SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用

摘要

本发明提供了SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用，还提供了SFRP2作为制备促进牙源性间充质干细胞介导组织再生药物的应用，通过对WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的机制进行的研究，发现其有促进干细胞牙向‑骨向分化的左右，并对其可能的机制进行阐述，从而为研究牙齿和骨骼生长发育时空特异性的分子调控机制及生物性全牙再生的种子细胞的改建提供重要线索。

说明书

本申请要求于2015年05月14日提交中国专利局、申请号为201510246730.4、发明名称为“SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及WNT信号调节因子SFRP2促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙定向分化中的应用。

背景技术

牙齿缺失修复和牙周组织再生一直是口腔科学的研究重点之一。间充质干细胞在牙齿发育及组织再生过程中起着重要的作用，牙齿发育异常包括数目、形态、结构异常，这些都与牙齿发育过程中的基因表达及功能异常相关，从而引起发育过程中细胞特别是干细胞增殖分化的功能变化导致疾病的发生。近年来，间充质干细胞和组织工程技术的研究进展给牙齿或牙周组织再生带来了希望。间充质干细胞，具有多向分化潜能和自由更新的能力，可以分化成相应的组织。尽管间充质干细胞介导的牙及支持组织再生取得了一些研究成果，但目前还存在一些关键问题亟待解决，其中之一是再生的种子细胞-牙源性干细胞来源有限，牙源性干细胞定向分化及增殖的分子调控机制仍未完全明确。干细胞可以进行异体移植用于治疗，但由于供者年龄和其他一些因素的影响，有些干细胞过于衰老，治疗效果欠佳，并且由于成人干细胞生命周期短暂导致其长期治疗效果较差。如果对干细胞进行遗传改建，使其重编程，激活或抑制调节衰老过程的基因，使干细胞重新年轻，从而给与他们新的生命；或者提高干细胞的定性分化能力及延长其生命周期后再用于治疗，从而提高干细胞的治疗效果。尽管很多研究表明间充质干细胞异体移植后具有免疫抑制作用，但都缺乏长期的追踪报道。长期的异体移植有可能存在的排异反应、伦理及其他一些因素的影响，使病人难以接受。用病人自己的干细胞在体外进行培养的过程中，进行遗传改建，使其干细胞恢复正常的功能，特别是对于某些遗传病的病人，揭示其疾病的致病机理，一方面有助于疾病的早期诊断、预防及治疗；另一方面可以针对性地对他们的干细胞采取激活异常沉寂的基因或者沉寂异常激活的基因，从而使改建以后的，具有多潜能的干细胞用于自体移植具有广阔的临床应用价值。

SFRP2是一个可溶性的WNT信号调节因子SFRPs基因家族的一员。

SFRPs基因家族定位于染色体8p12～11.1，包括5个成员：SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4和SFRP5，属于分泌型frizzled相关蛋白，作为可溶性的Wnt信号调节因子，通过与Wnt信号通路同源的受体竞争结合而抑制Wnt信号通路，从而在生物发育、细胞转运、肿瘤形成及细胞凋亡等生命过程中发挥重要的作用。此外SFRP2还可以抑制RANKL的活性从而抑制破骨细胞活性，并与Tolloid金属蛋白酶结合来调节胶原形成，或者与integrin和fibronectin复合体相互作用调控细胞凋亡。目前研究表明SFRP2是间充质干细胞本身分泌的一个重要因子，在间充质干细胞的自我更新过程中起着重要调节作用，并且可以增强骨髓间充质干细胞心肌修复效果。但SFRP2对间充质干细胞定向分化的影响及机制尚不清楚，需要进行深入研究。

通过SFRP2对间充质干细胞功能影响的研究，可以为研究间充质干细胞的程序性再激活及功能改建进行理论准备，在此基础上希望能发现相应的药物或生物制剂控制干细胞的状态来达到临床应用和治疗的目的，解决患者的痛苦，恢复患者的身心健康，并将产生较好的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。

