一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌及应用

摘要

本发明公开了一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌及应用。基于强毒力菌株ZYAH72，通过基因工程方法和无标记筛选策略缺失了该菌株中的

说明书

技术领域

本发明涉及淡水水产养殖鱼用减毒活疫苗，具体涉及一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌及应用。

背景技术

鱼类中爆发的细菌性病害发病频率高，流行范围广，成为制约我国淡水水产养殖业的重要瓶颈。

嗜水气单胞菌是一种重要的鱼类病原菌，由其引发的细菌性败血症严重危害我国乃至世界水产养殖行业，其中以淡水鱼养殖业甚为严重，是造成我国淡水养殖业巨大经济损失的一种首要急性传染病。

嗜水气单胞菌感染鱼类后引起的病变速度极快，已有研究表明该菌具有多种致病因子参与致病过程。经过试验比较研究，本课题组确定了参与致病过程的主要致病因子包括气溶素(aerA)，丝氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素(hly)，细胞紧张性肠毒素(alt)，金属蛋白酶(ast)等。

目前对于该病原菌引发的细菌性败血症的主要防止手段为抗生素及嗜水气单胞菌灭活疫苗。但是，抗生素的滥用会引发动物体内菌群失调及体内残留抗生素等，如果人类食用残留抗生素的动物或制品，则可能带来一系列食品安全问题，而且也不符合环境友好和可持续发展战略的政策方针。二疫苗具有针对性强，抗病周期长，终生免疫，效果显著等特点，其中减毒活疫苗更是具有制备简单、免疫途径方便，免疫效价高，成本低等显著优点。

我国防治由嗜水气单胞菌引起的疾病疫苗主要为灭活疫苗，但是灭活疫苗通常会有以下缺陷：灭活过程导致部分或完全丧失保护性抗原，只能引起不稳定或者水平低下的免疫应答反应，甚至不能激发正确免疫反应及引发副作用等。而减毒活疫苗通过基因敲除的方式可以降低病原菌的致病性，同时还可以保留免疫原性，使得其免疫保护效果更显著，也更加持久。通过无标记敲除技术构建减毒活疫苗，具有以下显著的优点：免疫剂量低免疫次数少，只需接种少量的活疫苗就可引起机体产生坚强的免疫力；不需要使用佐剂，引起过敏反应的机会较小；交叉保护，活疫苗刺激机体增强天然免疫系统反应和细胞免疫，可以同时增强抵抗其它病原菌的感染能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌，该菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydr ophila five-gene deletion strain)AHFGDS，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCT CC NO:M2015798。

本发明的目的在于提供一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌AHFGDS的应用。利用本发明提供的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila five-gene deletion strain)AHFGDS可制备成嗜水气单胞菌感染的活疫苗。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌的获得：本发明提供的嗜水气单胞菌(Aerom onas hydrophila five-gene deletion strain)AHFGDS为强毒力嗜水气单胞菌ZYAH72的aer A，alt，ahp，ast及hly的五基因缺失突变株，并且不含有任何抗生素抗性基因或其他标记基因。

该菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila five-gene deletion strain)AHFGDS，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2015798。

该五基因缺失株菌株与野生菌株ZYAH72相比，在血琼脂平板上溶血活性显著降低，不含气溶素(aerA)，丝氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素(hly)，肠毒素(alt)，金属蛋白酶(ast)五个毒力因子，在生化实验中呈氧化酶、阿拉伯糖、七叶苷、精氨酸双水解酶、葡萄糖产气、水杨素为阳性反应，6％NaCl胨水为阴性反应。在普通TSB固体培养基或液体培养基中生长良好，生长所需适宜温度为28-30℃。

本发明的目的在于提供一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌的应用，包括利用本发明提供的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila five-gene deletion strain)AHFGDS制备成嗜水气单胞菌感染活疫苗或灭活疫苗，特别适用于水产动物中嗜水气单胞菌感染的防治。

所述的水产动物包括但不限于：草鱼、鲫、鳙、鲢、鳜、鲤、青鱼、罗非鱼、鳗鲡、白鲫、银鲫、鲟、黄尾鲴、鳊、斑点叉尾鮰、金鱼、黄鳝、牙鲆等鱼类；还包括蛙、大鲵、虾、蟹、鳖、龟等水生动物。

本发明所述的嗜水气单胞菌减毒菌还可用于制备哺乳动物的嗜水气单胞菌感染疫苗。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明的减毒活疫苗不带有任何抗生素标记，不存在向环境释放抗性菌株或抗生素抗性基因的带来的潜在危害；

2.本发明采用的是同源重组原理定点缺失特定基因片段导致基因失活，使获得的基因缺失菌株具有较好的遗传稳定性，避免使用转座子等不稳定基因工程方法构建减毒菌株带来的遗传不稳定的风险。

