一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用微生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的方法，本发明采用保藏号为Bacillus subtilis ATCC 6633的菌株生物转化得到二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)，经反复硅胶柱层析纯化获得三个单糖苷纯品(HMZG‑1、HMZG‑2和HMZG‑3)。本发明建立了一种高效获得二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的生物转化方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的方法。

背景技术

二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)为刺五加、虎杖、接骨木、草珊瑚等药用植物中的微量活性成分，具有广泛的药理活性，如保肝、抗氧化、抗炎、抗真菌、抗HSV和抗病毒等。属于苯并二氢呋喃类新木脂素葡萄糖单糖苷。由于其在植物中含量甚微，从植物中提取分离难以大量制备；利用化学方法糖基化二氢去氢双松柏醇获得其葡萄糖单糖苷步骤复杂，产率低成本高且可能污染环境，极大地限制了此类化合物的开发利用。

微生物转化是利用生物体系中的特异性的酶对外源性底物进行结构修饰所发生的化学反应。其转化条件温和、绿色、环保，选择性高，立体专一性强，可以完成化学方法通常不能进行的反应，而且方法简便。目前生物转化所涉及的反应类型有羟基化反应、糖基化反应、羰基化反应、环氧化反应、开环反应和重排反应等。其中，利用生物转化技术进行糖基化反应获得糖苷化合物已经成为天然小分子糖基化研究的重要手段之一。

为了获得高产的二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)，我们开发了一种制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的生物转化制备方法，极大地提高了此类化合物的产率，使其总产率达到了98.04％，此方法操作简便，生产成本低廉，为开发此类化合物更具潜力的药用价值奠定了基础。

发明内容

本发明公开了一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的方法。其特征是以Bacillussubtilis ATCC 6633菌株发酵转化二氢去氢双松柏醇获得二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)。

为了获得高产的二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)，本发明筛选了PDA培养基、BPY培养基、NA培养基和LB培养基等多种培养基作为发酵转化培养基用于生物转化，发现Bacillus subtilis ATCC 6633菌株在多种培养条件下均可转化二氢去氢双松柏醇得到3个二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3)，在PDA培养基中总转化率最高(见表1)。

表1 不同培养基中二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷的转化率

以PDA培养基为基础培养基，筛选不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉)、碳源含量及转化发酵条件对生物转化发酵的影响。优选培养基碳源为蔗糖，含量为每升培养基中含25g蔗糖。转化发酵培养温度为20-30℃，优选26℃。生物转化发酵培养时间为24-96h，优选培养时间为72h。

本发明公开了二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的制备方法，用Bacillus subtilis ATCC 6633对二氢去氢双松柏醇进行生物转化获得。

更优选的方法是以二氢去氢双松柏醇为底物，利用保藏号为Bacillus subtilis ATCC 6633的菌株，将底物和该菌株在以上优选的培养基中进行转化发酵72h，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过反复硅胶柱层析分离即得二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)。

其中有机溶剂优选乙酸乙酯，硅胶柱层析用二氯甲烷和甲醇进行梯度洗脱。所得转化产物为浅黄色粉末状固体。

其中浅黄色粉末状转化产物分别为二氢去氢双松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(HMZG-1)、二氢去氢双松柏醇-9′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(HMZG-2)和二氢去氢双松柏醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(HMZG-3)。

本发明的制备方法与现有技术相比：

(1)通过生物转化的方法制备天然来源极其有限的活性成分，转化发酵制备产率高，二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)产率达到98.04％。

(2)转化制备获得三个糖苷HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3，转化率分别为17.34％、14.29％、66.41％。HMZG-3产率最高，为此化合物的获得和药用价值的进一步探讨奠定了基础。

(3)操作简便，成本低，绿色环保，适合大量制备此类化合物。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应当理解的是，本发明实施例的制备方法仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的生物转化制备二氢去氢双松柏醇糖苷(HMZG)的构思前提下，类似的制备方法都属于本发明要求保护的范围。转化产物的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker 500测定，高分辨质谱用Aglient LC-Q-TOF-MS 6520B测定；色谱柱为C18分析色谱柱(ODS-2，5μm，4.6×250mm，汉邦科技)，所用溶剂均为分析纯或化学纯。

实施例1

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的制备(以PDA培养基培养)

将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26℃培养24小时，摇瓶转速为180r/min；按2％接种量接入PDA转化培养基(马铃薯200g/L，KH₂PO₄>4>1>

实施例2

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的制备(以BPY培养基培养)

将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26℃培养24小时，摇瓶转速为180r/min；按2％接种量接入BPY转化培养基(牛肉浸膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母膏5.0g/L、NaCl 5.0g/L、葡萄糖10.0g/L，pH 7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26℃，转速为180r/min条件下发酵培养72h。HPLC检测其三个转化产物HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的转化率，检测条件同实施例1，转化率分别为13.20％、10.36％、50.24％。

实施例3

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的制备(以NA培养基培养)

