抗B型肉毒毒素Hc结构域单克隆抗体的制备及中和B型肉毒毒素单克隆抗体的筛选

摘要

肉毒神经毒素(Clostridium botulinum neurotoxin，BoNT)是肉毒梭状芽孢菌在厌氧环境中产生的一种外毒素，分7个血清型(A～G)，由神经毒部分(轻链)和非神经毒部分(重链)组成。肉毒毒素通过作用于神经突触感受器，抑制兴奋性神经递质的释放，引起松弛性神经麻痹。肉毒中毒是一种致死率很高的疾病，A、B、E型肉毒毒素是引起人类肉毒中毒的常见类型，F型偶尔引起食物中毒。因此，对肉毒毒素的防治研究具有重要的意义。各型BoNT分子均是呈二硫键连接的双链形式为：重链(heavy chain，HC)和轻链(light chain，LC)。结构功能研究表明，B型肉毒神经毒素(clostridium botulinum neurotoxin serotype B，BoNT/B)保护性抗原表位主要位于HC的羧基端(the carboxyl-terminal of the heavy chain of clostridium botulinumneurotoxin serotype B，BHc)上。因此，本实验通过克隆BHc基因，表达BHc，最后制备抗BHc的单克隆抗体，并筛选具有中和BoNT/B作用的单克隆抗体。 通过PCR从B型肉毒毒素基因组克隆BHc基因。将克隆到的基因连接T载体测序表明，克隆到的BHc基因与GenBank上的序列具有99％的同源性，说明克隆到的基因是BHc基因。将BHc5’端的基因进行修饰，替换掉稀有密码了后，将BHc基因克隆到pET22b(+)，在BL21(DE3)中表达。经SDS-PAGE和Westernblot鉴定，表明表达的BHc能被马抗BoNT/B特异性的识别。经过镍柱纯化和凝胶柱纯化，得到纯度90％以上的BHc。ELISA检测表明纯化到的BHc能与其受体sytⅡ特异的结合。将BHc免疫Babl/C小鼠，第三次免疫后采集血清，效价达到105，表明BHc具有好的免疫原性。攻毒实验表明经过BHc免疫的小鼠，能产生保护性的免疫应答。 BHc免疫的小鼠能在一定程度上免受BoNT/B的伤害。因此，BHc免疫小鼠血清效价达到105后，BHc加强免疫一次，第三天之后取其牌与SP2/0细胞融合。经过 HAT筛选及有限稀释克隆化之后，得到三株抗BHc的单克隆抗体。经protein G纯化得到纯度大于90％的单克隆抗体，效价达到105，亚类攀定表明所得到的单克隆抗体的亚型均为IgG1型。 为了鉴定筛选到的抗BHc单克隆抗体的阻断效果，将BoNT/B受体sytⅡ的基因克隆到pcDNA3.1/myc—his上，然后将质粒pcDNA3.1/myc—his—sytⅡ转染PC12细胞。加G418筛选，筛选单克隆细胞株。提取单克隆细胞株的总RNA，PCR鉴定sytⅡ基因的转录。Westernblot鉴定表明筛选到的PC12细胞系能表达sytⅡ。用FITC标记的标记BHc然后与筛选到的稳定表达sytⅡ的PC12细胞系孵育，荧光显微镜分析表明细胞被标记上了荧光，说明筛选得到的PC12细胞系可以作为单克隆抗体阻断实验的模型，将此PC12细胞系称为PC12-sytⅡ。细胞流式结果表明得到的三株单克隆抗体能阻断BHc与PC12-sytⅡ的结合。单克隆抗体的识别位点的实验表明，A1、A2识别相同的表位，而B1与A1、A2识别的位点是不一样的。单一抗体中和实验表明，筛选得到的单克隆抗体能显著延长小鼠的死亡时间，但并不能完全保护小鼠。而组合抗体的中和实验表明无论是A1与B1组合，还是A2与B1都能比单株单克隆抗体显著延长小鼠的死亡时间。说明本研究制备得到的单克隆抗体有一定的中和活性。ELISA检测显示筛选到的单克隆抗体能特异识别BoNT/B毒素。 本研究筛选到了能中和BoNT/B的单克隆抗体，这三株抗体能特异的识别BoNT/B，并且能一定程度上保护小鼠免受BoNT/B的伤害，为肉毒毒素的检测及抗毒素治疗提供了抗体，也为进一步制备高特异性，高亲和力，高中和效果的抗肉毒毒素抗体奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1肉毒神经毒素的基础研究