本发明提供了SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用。

本发明还提供了SFRP2作为制备促进牙源性间充质干细胞介导组织再生药物的应用。

本发明所述的药物按照加工需要可以制备成任何医药上可接受的剂型，其配置通常由本领域技术人员公知的加工方法制备，即将活性组分与液体溶剂或者固体载体混合，在添加至少一种表面活性剂制备而成，其中较优选为片剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊剂。

本发明所述的药物在使用前可由使用者经稀释或直接使用。

本发明的有益效果为通过对WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的机制进行的研究，发现其有促进干细胞牙向-骨向分化的左右，并对其可能的机制进行阐述，从而为研究牙齿和骨骼生长发育时空特异性的分子调控机制及生物性全牙再生的种子细胞的改建提供重要线索。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示早期成骨分化碱性磷酸酶指标；a为碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶；b为测茜素红染色检测晚期成骨指标-细胞矿化能力；c为测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力；d～i为0d、3d、7d、10d、14d周的不同时间点收获细胞；

图2示过表达SFRP2促进SCAPs成骨/成牙本质分化能力；

图3示基因敲除SFRP2抑制SCAPs成骨/成牙本质分化能力；

图4示SFRP2敲除的根尖牙乳头干细胞变化；

图5示碱性磷酸酶检测及茜素红染色的方法观察到SCAPs的成骨分化能力；a为碱性磷酸酶检测；b为茜素红染色。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。以下实验方法在未进行特殊说明的情况下均为本领域常规技术手段。

干细胞的分离、培养与鉴定：

人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙牙周组织和恒牙炎性牙周组织，牙髓组织,或者正畸需要拔除的年轻恒牙(正畸减数拔牙或年轻智齿)根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和培养PDLSCs，DPSCs，SCAPs，简述如下：将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷PBS的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养牙周膜干细胞、牙髓细胞、根尖牙乳头细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取中段的牙周组织，磨开牙髓腔、取出牙髓，或直接切取根尖牙乳头部位组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90、CD146、STRO-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。

构建病毒质粒：应用Whitehead研究所的程序设计SFRP2的SiRNA，插入慢病毒载体上构建成SFRP2shRNA的质粒。

病毒包装及收集：慢病毒质粒及相应的包装质粒(VSVG和dv-8.2)转染293T细胞，转染后48小时，收取上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存。

稳定转染细胞系的建立：慢病毒转染SCAPs干细胞，转染后48小时，用药物puromycin筛选3天，筛选得到Scramsh、SFRP2sh及SFRP2、SFRP2Vector的稳定转染细胞系。

实施例1 干细胞成骨/成牙分化生物学性能影响的体外研究

通过检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶，晚期成骨指标-钙结节形成及在mRNA水平检测分化指标(RUNX2、COL1、OPN、BSP、OCN等)观察在干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化的能力。

取过表达SFRP2的根尖牙乳头干细胞及对照组以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将脐带干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每2天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

如图1(a)所示，3天后测定碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶，如图1(b、c)所示，2周、3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。如图1(d～i)并在诱导0d、3d、7d、10d、14d周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨/成牙分化指标：BSP、OPN、COL1A2、DSPP、DMP1、OSX。

结果表明过表达SFRP2促进根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化。

具体实验方法：

1、碱性磷酸酶活性测定：

配制缓冲液：裂解液

Stock substrate Sol.1胶囊5ml纯水(4℃储存)。

操作步骤：

1)用标准品制作标准曲线；

2)去培养基，PBS洗2次；

3)加300μl裂解液，37℃摇床，15min；

4)将细胞轻轻刮下，移至1.5ml EP管，4℃离心5min；

5)取上清，移至另一EP管；

6)取胶囊，加入5ml纯水溶解(Stock substrate Sol.)；

7)取50μl ALP缓冲液加入50μl Stock substrate Sol.，充分混匀；

8)置于96孔板中，加入100μl⑺液，10μl上清液，37℃孵育15min；

9)加入110μl 0.5N NaOH终止反应；

10)酶标仪上读取405nm波长吸光度值(OD值)；

2、茜素红染色：

1)弃掉培养基，PBS洗2次；

2)70％乙醇固定，4℃，1h；

3)双蒸水洗2次；

4)40mM茜素红溶液(pH 4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况；

5)双蒸水洗5次，轻轻吹打；

6)扫描仪透摄模式采集图像。

3、Ca2+浓度检测：

1)茜素红染色后，加入10％w/v CPC，室温放置30min(AR-S被溶解至CPC中)；

2)以1:10稀释溶液，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值(OD)

