抗A型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了抗A型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备和应用，属于口蹄疫的防治领域。本发明构建了分泌抗A型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是：CGMCC 12049，其分泌的单克隆抗体为A型FMDV血清型特异性单抗，有高强度的中和能力；用该单克隆抗体建立的A型FMDV抗体的检测方法，本发明单克隆抗体在A型FMDV抗体检测方法中与A型FMDV的强阳性、弱阳性和疑似血清呈现良好的竞争能力，而与O型和Asia1型FMDV强阳性血清以及FMDV阴性血清没有竞争性，能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清，在A型口蹄疫的诊断、预防或治疗等方面具有重要的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗A型口蹄疫病毒的中和性单克隆抗体以及分泌该中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，本发明进一步涉及所述的单克隆抗体在诊断、预防或治疗A型口蹄疫中的应用，属于A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及应用领域。

背景技术

口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，FMDV基因组RNA全长约8.5kb。口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的，主要侵害牛、猪、羊等家畜及多种野生偶蹄动物的高度接触性传染病。该病的爆发和流行常常给畜牧业生产和经济发展带来巨大的损失，严重影响了经济贸易与畜牧业的发展，备受世界各国的关注。世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A类动物传染病。

FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial，各血清型之间无交叉免疫保护。同一血清型内的不同亚型的抗原性均有不用程度的差别，血清学交叉反应的程度也各有不同，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。单克隆抗体具有识别单一抗原位点的能力，与抗原结合特异性强，均质性高，生物活性单一，易于标准化，可批量生产的特点，广泛应用于生物医学领域中。目前，中国主要流行O型、Asial型和A型FMD。近年来，中国部分地区相继发生了A型FMD，因此A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备对于该病的诊断和预防具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株能稳定分泌高中和活性的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系；

本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞系所分泌的具有高中和活性的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体；

本发明的目的之三是将上述抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体应用于诊断A型口蹄疫；

本发明的目的之四是将上述抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体应用于预防或治疗A型口蹄疫。

本发明达到上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先公开了一株能稳定分泌高中和活性的抗A型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及由该杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体。

本发明利用灭活并纯化的A型口蹄疫病毒免疫BALB/c鼠，制备抗A型FMDV A/JLYS/CHA/2014株的单克隆抗体，抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为9A9、8G9和9H4：经IFA特异性鉴定，单抗9A9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型；单抗8G9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型；单抗9H4重链类型为IgG2b，轻链为κ类型。

微量细胞中和试验表明，杂交瘤细胞9A9所分泌的单抗具有很高的中和活性，其腹水中和效价高达1:4096；杂交瘤细胞8G9所分泌的单抗的中和效价仅为1:89，杂交瘤细胞9H4所分泌的单抗则无中和活性。中和试验结果表明，杂交瘤细胞9A9所分泌的单抗的中和活性显著高于杂交瘤细胞系8G9所分泌的单抗的中和活性。

本发明进一步用单抗9A9对全病毒进行Western blot分析，显示明显的特异性反应条带，由此认为单抗9A9识别A型FMDV的一个线性表位。将单抗9A9培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细 胞进行间接免疫荧光检测，结果显示，9A9只与A型毒株呈阳性反应，而与多个O型和Asia1型FMDV分离株均无交叉反应，可认定9A9为A型FMDV血清型特异性单抗。

鉴于杂交瘤细胞系9A9所分泌的抗A型口蹄疫病毒单抗为A型FMDV血清型特异性单抗，且具有较高的中和活性，本发明将该杂交瘤细胞系9A9提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC 12049；建议的分类命名为：分泌抗A型FMDV的中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年3月21日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

鉴于杂交瘤细胞系9A9所分泌的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体为A型FMDV血清型特异性单抗，且具有较高的中和活性，可以将该单克隆抗体应用于诊断、预防或治疗A型口蹄疫的试剂或药物等方面；譬如，可以用本发明的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体为基础制备得到诊断A型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒

由此，本发明进一步公开了一种用于诊断A型口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒，包括：A型口蹄疫病毒抗原，微孔板、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、酶标记的羊抗鼠IgG、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标记的单克隆抗体；其中，所述的单克隆抗体是本发明提供的抗A型口蹄疫病毒高中和性的单克隆抗体。