3.本发明中使用基因敲除的方法敲除五个毒力因子从而获得减毒株，毒力与亲本菌株相比显著降低，同时较好避免灭活疫苗灭活不彻底带了的安全性问题和灭活试剂带来的副作用；

4.本发明中的减毒活疫苗对不同来源的嗜水气单胞菌具有一定的交叉保护力，具有广谱性；

5.本发明中的减毒活疫苗在不同的动物模型中均具有一定的免疫保护力，说明本发明的减毒活疫苗能有效激活多种宿主的免疫反应。

6.使用本发明提供的疫苗，可显著增强水产动物的免疫力，提高抗病表型。

附图说明

图1：AHFGDS五基因缺失验证示意图。

其中：M：DNA marker；1-2AHFGDS aerA内外部基因；3-4ZYAH72aerA内外部基因；5-6AHFGDS alt内外部基因；7-8ZYAH72alt内外部基因；9-10AHFGDS ahp内外部基因；11-12ZYAH72ahp内外部基因；13-14AHFGDS ast内外部基因；15-16ZYAH72ast内外部基因；17-18AHFGDS alt内外部基因；19-20ZYAH72alt内外部基因。

图2 ZYAH72和AHFGDS两个菌株的生长曲线示意图。

图3嗜水气单胞菌ZYAH72和减毒株AHFGDS在血平板上溶血示意图。

图4嗜水气单胞菌ZYAH72和减毒株AHFGDS定量溶血示意图。

图5嗜水气单胞菌ZYAH72和减毒株AHFGDS对小鼠的致病力实验示意图。

图6嗜水气单胞菌ZYAH72和减毒株AHFGDS对斑马鱼的致病力实验示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来自于商业渠道。

实施例1：

无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌AHFGDS的获得：

经过基因工程方法，将强毒力嗜水气单胞菌ZYAH72的aerA，alt，ahp，ast及hly五个基因进行敲除，经筛选后，最终获得了一株嗜水气单胞菌五基因缺失株AHFGDS(以下简称为AHFGDS)，获得的突变株无所述的五个基因(图1)，因此为一株减毒株。该菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aero monashydrophila five-gene deletion strain)AHFGDS，地址：中国武汉武汉大学。保藏编号：CCTCC NO:M2015798。

本发明的强毒力嗜水气单胞菌ZYAH72(以下简称为ZYAH72)为申请人自湖北地区的发病鲫鱼体内分离和筛选到的一株强毒力野生株，已经保存于武汉的中国典型培养物保藏中心，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCC NO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。已证实，该毒株含有aerA(Genbank登陆号AHA_0438)，alt(Genbank登陆号AHML_00550)，ahp(Genbank登陆号AHA_2687)，ast(Ge nbank登陆号AHA_0804)及hly(Genbank登陆号AHML_02265)五种毒力基因，这五个毒力基因的缺失不影响该菌株的生长速率和对营养的要求，经过传代实验表明该菌株具有很好的遗传稳定性，使用普通TSB培养基培养即可。

实验证明，AHFGDS的生长速率和对营养的需求跟亲本菌株没有显著差异(图2)。挑取TSB固体培养基平板上的AHFGDS单菌落，接种于新鲜TSB液体培养基，在28℃下，140rpm摇床过夜培养。第二天以1：100(体积比)的比例转接新鲜TSB液体培养基，同样条件下培养至OD595nm为1.20左右，此时菌体浓度为2.0*10⁹CFU/mL。用PBS洗涤并稀释成不同浓度的菌悬液(10⁶-10⁸CFU/mL)，即为AHFGDS活疫苗，用于以下实施例。

ZYAH72的菌株培养方式同AHFGDS，以下实施例中，如未特别说明，所用的ZYAH72的菌株或是AHFGDS菌株均为活菌。

实施例2：

定性和定量溶血实验表明AHFGDS细胞毒性降低：

在定性试验中，分别挑取ZYAH72和AHFGDS的单菌落，点到绵羊血平板上，发现AHFGDS在血平板上形成的溶血圈小于ZYAH72(图3)。

使用生理盐水将新鲜的绵羊血红细胞稀释至1％。

挑选平板上单克隆，到TSB培养基中培养24小时，12000rpm离心15min，取上清。使用生理盐水将新鲜的绵羊血红细胞稀释至1％，各取100μL与100μL绵羊红细胞(1％含量)混合，37℃孵育2h，后测定其OD540nm吸光值。可以观察到，与野生菌株ZYAH72相比，AHFGDS显著降低了对细胞的毒性(图4)。这是由于AHFGDS缺失了溶血素基因导致的。