3)以AR-S标准曲线计算Ca²⁺的相对浓度。

4、RT-PCR引物序列：

5、RNA提取

1)培养皿细胞弃上清，PBS冲洗2遍，加700ul QIAZOL，吹打混匀，收于ep管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃12000g离心15min,收上清于新EP管；

2)取700ul样本至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

3)加700ul Buffer RWT至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

4)加500ul Buffer RPE至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

5)重复步骤(4)；

6)转移RNeasy Mini column至一新2ml collection tube，4℃1000g离心1min,弃下层液体；

7)转移RNeasy Mini column至一新2ml collection tube,加30-50ulRNase-free water,4℃8000g离心15s，收集下层液体于新EP管，测RNA浓度，-80℃保存。

6、反转录PCR

1)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液；

2)65℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻1分钟以上；

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部；

4)在上述Microtube管中配制加入下列反转录反应液；

5)混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却；

6)加入1ul M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀；

7)37℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。

7、Real-time PCR

配置Real-time PCR反应体系如下：

Real-time PCR反应体系如下：

实施例2 干细胞生物学性能影响的体内研究

将过表达及敲除组的根尖牙乳头干细胞与羟基磷灰石和三磷酸钙(HA/TCP)混合后移植到裸鼠皮下，观察组织学的变化来研究干细胞体内成骨/成牙分化能力。如图2所示，结果显示过表达SFRP2促进SCAPs成骨/成牙本质分化能力。如图3所示，结果显示基因敲除SFRP2抑制SCAPs成骨/成牙本质分化能力。

取SFRP2敲除的根尖牙乳头干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，培养发现细胞逐渐凋亡。检测与成骨相关的转录因子发现OSX表达水平明显下降(图4)。

体内移植实验方法：

1)分别取生长状态良好的第4代上述不同分组细胞，以1×105个/皿的密度接种10cm培养皿，待细胞长至80％汇合度时弃培养基，PBS漂洗(为保证细胞状态，细胞汇合度不宜过大)。

2)每组细胞加2.5mlⅡ型胶原酶(含100ug/ml TLC)37℃孵育5min，将细胞从培养皿上洗脱，然后将细胞悬液转移至50ml的离心管中。离心管中提前加入5-10ml含20％FBS、10-8M地塞米松和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基。

2)向每个离心管中加入2.5ml胰酶37℃孵育2-5min。

3)1000rpm，4℃离心5min。

4)用上述含20％FBS、10-8M地塞米松和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基重悬细胞，计数，取1ml细胞悬液至含有40mg羟基磷灰石(HA)的2ml圆底EP管中(要保证每组细胞量一致，约2-3×106个细胞/组)。

5)37℃，5％CO2条件下孵育1.5h。为保证细胞与HA充分结合，应在摇动的情况下孵育。

6)短时离心，使HA沉于管底，吸上清，细胞与HA混合物待用。

7)裸鼠称重，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。75％酒精消毒背部皮肤，在背部中线处剪一2-3cm的切口。

8)钝性分离皮下结缔组织，将细胞与HA混合物植入裸鼠皮下缝合皮肤。

9)移植后第八周，获取移植细胞用10％福尔马林固定，10％EDTA脱钙(pH值8.0)，石蜡包埋，HE染色，定性测量组织矿化量；

实施例3 调控机制研究：

通过转染shRNA的方法分别实现敲除KDM2A和BCOR，通过RT-PCR检测敲除的结果，应用ChIP方法检测SFRP2转录位点上游启动子+666～+583bp位点的H3K36me2及H3K4me3甲基化的情况，结果表明敲除KDM2A或BCOR可以提高SFRP2转录位点上游启动子+666～+583bp位点的H3K36me2及H3K4me3甲基化的水平。敲除KDM2A或BCOR通过提高SFRP2启动子的组蛋白甲基化来提高SFRP2在根尖牙乳头干细胞中的表达。

