法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-12-12
授权
授权
2016-09-21
实质审查的生效 IPC(主分类):A01H1/02 申请日:20160422
实质审查的生效
2016-08-24
公开
公开
一、技术领域
本发明涉及一种桃树杂种胚试管培育方法及培育基体，尤其是一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培育基体。
二、背景技术
植物的胚培养在克服远缘杂交种胚的早期败育、胚挽救、诱导体细胞胚的发生及砧木快繁等方面具有重要作用，特别是在核果类果树作物如桃、杏、樱桃等的早熟品种上，借助于胚培养技术，可成功实现幼胚即未成熟胚培养成苗，是实现核果类果树特早熟品种培育的基础，因此杂种桃胚试管培育方法及培育基体是一种重要的生物育种方法和育种基质，在现有的一种基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基体中，因为早熟果树品种的胚通常发育不全,采用常规播种不能出苗或萌芽率很低,而采用胚培养技术可以克服种胚不出苗的难题，但一些针对品质或抗性改良进行果树杂交育种的杂种，即使杂种胚已经发育成熟，常规播种也不能出苗或出苗率很低，这一问题严重阻碍了果树品种改良的育种进程。。
三、发明内容
本发明的客体是一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，
本发明的客体是一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体。
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基体，因此提高了杂交果树种子的发苗率。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法，其步骤是：a、无菌杂种胚的获得：把果树种子的种胚进行消毒处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：在装有试管内培养基质的试管内，把无菌杂种胚进行培养，获得胚萌发的植株得到试管植株；
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株的胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm以上的新梢；移栽在试管外育苗基质中，培育得到试管外植株。
由于设计了对果树种子的种胚进行分步培育，在试管内培养基质中培育得到试管植株，在试管外育苗基质中培育得到室外正常生长的植株，不再直接种植果树种子，因此提高了杂交果树种子的发苗率。
本发明设计了，其步骤是：选取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实的胚为培育样本，
a、无菌杂种胚的获得：在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L-500mg/L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：去种皮胚经过100m/L-500mg/L的赤霉素预处理0.5-3小时后的无菌杂种胚样本接种在装有培养基质：MS + 1-5 mg/L GA3>
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养4-6周时，胚已萌发生长成为绿苗体，绿苗体表现为：胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm以上的新梢；
绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为20-25℃的散射阳光下练苗5-7天，用镊子把苗从瓶中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖，对刚移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，此时可揭去塑料溥膜得到试管外植株。
本发明设计了，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质即赤霉素（GA3）、>
其中：基本培养基设置为MS（MurashigeandSkoog）培养基,MS基本培养基组成为：
本发明设计了，试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.8-1.1∶0.9-1.2。
本发明设计了，试管内培养基质在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟。
本发明设计了，培养环境的培养温度设置为25 ± 2℃并且培养环境的光照周期设置为16小时/天。
本发明设计了，桃树杂种设置为桃树或油桃。
本发明设计了，其步骤是：
a、无菌杂种胚的获得：取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实，剔除烂果，在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核，取出种胚放在无菌培养皿内，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L-500mg/L的赤霉素(GA3)进行预处理0.5－3小时；
b、试管植株的获得：经过赤霉素预处理的胚接种到装有胚培养基：MS + 1-5 mg/L GA3+>
c、试管外植株苗体的获得：胚培养4－6周时，胚根产生较多侧根，苗高也大都在10 cm以上，此时可以进行移栽，移栽前，先把瓶盖打开，放在温度为20-25℃的散射阳光下练苗5-7天，然后把苗移到温室，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基,移栽入装有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.8-1.1∶0.9-1.2，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖，目的是对刚移栽的小苗进行保湿，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，表明植株已经成活，此时可揭去塑料溥膜。
本发明设计了，一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，设置为包含有试管内培养基质和试管外育苗基质，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质、 碳源、抗氧化剂、无离子水、琼脂粉；
其中：基本培养基设置为 MS（Murashige and Skoog）培养基, MS 基本培养基组成为：
试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶0.8-1.1∶0.9-1.2。
本发明设计了，植物生长调节物质设置为赤霉素（GA3），碳源设置为蔗糖，抗氧化剂设置为半胱氨酸或抗坏血酸。