其中，所述的微孔板优选为96孔微孔板；所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的稀释液为pH9.6的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液；所述的洗涤液为pH7.4的PBST；所述的显色液为TMB底物溶液；所述的终止液为2M>2SO₄；所述的阳性对照血清为A型口蹄疫病毒阳性血清；所述的阴性对照血清为A型口蹄疫病毒阴性血清。

本发明将制备的单抗9A9腹水，经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化，紫 外分光光度计测定9A9浓度为7.64mg/ml。抗体9A9再经DEAE-sephadex a-50离子交换层析进一步纯化，用改良过碘酸钠法标记HRP。用方阵滴定法初步确定A型口蹄疫病毒抗体检测系统中A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度为6.4μg/ml，稀释倍数为1:1000；HRP-9A9最适稀释倍数为1:1500。

为了验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测中的诊断价值，用初步建立的A型口蹄疫病毒抗体检测方法分别检测不同稀释倍数的A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似(临界值)和阴性血清，同时设立O型和Asia1型FMDV强阳性血清作为对照，以验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测方法中与抗原的结合能力、以及单抗9A9区分A型口蹄疫病毒阴阳性血清的能力。用上述检测结果绘制强阳性、弱阳性、疑似(临界值)、阴性血清的抗体滴度曲线；检测结果表明：单抗9A9在A型FMDV抗体检测方法中与A型FMDV的强阳性、弱阳性和疑似血清呈现良好的竞争能力，而与O型和Asia1型FMDV强阳性血清以及FMDV阴性血清没有竞争性，能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清，确定了单抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗体检测方法中的价值和应用潜力。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明杂交瘤细胞系9A9所分泌的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体为A型FMDV血清型特异性单抗，有高强度的中和能力，能应用于A型口蹄疫的诊断、预防或治疗，对于A型口蹄疫的诊断或预防均具有重要的意义。

附图说明

图1 IFA检测单抗9A9与A型、O型、Asia1型FMDV的反应；

图2经辛酸-饱和硫酸铵方法和离子交换层析法纯化的单抗9A9；

图3用A型口蹄疫病毒抗体检测方法检测A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似、FMDV阴性、O型FMDV强阳性和Asia1型FMDV强阳性血清的滴度变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1.材料

1.1病毒、细胞、菌株和实验动物

用于免疫荧光进行单抗特异性分析的毒株包括：A FMDV A/KT/58(GenBankaccession number:AJ131665),Asia1FMDV Asia1/YS/CHA/05(GU931682),O/YS/CHA/05(HM008917),O FMDV O/Tibet/CHA/99(AJ539138),O/GD/86(AJ131468),O/Akesu/58(AF511039)(Wang H,Zhao L,Li W,Zhou G,Yu L(2011)Identification of aconformational epitope on the VP1G-H Loop of type Asia1foot-and-mouth diseasevirus defined by a protective monoclonal antibody.Veterinary microbiology148:189-199.)另，口蹄疫病毒株A/JLYS/CHA/2014属于A型FMDV东南亚97谱系(Sea-97)，其VP1序列的同源性与A/GDMM/CHA/2013(GenBank accession number:KF450794)(Zheng H,Lian K,Yang F,Jin Y,Zhu Z,Guo J,Cao W,Liu H,He J,Zhang K,Li D,Liu X(2015)Cross-protective efficacy of engineering serotype A foot-and-mouth diseasevirus vaccine against the two pandemic strains in swine.Vaccine 33:5772-5778)高达99％，来源上属于同一次流行的毒株。上述毒株由本实验室保存。

乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；

质粒pGEX-6p-1和受体菌BL21由本实验室保存；

清洁级雌性BALB/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

融合剂PEG/DMSO(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、HRP或FITC标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；