实验方法：

(1)吸掉细胞培养板中的培养基，加入10ml 1％甲醛(9mlPBS+1ml 10％甲醛)，37℃10分钟，弃上清，应用加入蛋白酶的PBS洗2次。

(2)弃上清，将细胞移入1.5ml EP管，4℃，2500rpmx4min

(3)按照1×106个细胞加入200ul SDS胞浆裂解液，冰上孵育10分钟，

(4)在冰上将DNA处理成200～1000个碱基大小片段

(5)4℃，13000rpm离心10分钟，取上清转入新的EP管。

(6)将上清按照10倍应用加入蛋白酶抑制剂的ChIP缓冲液稀释

(7)将2ml稀释液加入75ulSalmon Sperm DNA/Protein琼脂糖浆搅拌30分钟，离心去除琼脂糖浆将上清放入新的EP管。

(8)将一抗加入2ml预处理的上清，4℃旋转孵育4小时～过夜。

(9)加入60ul Salmon Sperm DNA/Protein琼脂糖浆4℃旋转处理1小时以收集抗体组蛋白复合物

(10)低速离心(1000G 1分钟)去除琼脂糖浆，小心去除包含未结合染色质的上清

(11)依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清液。

(12)清洗完毕后，开始洗脱。每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

(13)解交联：每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。混匀，65度解交联4小时。加入10ul0.5M EDTA，20ul1M Tris-Hcl，PH 6.5以及2ul 10mg/ml蛋白酶K 45℃孵育1小时。

(14)DNA样品的回收，氯仿提取和酒精沉淀，70％酒精洗沉淀后干燥，溶于水保存。

(15)PCR进行DNA检测

实施例4SFRP2通过抑制WNT通路来实现成骨/成牙分化方向调控

过表达SFRP2可以上调磷酸化beta-catenin，减少核内beta-catenin的含量，反之敲除SFRP2可以下调磷酸化beta-catenin，增加核内beta-catenin的含量。将WNT1A应用逆转录病毒进行敲除后观察，如图5所示，应用碱性磷酸酶检测及钙离子定量分析的方法观察到SCAPs的成骨分化能力明显减弱，设计应用transwell实验应用SFRP2进行挽救后可以明显改善SCAPs成骨能力的降低。

Western Blot：

1)细胞总蛋白的提取

①弃培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，加入5ml PBS后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min；

②弃上清，以1:5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ul RIPA+1ulPMSF+1ul PIC)，冰上15min，每2-3min混悬一次；

③4℃，14,000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存。

2)Bradford法测定蛋白浓度

①BSA蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

②根据样品和标准品数量，按每孔加200ul 1X考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；

③测定595nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度；

④根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。

3)聚丙烯酰胺凝胶电泳

①准备预成胶；

②变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ul loading buffer(溴酚蓝)，95℃加热10min；

③上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。

4)转膜

①准备预成膜；

②将电泳胶转移至预成膜中，使用BioRad半干转进行转膜；

③取出PVDF膜，TBST漂洗5min。

5)Western blot滤膜杂交

①将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时；

②TBST漂洗10min×3次；

③将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜；

④TBST洗膜，10min×3次；

⑤将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的HRP标记的二抗中，室温摇床孵育1小时；

⑥TBST洗膜，10min×3次。

6)显色

将PVDF膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。

碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色方法同前。

综上所述，SFRP2可以促进SCAP细胞的牙向/骨向分化，其发生作用可能通过与调控骨向分化相关的重要转录因子OSX有关，BCOR与KDM2A复合体可以通过对SFRP2启动子部位甲基化的改变从而调控SFRP2的转录表达。其促进牙乳头干细胞骨向牙向分化的是通过抑制经典的WNT通路来实现的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。