将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26℃培养24小时，摇瓶转速为180r/min；按2％接种量接入NA转化培养基(牛肉浸膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂18.0g/L，pH 7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26℃，转速为180r/min条件下发酵培养72h。HPLC检测其三个转化产物HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的转化率，检测条件同实施例1，转化率分别为10.50％、13.51％、45.98％。

实施例4

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的制备(以LB培养基培养)

将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26℃培养24小时，摇瓶转速为180r/min；按2％接种量接入LB转化培养基(酵母浸膏5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，pH 7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26℃，转速为180r/min条件下发酵培养72h。HPLC检测其三个转化产物HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的转化率，检测条件同实施例1，转化率分别为8.91％、14.11％、60.56％。

实施例5

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的分离纯化

按照实施例1的方法，发酵液乙酸乙酯萃取后，减压浓缩得浸膏。将所得浸膏通过硅胶柱色谱(200-300目)梯度洗脱，流动相比例为100％二氯甲烷、二氯甲烷∶甲醇(9∶1)、二氯甲烷∶甲醇(6∶1)和100％甲醇，合并所得馏分，得到三个糖苷转化产物HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3。

实施例6

HMZG-1、HMZG-2和HMZG-3的结构表征

HMZG-1：淡黄色粉末，C₂₆H₃₄O₁₁，ESI-MS>+.¹H>3OD，500MHz)δ：7.14(1H，d，J＝8.5Hz，H-5)，7.03(1H，s，H-2)，6.93(1H，dd，J＝2.0，8.5Hz，H-6)，6.73(1H，s，H-6′)，6.72(1H，s，H-2′)，5.55(1H，d，J＝6.0Hz，H-7)，4.88(1H，d，J＝7.5Hz，H-Glc-1)，3.86(3H，s，3′-OCH₃)，3.85(1H，over>3)，3.75(1H，dd，J＝7.5，11.0Hz，H-9b)，3.38-3.70(5H，overlap，Glc)，3.56(2H，t，J＝6.5Hz，H-9′)，3.48(1H，over>13C>3OD，125MHz)δ：151.0(C-3)，147.6(C-4)，147.5(C-4′)，145.3(C-3′)，138.4(C-1)，137.1(C-1′)，129.6(C-5′)，119.4(C-6)，118.2(C-5)，118.0(C-2′)，114.3(C-6′)，111.3(C-2)，102.9(C-1″)，88.5(C-7)，78.2(C-3″)，77.9(C-5″)，74.9(C-2″)，71.4(C-4″)，65.1(C-9)，62.5(C-6″)，62.2(C-9′)，56.8(C-3-OCH₃)，56.7(C-3′-OCH₃)，55.7(C-8)，35.8(C-8′)，32.9(C-7′).

HMZG-2：淡黄色粉末，C₂₆H₃₄O₁₁，ESI-MS>+.¹H>3OD，500MHz).δ：6.95(1H，s，H-2)，6.82(1H，d，J＝7.0Hz，H-6)，6.77(1H，d，J＝8.5Hz，H-5)，6.74(2H，s，H2′-and>13C>3OD，125MHz)：δ：149.1(C-3)，147.6(C-4′)，147.5(C-4)，145.2(C-3′)，136.9(C-5′)，134.8(C-1)，129.9(C-1′)，119.7(C-6)，118.1(C-6′)，116.2(C-5)，114.3(C-2′)，110.6(C-2)，104.5(C-1″)，89.0(C-7)，78.2(C-3″)，77.9(C-5″)，75.2(C-2″)，71.7(C-4″)，70.0(C-9′)，65.0(C-9)，62.8(C-6″)，56.8(C-3-OCH₃)，56.4(C-3′-OCH₃)，55.4(C-8)，32.9(C-8′)，32.9(C-7′).

HMZG-3：淡黄色粉末，C₂₆H₃₄O₁₁，ESI-MS>+.1H>3OD，500MHz).δ：7.00(1H，s，H-2)，6.86(1H，d，J＝13.0Hz，H-6)，6.79(1H，d，J＝13.0Hz，H-5)，6.75(1H，s，H-6′)，6.73(1H，s，H-2′)，5.59(1H，t，J＝6.5Hz，H-7)，4.35(1H，d，J＝7.0Hz，glc>13C>3OD，125MHz)：δ：149.0(C-3)，147.5(C-4)，147.5(C-4′)，145.2(C-3′)，136.9(C-1)，134.8(C-5′)，129.7(C-1′)，119.7(C-6)，118.2(C-6′)，116.1(C-5)，114.2(C-2′)，110.7(C-2)，104.6(C-1″)，89.0(C-7)，78.3(C-3″)，78.1(C-5″)，75.2(C-2″)，72.5(C-9)，71.6(C-4″)，62.9(C-6″)，62.3(C-9′)，56.8(3-OMe)，56.4(3′-OMe)，53.3(C-8)，35.8(C-8′)，32.9(C-7′).