L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco公司；

二甲基亚砜(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司；

限制性内切酶EcoRI、XhoI购自TaKaRa公司；

T₄DNA连接酶购自New>

高糖DMEM干粉购自GIBCO公司；

进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；

96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司。

实验例1A型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体的制备

1、试验方法

1.1鼠免疫与单克隆抗体的制备

(1)将A型FMDV接种于长满的BHK-21细胞单层，待75％以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，初步裂解细胞，释放病毒。冻融后的病毒液以加入1∶1000TritonX-100和4∶10000甲醛裂解与灭活48h以上，取灭活过的病毒液1mL上BHK-21细胞盲传三代、检测灭活是否彻底。将经冻融裂解后的培养液9000rpm(Beckman高速离 心机，JA-10转子)、4℃离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀。按病毒液上清的体积加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室温搅拌2h至完全溶解，4℃过夜沉淀。次日将上清9000rpm、4℃离心90min，弃上清，回收沉淀。用NET缓冲液于低温下将沉淀轻轻重悬，29000rpm、4℃离心2h，在冰盒中用适量的NET缓冲液轻轻重悬沉淀。制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度，对病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，利用用紫外分光光度计检测OD259值，根据公式计算146S的抗原含量。

(2)用纯化的A型FMDV抗原，100μg/200uL加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经背部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射二倍剂量的抗原。

(3)细胞融合

a)饲养层细胞的制备：细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75％酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将10mL注射器内吸取的8-10mL HAT完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mL HAT培养液中，吹散混匀细胞，分装于6块96孔培养板，100μL/孔。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

b)骨髓瘤细胞的制备：融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mL DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管中。1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mL DMEM基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。

c)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀。1000rpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mL DMEM基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。

d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：取65mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和1mL50％PEG于37℃水浴中预热，另备盛有37℃水的200mL烧杯。按5份脾细胞数加1份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混匀。1 000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。将离心管放入盛有37℃水的200mL烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用1mL巴氏吸管吸取37℃50％PEG溶液1mL，1min内加完，静置2min。随后先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37℃水浴静置10min。1000rpm离心10min，弃上清，加入65mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.1mL接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换HT培养液。

1.2抗体检测ELISA

用提纯的病毒抗原包被于96孔板中，加入100uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物OPD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。

1.3间接免疫荧光(IFA)

微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4×10³TCID₅₀/well，出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育40min后PBS洗涤三次，加入1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。

1.4微量细胞中和试验

(1)病毒毒价的测定：将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75％以上，收获病毒悬液冻融3次，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10^-1，10^-2，10^-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5％CO₂温箱37℃培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID₅₀。

(2)中和试验：取单抗腹水在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等等，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID₅₀稀释(与等量腹水混合，其毒价为100TCID₅₀)。每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5％CO₂>

2、试验结果

2.1针对A型FMDV线性中和表位单克隆抗体的筛选和鉴定

免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合的杂交瘤细胞，其培养上清FMDV特异性抗体用间接ELISA检测和IFA验证，阳性判定标准为：以杂交瘤细胞培养上清对FMDV抗原的OD₄₉₂光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞培养上清对FMDV抗原OD₄₉₂值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清与正常BHK-21细胞不产生荧光反应，判为阳性。

抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为9A9、8G9和9H4。免疫球蛋白亚类鉴定显示，单抗9A9重链类型为IgG2_a，轻链为κ类型。单抗8G9重链类型为IgG2_a，轻链为κ类型。单抗9H4重链类型为IgG2_b，轻链为κ类型。微量细胞中和试验表明，9A9具有很高的中和活性，腹水中和效价高达1:4096。8G9腹水中和效价仅为1:89，9H4则无中和活性。

鉴于上述9A9是A型FMDV高中和活性的单抗，选取单抗9A9进行下一步的研究。

将单抗9A9培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细胞进行间接免疫荧光检测(图1)，结果显示，9A9只与A型毒株呈阳性反应，而与多个O型和Asia1型FMDV分离株均无交叉反应，可认定9A9为A型FMDV血清型特异性单抗。

上述结果表明，杂交瘤细胞系9A9所分泌的单抗是A型口蹄疫病毒特异性、高中和性的单抗。

本发明将该杂交瘤细胞系9A9提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC 12049；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年3月21日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实验例2A型口蹄疫病毒抗体检测方法的建立

1、试验方法

1.1单克隆抗体的纯化

采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：

(1)取3ml预处理过的腹水加6ml 0.06mol/L pH4.8醋酸缓冲液；腹水中加99ul辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调pH至7.4。

