一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基及方法

摘要

本发明涉及一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基，其特征在于，该愈伤组织诱导培养基为S培养基+2,4‑D 1mg·L

说明书

技术领域

本发明涉及松科云杉属植物体细胞胚胎发生研究领域，具体涉及一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织的培养基及诱导方法。

背景技术

松杉类针叶植物是林业生产和造林实践的重要树种，但是采用常规无性繁殖技术难以生根，致使其优良基因型的利用受到制约。于是，人们尝试通过体细胞胚胎发生技术实现针叶树的快速繁育。1985年，Hakman等首次报道采用欧洲云杉(Picea abies)的未成熟合子胚成功诱导体细胞胚形成并获得再生植株。此后，针叶树体细胞胚的诱导、成熟和植株再生过程的研究取得了很大进展，国际上普遍认为体细胞胚胎发生是针叶树良种基因型规模化扩繁的最佳途径。

青海云杉(P.crassifolia)是我国青藏高原东北边缘特有树种，属云杉属常绿针叶乔木。主要分布于祁连山区、青海(都兰以东、西倾山以北)、甘肃(河西走廊及靖远、榆中、夏河、卓尼、舟曲)、宁夏(贺兰山、六盘山)、内蒙古大青山海拔1600-3800米的地带。其材质优良、抗旱性较强，为青海东部、甘肃北部山区和祁连山区的优良造林树种，也是该地区森林演替的顶极群落和地带性植被的建群种。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种采用青海云杉 成熟合子胚诱导愈伤组织的培养基及方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下技术方案：

一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基，该愈伤组织诱导培养基为S培养基+2,4-D 1mg·L^-1+6-BA>-1+KT>-1，该培养基含34g·L^-1蔗糖，8g·L^-1琼脂，0.5g·L^-1水解酪蛋白，pH为5.8。

本发明的再一目的是公开一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：

(1)培养基配制：按S培养基配方配置基本培养基，然后添加1mg·L^-1的2,4-D、2mg·L^-1的6-BA、4mg·L^-1的KT和0.5g·L^-1的水解酪蛋白，以及34g·L^-1蔗糖和8g·L^-1琼脂，pH为5.8，分装灭菌后备用。

(2)外植体消毒：将青海云杉种子于水中浸泡10-15h后，用镊子剥去种皮；然后，用75％酒精对去皮的种子进行表面消毒；再用0.1％HgCl₂对种子深度灭菌，然后用无菌水冲洗；最后，在无菌条件下，用无菌滤纸吸干种子表面水分。

(3)种胚分离：在无菌条件下，用消过毒的尖头镊子夹掉种子胚根段的尖端部分，然后用镊子压种子中部得到种胚；

(4)接种和培养：在无菌条件下，将种胚平行接种于培养基的表面，置于25℃条件下暗培养；

(5)愈伤组织的增殖：愈伤组织形成后，将之转接于诱导培养基，进行增殖培养。

作为一种进一步的改进方案，所述步骤(2)中，将青海云杉种子于水中浸泡12h。

作为一种进一步的改进方案，所述步骤(2)中，用酒精对去皮的种子进行表面消毒的时间为5min。

作为一种进一步的改进方案，所述步骤(2)中，用无菌水冲洗5次，每次5min。

本发明公开的一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织的培养基及诱导方法，具有以下有益效果：

本发明的诱导率达80％以上，此方法可为建立稳定的青海云杉体细胞胚发生体系奠定基础，对相关科研、技术人员具有一定的参考作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基，该愈伤组织诱导培养基为S培养基+2,4-D 8mg·L^-1+6-BA>-1+KT>-1，该培养基含34g·L^-1蔗糖，8g·L^-1琼脂，0.5g·L^-1水解酪蛋白，pH为5.8。该培养基愈伤组织诱导率平均为44.4％。

实施例2

一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基，该愈伤组织诱导培养基为S培养基+2,4-D>-1+6-BA>-1+KT>-1，该培养基含34g·L^-1蔗糖，8g·L^-1琼脂，0.5g·L^-1水解酪蛋 白，pH为5.8。该培养基愈伤组织诱导率平均为51.5％。

实施例3

一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织诱导的培养基，该愈伤组织诱导培养基为S培养基+2,4-D 1mg·L^-1+6-BA>-1+KT>-1，该培养基含34g·L^-1蔗糖，8g·L^-1琼脂，0.5g·L^-1水解酪蛋白，pH为5.8。该培养基愈伤组织诱导率平均为80.1％。

一种青海云杉成熟合子胚愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：

(1)培养基配制：按S培养基配方配置基本培养基，然后添加1mg·L^-1的2,4-D、2mg·L^-1的6-BA、4mg·L^-1的KT和0.5g·L^-1的水解酪蛋白，以及34g·L^-1蔗糖和8g·L^-1琼脂，pH为5.8，分装灭菌后备用。

(2)外植体消毒：将青海云杉种子于水中浸泡10-15h后(优选12h)，用镊子剥去种皮；然后，用75％酒精对去皮的种子进行表面消毒5min；再用0.1％HgCl₂对种子深度灭菌，然后用无菌水冲洗5次，每次5min；最后，在无菌条件下，用无菌滤纸吸干种子表面水分。

(3)种胚分离：在无菌条件下，用消过毒的尖头镊子夹掉种子胚根段的尖端部分，然后用镊子压种子中部得到种胚；

(4)接种和培养：在无菌条件下，将种胚平行接种于培养基的表面，置于25℃条件下暗培养；

(5)愈伤组织的增殖：愈伤组织形成后，将之转接于诱导培养基，进行增殖培养。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，而非对其限制；应当指出，尽管参照上述各实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改和替换，并不使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。