实施例3：

4周龄雌性Balb/c小鼠为实验对象证明AHFGDS毒力减弱：

实验所用小鼠购自湖北省武汉市疾病防御控制中心，在实验室饲养3天无异常变化的作为实验小鼠。

小鼠感染实验：将ZYAH72和AHFGDS的菌液浓度分别调整至1*10⁶CFU/mL，每只小鼠腹腔注射200μL菌液，每隔3h观察一次，记录死亡小鼠数量，观察时间持续一周，注射野生株ZYAH72后，小鼠在24h内死亡8只，而注射AHFGDS的小鼠没有死亡，表明AH>

实施例4：

以斑马鱼为对象的感染实验和半数致死量LD₅₀测定：

实验所用斑马鱼湖北省武汉市中国科学院水生所购买，体长3-4CM，在实验室饲养3天无异常变化的作为实验用鱼。

斑马鱼感染实验：将ZYAH72和AHFGDS的菌液浓度分别调整至2*10⁹CFU/mL，每隔3h观察一次，记录死亡斑马鱼数量，观察时间持续一周，结果见图4。斑马鱼在注射野生株ZYAH72后，12h即有60％的斑马鱼死亡，在36h后全部死亡，而注射AHFGDS的斑马鱼在试验中没有死亡，表明AHFGDS对斑马鱼的毒性显著减弱(图6)。

半数致死量LD₅₀测定：将ZYAH72和AHFGDS的菌液浓度分别调整至2*10⁹CFU/mL，稀释成不同梯度浓度(注射剂量详见表1)，分别腹腔注射健康斑马鱼，每组10只，每条鱼腹腔注射20μL菌液，观察一周内斑马鱼死亡数，比较不同嗜水气单胞菌的毒力差异，LD₅₀值根据Karber法计算，结果见表1。由以上实验可以看出，减毒株AHFGDS的毒力相对于野生株ZYAH72明显下降。同时，可以观察到病变斑马鱼腹部出现明显的出血现象，解剖病鱼腹腔后可以看到脾脏明显重大，肠道出现溃烂。而正常鱼体的腹腔中则没有明显的症状。

表1嗜水气单胞菌ZYAH72和减毒株AHFGDS对斑马鱼的LD₅₀值

实施例5：

嗜水气单胞菌AHFGDS的生物安全性：

取无菌的一次性封口袋，其中加入1mL的无菌PBS，再放入2条斑马鱼，轻轻扶揉鱼体3min左右以洗下粘液。再收集封口袋中液体在12000rpm，4℃离心10min，收集上清，上清使用0.22μL的无菌滤膜过滤除菌。取100μL粘液加入100μL菌液，得到含有约1.5*10⁵CFU/mL的初始反应体系，混匀后在28℃放置1h，之后梯度稀释涂平板计数，计算不同菌株的浓度。

实验结果见表2，表明，粘液对野生菌株ZYAH72几乎没有杀菌效果，而AHFGDS菌株经过粘液处理之后存活率为7.74％左右，说明本发明中减毒株易于被粘膜中的杀菌物质识别和杀伤，难以突破斑马鱼的粘膜以进入体内，在水体在释放该减毒活疫苗是安全的。

表2：斑马鱼粘液杀菌实验

实施例6：

嗜水气单胞菌AHFGDS在制备成嗜水气单胞菌活疫苗中的应用：

本实施例以制备为活疫苗为例进行说明。

安全性实验：30条体长3-4CM斑马鱼，在实验室中饲养4天后进行安全性检测，其中分别使用3×10¹⁰CFU/mL>6CFU>

免疫实验：

随机挑选体长3-4CM健康斑马鱼用于免疫攻毒实验，实验分组及处理方式如下(每组15条斑马鱼)：

浸泡免疫组：将斑马鱼浸泡在AHFGDS浓度为1*10⁸CFU/mL中的菌液中，浸泡时间为8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

浸泡对照组：将斑马鱼浸泡在PBS中8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

腹腔注射免疫组：每条斑马鱼腹腔注射20μL含有3.30*10⁴CFU的活AHFGDS菌体的活疫苗；

腹腔注射对照组：每条斑马鱼腹腔注射20μLPBS；

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，以相同方式进行第二次免疫。第二次免疫2周后，用嗜水气单胞菌野生株ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周各组情况，记录死亡数。

结果显示，用野生株ZYAH72攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组腹部出血，出现败血症的症状，无斑马鱼存活；浸泡免疫组15条斑马鱼死亡7条，腹腔注射免疫组15条斑马鱼死亡8条，存活的斑马鱼没有出现任何的临床症状，腹腔解剖后同样没有观察到任何病变现象。

进一步的，申请人利用本领域的传统菌株J-1(CGMCC NO.3220，CN201010158115致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒)对也上述各组进行了免疫攻毒实验，除攻毒菌株不一样外，其他条件与上述完全相同。结果显示，用J-1菌株攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组无斑马鱼存活，浸泡免疫组15条斑马鱼死亡7条，腹腔注射组15条斑马鱼死亡8条。