(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000转离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5ml0.1M的pH7.4的PBS中；

(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％--40％，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静止2小时以上；11000转离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2ml 0.1M的pH7.4的PBS中；

(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用0.1M的pH7.4的PBS透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。

再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。

1.2辣根过氧化物酶标记单克隆抗体

经纯化合格后的单克隆抗体用过碘酸钠法进行标记。操作步骤如下：

①取5mg HRP溶于0.5ml pH5.6的0.06M HAc-NaAc缓冲液中，加入 新配制的0.06Mol/L NaIO₄溶液0.5ml，混匀，置4℃20-30min；

②取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH₂O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；

③加入含10mg纯化抗体的溶液1ml，混匀，调pH值9左右，并装入透析袋，用0.05M/LpH9.5的碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析16-24h，使之结合；

④加入NaBH₄溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；

⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃作用30min，3000rpm离心30分钟，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4PBS溶解，装入透析袋，以0.02Mol/L pH7.4PBS在4℃透析除盐过夜；

⑥次日取出离心，10000rpm离心30分钟以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4PBS溶至1-2ml；

⑦用紫外分光光度计分别测定OD₄₀₃和OD₂₈₀，鉴定合格后将标记的IgG-辣根过氧化物酶加等量甘油，-20℃保存。

1.3A型口蹄疫病毒抗体检测方法中各试剂的最佳使用浓度的滴定

确定A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度和HRP标记的检测单抗的使用浓度。试验所用的酶标板为96孔平底微孔板(Costar酶标板，高亲和性)，试验采用50ul反应体系。分别用pH9.6的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液稀释纯化的A型FMDV抗原包被ELISA板，4℃过夜，用pH7.4的PBST洗板5次，甩干。然后用PBST的2倍系列稀释的HRP标记检测单抗(1：100，1：150～1：12800，1：19200)加入ELISA板孔，37℃温育1小时，洗板后加入TMB底物溶液避光显色15～20min后，用2M>2SO₄终止反应，450nm读取光密度值(OD值)，以酶结合物的OD值达到1.6～2.0时试剂的最高稀释倍数为其使用浓度。

各试剂的使用浓度经过方阵滴定初步确定，用于后续的A型口蹄疫病毒抗体检测方法。

1.4A型口蹄疫病毒抗体检测方法试验步骤

A型口蹄疫病毒纯化抗原用pH 9.6Na₂CO₃缓冲液稀释至使用浓度包被ELISA板，50μl/孔，封板或置湿盒内，4℃过夜。取出ELISA板，弃去其中液体，用pH>

2、试验结果

2.1单克隆抗体腹水的纯化及标记

将本发明制备的单抗9A9腹水，经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化，紫外分光光度计测定9A9浓度为7.64mg/ml。抗体9A9再经DEAE-sephadex a-50离子交换层析进一步纯化(图2)，用改良过碘酸钠法标记HRP。

2.2A型口蹄疫病毒抗体检测方法的初步建立

首先用方阵滴定法初步确定A型口蹄疫病毒抗体检测系统中A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度和HRP-9A9检测单抗的使用浓度。结果表明：A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度为6.4μg/ml，稀释倍数为1:1000；HRP-9A9最适稀释倍数为1:1500。

为了验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测中的诊断价值，用初步建立的A型口蹄疫病毒抗体检测方法分别检测不同稀释倍数的A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似(临界值)和阴性血清，同时设立O型和Asia1型FMDV强阳性血清作为对照，以验证单抗9A9在A型口蹄疫病 毒抗体检测方法中与抗原的结合能力、以及单抗9A9区分A型口蹄疫病毒阴阳性血清的能力。

用上述检测结果绘制强阳性、弱阳性、疑似(临界值)、阴性血清的抗体滴度曲线(图3)，检测结果表明：单抗9A9在A型FMDV抗体检测方法中与A型FMDV的强阳性、弱阳性和疑似血清呈现良好的竞争能力，而与O型和Asia1型FMDV强阳性血清以及FMDV阴性血清没有竞争性，能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清，确定了单抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗体检测方法中的价值和应用潜力。