本发明的技术效果在于：如在我们针对品质改良进行的桃杂交育种中发现，我们虽然获得了充分发育成熟的杂种种子，但是采用常规播种方法，很难成苗，连续两年播种，出苗率都在8%以下，这一问题直接影响了我们桃杂交育种工作的进行，影响了对桃品种进行遗传改良的育种进程。因此迫切需要解决杂种胚难成苗的问题。借助试管胚培养技术是实现胚成苗的有效方法。现有的幼胚培养方法不适宜于成熟胚的培养，而成熟胚的培养仅在培养胚芽萌发方面有少量研究报道，胚芽萌发成苗后还需生根培养，才能形成一完整植株，然后移栽于试管外，这一方法费时费工，胚成苗效率低。使胚培养一次形成一株和常规播种一样的胚根和胚芽都生长的植株，这一方面显有报道。需要研究开发一种适宜难成苗的桃杂种成熟胚一次成苗的试管培养方法，为采用杂交育种方法进行桃品种改良奠定技术基础。我们项目组选用中晚熟黄肉桃优系‘93’（风味好但偏酸）和早熟白肉桃优良品种‘春雪’（品质好风味甜）进行杂交，获得了种子饱满成熟的杂种胚。杂种经冷藏后进行常规播种，结果出苗率很低，出苗率不足8%，连续两年常规播种的结果相同。这一结果表明，采用常规播种方法，很难获得这一组合的杂种实生苗。本专利的发明目的就是解决桃优系‘93’和‘春雪’这一杂交组合获得的杂交种子常规播种出苗率极低的问题，培养杂种胚成苗，为进行桃品种改良的杂交育种工作提供技术基础。本专利技术的优点是针对桃优系‘93’ב春雪’杂交种的种子田间常规播种不能出苗或出苗率低（出苗率在8%以下）这一问题，能有效提高出苗率，出苗率达90%以上，并成功获得了桃杂种胚萌发生长的健壮植株。本专利技术可用于桃杂交种的种胚在田间播种时不能出芽时的胚的抢救与培养，为桃常规杂交育种进行品种改良提供有效技术支持。
在本技术方案中，果树种子的种胚进行试管内培养和试管外培育的分步培育的技术特征为重要技术特征，在基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基体的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。
四、附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为桃优系‘93’ב春雪’杂交种的接种后培养不同时间胚萌发生长状态图：
其中：图A：培养7天萌发生长状态图、图B：培养14天萌发生长状态图、图C：培养21天萌发生长状态图，
图2为油桃胚萌发生长状态图。
五、具体实施方式
根据审查指南，对本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语应当理解为不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第一个实施例，其步骤是：选取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实的胚为培育样本，
a、无菌杂种胚的获得：在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：去种皮胚经过100m/L的赤霉素预处理0.5小时后的无菌杂种胚样本接种在装有培养基质： MS + 1 mg/L GA3>
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养4周时，胚已萌发生长成为绿苗体，绿苗体表现为：胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm的新梢；
绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为20℃的散射阳光下练苗5天，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖， 对刚移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔3天喷一次水，3周时，小苗长出新叶，此时可揭去塑料溥膜得到试管外植株。
在营养钵中健壮生长的植株，待田间气温适宜时移入田间，获得了进一步进行选种的杂种植株材料。
在本实施例中，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质即赤霉素（GA3）、>
其中：基本培养基设置为 MS（Murashige and Skoog）培养基, MS 基本培养基组成为：
在本实施例中，试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.8∶0.9。
在本实施例中，试管内培养基质在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟。
在本实施例中，培养环境的培养温度设置为25 ± 2℃并且培养环境的光照周期设置为16小时/天。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第二个实施例，其步骤是：选取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实的胚为培育样本，
a、无菌杂种胚的获得：在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为500mg/L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：去种皮胚经过500mg/L的赤霉素预处理3小时后的无菌杂种胚样本接种在装有培养基质： MS + 5 mg/L GA3>
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养6周时，胚已萌发生长成为绿苗体，绿苗体表现为：胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成19 cm的新梢；
绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为25℃的散射阳光下练苗7天，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖， 对刚移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔5天喷一次水， 4周时，小苗长出新叶，此时可揭去塑料溥膜得到试管外植株。
在营养钵中健壮生长的植株，待田间气温适宜时移入田间，获得了进一步进行选种的杂种植株材料。
试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶1.1∶1.2。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第三个实施例，其步骤是：选取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实的胚为培育样本，
a、无菌杂种胚的获得：在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L-500mg/L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：去种皮胚经过100m/L-500mg/L的赤霉素预处理0.5-3小时后的无菌杂种胚样本接种在装有培养基质： MS + 1-5 mg/L GA3>
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养4-6周时，胚已萌发生长成为绿苗体，绿苗体表现为：胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成19 cm的新梢；
绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为20-25℃的散射阳光下练苗5-7天，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖， 对刚移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，此时可揭去塑料溥膜得到试管外植株。
在营养钵中健壮生长的植株，待田间气温适宜时移入田间，获得了进一步进行选种的杂种植株材料。