实施例7：

嗜水气单胞菌AHFGDS在制备成嗜水气单胞菌活疫苗中的应用：

安全性实验：100g-150g的健康草鱼30条，在实验室中饲养2周后进行疫苗安全性检测，其中分别使用浸泡(浸泡浓度为3*10¹⁰CFU/mL>10CFU/mL>9CFU每条草鱼)处理15条草鱼，结果表明所用草鱼一切正常，无任何死亡，内脏解剖也未见任何异常。

免疫实验：

随机挑选健康草鱼(100g-150g)用于免疫攻毒实验，实验分组及处理方式如下(每组15条草鱼)：

浸泡免疫组：将草鱼浸泡在AHFGDS浓度为3*10⁸CFU/mL中的菌液中，浸泡时间为8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

浸泡对照组：将草鱼浸泡在PBS中8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

腹腔注射免疫组：每条草鱼腹腔注射200μL含有2*10⁷CFU的活AHFGDS菌体的活疫苗；

腹腔注射对照组：每条草鱼腹腔注射200μLPBS；

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，通过相同方式对上述各组进行第二次免疫。第二次免疫2周后，用嗜水气单胞菌野生株ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周各组情况，记录死亡数。

结果显示，用野生株ZYAH72攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组腹部出血，出现败血症的症状，无草鱼存活；浸泡免疫组15条草鱼死亡4条，腹腔注射免疫组15条草鱼死亡2条，存活的草鱼没有出现任何的临床症状，腹腔解剖后同样没有观察到任何病变现象。

进一步的，申请人利用本领域的传统菌株J-1对也上述各草鱼组进行了免疫攻毒实验，除攻毒菌株不一样外，其他条件与上述完全相同。结果显示，用J-1菌株攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组无草鱼存活，浸泡免疫组15条草鱼死亡2条，腹腔注射组15条草鱼死亡4条。

实施例8：

活疫苗能有效激活免疫系统和增强杀菌能力：

按照实施例7中的浸泡免疫组和腹腔注射免疫组的方式对草鱼进行免疫，不攻毒；二免后7天和14天从中随机取3尾，注射器尾静脉穿刺采血，血液分成两份收集，一份不加肝素用于制备抗血清；另一份加入肝素抗凝，用于检测全血的杀菌能力。

实验结果显示通过凝集试验及ELISA检测抗血清抗体滴度，在波长450nm处检测其分光光度，表明阳性孔发生了明显的抗原抗体反应，证明该活疫苗能够增强免疫系统。两组免疫组草鱼，血液中的白细胞吞噬活性明显高于对照组。

实施例9：

嗜水气单胞菌AHFGDS在制备成嗜水气单胞菌活疫苗中的应用：

安全实验：5周龄雌性Balb/c小鼠，在实验室中饲养3天后进行活疫苗安全性检测，10只小鼠腹腔注射200μL含有2*10⁸CFU的活疫苗，结果表明10只实验小鼠一切正常，无任何死亡，内脏解剖也未见任何异常。

免疫实验：

3周龄雌性Balb/c小鼠，在实验室中饲养3天后随机分组。实验分组及处理方式如下(每组10只)：

皮下免疫组：每只小鼠皮下注射100μL含有2*10⁶CFU的AHFGDS活疫苗；

皮下对照组：皮下注射100μL PBS；

灌胃免疫组：每只小鼠灌胃100μL含有2*10⁷CFU的AHFGDS的活疫苗；

灌胃对照组：灌胃100μL PBS。

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，通过相同方式对上述各组进行第二次免疫。第二次免疫2周后，用嗜水气单胞菌野生株ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周内各组情况，记录死亡数。

结果显示，用野生株ZYAH72攻毒后，皮下对照组和灌胃对照组注射ZYAH72之后全部死亡；皮下免疫组小鼠10只无死亡，灌胃组小鼠10只死亡5只。

同时，申请人考察了J-1的攻毒后小鼠存活情况，J-1攻毒实验除攻毒菌株不同外，其余与上述完全相同。结果显示，皮下免疫组10只小鼠死亡5只，灌胃免疫组10只小鼠死亡5只。

同时，申请人对二免两周后(不攻毒)的各组的小鼠进行了抗体滴度，分离肝脏，脾脏及小肠进行病理学检测。实验结果显示通过凝集试验及ELISA检测抗血清抗体滴度，在波长450nm处检测其分光光度，表明阳性孔发生了明显的抗原抗体反应，证明该疫苗具有良好的免疫原性。同时对小鼠各个脏器进行病理组织观察，结果两组免疫组小鼠和对照组小鼠一样，并没有出现任何临床症状。