 wt.%）溶解到丙酮溶液中，再逐滴滴加该溶液到VE-poly(EG₂-Glu)₅高分子表面活性剂的水溶液（0.45>

纳米粒子的粒径和粒径分布可用动态光散射测量分别为164 nm和0.16。纳米粒子的载药量可用高效液相色谱（HPLC）测定。先取0.2 mL PTX-PLGA NPs的溶液，冻干称重。再用水和乙腈（50:50, v/v）重新溶解，经0.45 µm滤膜过滤后，用HPLC测定载药量（DLC）和载药效率（DLE）分别为6.4 wt.%和80.1%。用相似的方法可用VE-poly(EG₂-Glu)₅高分子表面活性剂制备纳米粒子实现对其它憎水性药物如多西紫杉醇（DTX）、喜树碱（CPT）、伊立替康（INT）、长春新碱（VCR）、拓扑替康（TPT）、贝洛替康（BLT）、长春瑞滨（NVB）、阿霉素（DOX）等的包载，其结果见表4。

表4 用VE-poly(EG₂-Glu)₅制备的包载疏水药物的纳米粒子

PTX的体外释放实验是在37 ℃恒温摇床中震荡（200 rpm）进行，有三个平行样。将0.5mL的PTX-HA-PLGA NPs载药纳米粒子溶液置于透析袋（MWCO 12000-14000 Da, SpectrumLaboratories, USA）中，然后将该透析袋放到含有吐温80（0.1%, v/v）的PB（10 mM, pH7.4）缓冲溶液（25 mL）中进行体外释放实验。每间隔一定时间，从释放介质中取出5.0 mL溶液用作测试，同时向试管中补加5.0 mL相应介质。将取出的释放介质溶液冻干，再加入0.5mL乙腈/水（1:4, v/v）溶解，然后用HPLC测定溶液中药物浓度，最终观察到PTX从PTX-HA-PLGA NPs累计释放量随时间变化的行为，结果表明在PB（10 mM, pH 7.4）介质中，大约有54.0%的PTX在7天后从HA-PLGA NPs中释放出来。

实施例七 MTT法分析空纳米粒子（HA-PLGA NPs）的细胞毒性

选用正常细胞（小鼠成纤维L929细胞）和肿瘤细胞（人乳腺癌MCF-7, 人脑胶质瘤MGU87）用MTT法测试HA-PLGA NPs的细胞毒性。首先将细胞种在96孔板上（1×10⁴个细胞/孔），经24小时培养至细胞贴壁约70%。然后，加入不同浓度（10-350>

实施例八 载药纳米粒子（PTX-HA-PLGA NPs）体外细胞毒性

用MTT法分析PTX-HA-PLGA NPs对MCF-7（表面过度表达CD44受体）肿瘤细胞的毒性。首先将细胞种在96孔板上（1×10⁴个细胞/孔），经24小时培养至细胞贴壁约70%。然后，加入PTX-HA-PLGA>50>=>50>=>50为2.16>

实施例九 载药纳米粒子（PTX-HA-PLGA NPs）的体内抗肿瘤活性

体内抗肿瘤活性实验是用荷MCF-7人乳腺癌Balb/c裸鼠（18~20 克，4~6周龄）进行。首先通过在裸鼠皮下注射MCF-7人乳腺癌细胞（5×10⁶个/只）建立皮下乳腺癌肿瘤模型，等肿瘤长大到约50-80>3时（大约1周）开始进行治疗。治疗共分两组，即载药纳米粒子（PTX-HA-PLGA NPs）和PTX临床制剂（Taxol），用空纳米粒子（HA-PLGA NPs）和生理盐水（PBS）作为对照组。将给药起始日定义第0天，分别在第0、3、6、9和12天通过小鼠尾静脉注射给药（PTX药量为5 mg/kg）。在治疗期间，观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、体重变化和存活率。小鼠的体重是每三天称量一次。小鼠的肿瘤体积用游标卡尺测量，计算方法为：V=（L×W×H）/2，（其中L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度，H为肿瘤的厚度）。持续观察小鼠的生存到38天。实验过程中小鼠自然死亡或肿瘤体积大于1000>3时，判定为死亡。结果发现PTX-HA-PLGA>

综上可知，本发明基于聚氨基酸的生物可降解性聚合物可以作为表面活性剂，与PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等形成纳米粒子，增加了聚合物的生物可降解性以及功能性，进一步的，还可以加入靶向分子，得到靶向纳米粒子，用于药物的载体，不仅增加药物富集率，提高药物靶向能力，更解决了现有载体存在的生物可降解性差、有毒、不稳定的缺陷。