1.2肉毒神经毒素的作用机理相研究

1.3肉毒神经毒素疫苗的研制

1.3.1肉毒神经毒素的类毒素疫苗

1.3.2肉毒神经毒素亚单位疫苗

1.3.3肉毒神经毒素的DNA疫苗

1.4肉毒神经毒素防治

1.5肉毒毒素拮抗剂研究

1.6肉毒毒素检测研究

1.6.1小鼠生物检测

1.6.2 ELISA

1.6.3内肽酶活性检测

1.6.4质谱

1.6.5细胞检测

1.6.6试纸检测

1.6.7电化学发光检测

1.6.8免疫PCR检测

1.6.9生物感受器

1.6.10蛋白质微阵列技术

1.6.11滚环扩增

1.6.12 适体

1.6.13纳米颗粒

第2章B型肉毒毒素重链C端基因的克隆表达与保护作用的初步研究

2.1 B型肉毒毒素重链C-端片段基凶的克隆

2.1.1材料

2.1.2方法

2.1.3实验结果

2.1.4实验结果分析

2.2 BHc天然序列表达

2.2.1材料

2.2.2方法

2.2.3实验结果

2.2.4实验结果分析

2.3 BHc融合蛋白表达

2.3.1材料

2.3.2方法

2.3.3实验结果

2.3.4.实验结果分析

2.4.BHc N端基因的修饰表达(用高频密码替换起始端的低频密码)

2.4.1材料

2.4.2方法

2.4.3实验结果

2.4.4实验结果分析

2.5.BoNTB/Hc对小鼠免疫保护作用的初步评价

2.5.1材料

2.5.2方法

2.5.3实验结果

2.5.4实验结果分析

第3章单克隆抗体的筛选和制备

3.1材料

3.1.1试剂

3.1.2主要溶液和培养基

3.1.3实验动物

3.2

3.2.1免疫方案

3.2.2效价测定

3.2.3小鼠腹腔巨噬细胞的制备(饲养细胞)

3.2.4骨髓瘤细胞

3.2.5免疫脾细胞

3.2.6细胞融合流程

3.2.7 HAT选择杂交瘤

3.2.8抗体的检测

3.2.9杂交瘤的克隆化和冻存

3.2.10单克隆抗体的大量生产

3.3实验结果

3.3.1第一轮筛选结果

3.3.2第二轮筛选

3.3.3第三轮筛选

3.3.4腹水制备

3.4分析

第4章PC12-syt Ⅱ稳定转染细胞系的建立

4.1材料

4.2方法

4.2.1 G418筛选浓度的确定

4.2.2转染pcDNA3.1-syt Ⅱ PC12细胞

4.2.3稳定表达syt Ⅱ的PC12细胞系的筛选

4.2.4 Westernblot鉴定syt Ⅱ的表达

4.2.5 BoNT/B与PC12细胞的结合

4.3实验结果

4.3.1质粒pcDNA3.1/myc-his-sytⅡ的鉴定

4.3.2转染pcDNA3.1/myc-his—sytⅡ质粒的PC12细胞总RNA的提取

4.3.3 PCR鉴定syt Ⅱ转录情况

4.3.4 Westernblot鉴定syt Ⅱ的表达

4.3.5 BHc与PC12细胞的结合

4.4分析

第5章单克隆抗体的评价

5.1材料

5.2方法

5.2.1单克隆抗体的纯化

5.2.2单克隆抗体效价测定

5.2.3单克隆抗体亚类鉴定

5.2.4细胞模型的建立

5.2.5单一抗体中和实验

5.2.6抗原抗体反应

5.2.7组合抗体中和

5.2.8体外检测肉毒毒素及破伤风毒素

5.3结果

5.3.1单抗纯化结果

5.3.2效价测定

5.3.3亚类鉴定

5.3.4抗体阻断实验

5.3.5单一抗体中和实验

5.3.6抗体识别位点测定

5.3.7组合抗体中和实验

5.3.7体外检测肉毒毒素及破伤风毒素

5.4分析

第6章讨论

6.1重组BHc的制备及免疫原性

6.2抗BHc单克隆抗体的制备及评价

结论

参考文献

致谢

发表论文