试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.8-1.1∶0.9-1.2。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第四个实施例，其步骤是：选取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实的胚为培育样本，
a、无菌杂种胚的获得：在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为300mg/L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本；
b、试管植株的获得：去种皮胚经过300mg/L的赤霉素预处理1.5小时后的无菌杂种胚样本接种在装有培养基质： MS + 3 mg/L GA3>
c、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养5周时，胚已萌发生长成为绿苗体，绿苗体表现为：胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成15 cm的新梢；
绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为22.5℃的散射阳光下练苗6天，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖， 对刚移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔4天喷一次水，3.5周时，小苗长出新叶，此时可揭去塑料溥膜得到试管外植株。
在营养钵中健壮生长的植株，待田间气温适宜时移入田间，获得了进一步进行选种的杂种植株材料。
试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.95∶1.0。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其它方式的实施例，其步骤是：
a、无菌杂种胚的获得：取桃优系‘93’ב春雪’杂交种的成熟果实，剔除烂果，在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核，取出种胚放在无菌培养皿内，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L-500mg/L的赤霉素(GA3)进行预处理0.5－3小时；
b、试管植株的获得：经过赤霉素预处理的胚接种到装有胚培养基：MS + 1-5 mg/L GA3+>
c、试管外植株苗体的获得：胚培养4－6周时，胚根产生较多侧根，苗高也大都在10 cm以上，此时可以进行移栽，移栽前，先把瓶盖打开，放在温度为20-25℃的散射阳光下练苗5-7天，然后把苗移到温室，用长镊子把苗从瓶中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基,移栽入装有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶1∶1，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖，目的是对刚移栽的小苗进行保湿，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，表明植株已经成活，此时可揭去塑料溥膜。
本实施例的实验结果：
无菌胚的获得
本技术采用果实果皮消毒，然后在砸核、取种胚、去种皮步聚中都采用无菌操作的方法，有效获得了无菌胚，胚污染率在5%以下。果皮消毒方法，种胚没有直接接触消毒剂，种胚没有受到消毒剂的伤害，使胚的萌发较快，培养3－5天，子叶就开始变绿。说明果皮消毒方法比常规的种胚消毒方法更有效。
胚的萌发生长
经过赤霉素预处理的胚，再接种到培养基MS + 1-5 mg/L GA3>
本技术方案在应用于另一个常规播种难出苗的油桃品种，也成功获得了胚培养植株如图2。证明了本技术方案还能应用于其他桃品种的成熟胚的培养。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第一个实施例，设置为包含有试管内培养基质和试管外育苗基质，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质、 碳源、抗氧化剂、无离子水、琼脂粉；
其中：基本培养基设置为 MS（Murashige and Skoog）培养基, MS 基本培养基组成为：
试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶0.8∶0.9。
在本实施例中，植物生长调节物质设置为赤霉素（GA3），碳源设置为蔗糖，抗氧化剂设置为半胱氨酸和抗坏血酸。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第二个实施例，试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶1.1∶1.2。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第三个实施例，试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.8-1.1∶0.9-1.2。
一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第四个实施例，试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭∶蛭石∶珍珠岩= 2∶0.95∶1.0。
本发明具有下特点：
1、由于设计了对桃树杂种的种胚进行分步试管内和试管外培育，在试管内培养基质中培育得到试管植株，在试管外育苗基质中培育得到室外正常生长的植株，不再直接种植果树种子，因此提高了杂交果树种子的发苗率。
2、由于设计了试管内培养基质，促使种胚萌发获得试管小植株。
3、由于设计了试管外育苗基质，促使苗体在试管外健壮生长。
4、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值范围的技术特征取得了很好的技术效果。
5、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用，通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具有很好的市场价值。
还有其它的与果树种子的种胚进行分步培育的相同或相近似的技术特征都是本发明的实施例之一，并且以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为满足专利法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合的实施例都进行描述。
因此在基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培育基体技术领域内，凡是包含有内层1设置为化学肥料与植物秸秆或植物叶体的高压形成的混合体的技术内容都在本发明的保护范围内。
上述实施例只是本发明所提供的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培育基体的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。
机译： 汽车空调内金属表面的微动力涂料包括基于（杂）聚硅氧烷的基体，纳米级重金属颗粒和可选的缓蚀剂
