一种同时测定小麦中抗倒酯及抗倒酸残留量的HPLC方法

摘要

本发明公开了一种同时测定小麦中抗倒酯及抗倒酸残留量的HPLC方法，将小麦样品制备好后，采用乙腈振荡提取，抽滤浓缩至近干，经酸性色谱甲醇定容后，加入硅胶和无水硫酸镁分散固相萃取净化后，涡旋，离心，过微孔滤膜，形成样品溶液；样品溶液采用带紫外检测器的高效液相色谱仪测定，色谱柱为Agilent Zorbax色谱柱，柱温为35℃，流速为0.6mL/min，进样量为20uL，流动相为甲醇和质量浓度为0.1％磷酸水溶液组成的混合溶液，甲醇和磷酸水溶液的体积比为65：35，波长为280nm，外标法定量测定抗倒酯和抗倒酸的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种农药及其代谢物残留量的分析方法，具体涉及一种利用高效液相色谱仪同时测定小麦中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量的方法。

背景技术

抗倒酯英文通用名称：trinexapac-ethyl，化学名称：4一环丙基(羟基)亚甲基一3,5一二氧代环己烷羧酸乙酯,化学分子式：C₁₃H₁₆O₅,由汽巴-嘉基公司开发而成，属环己烷羧酸类植物生长调节剂，为赤霉素生物合成抑制剂，通过降低赤霉素的含量控制植物生长。抗倒酯可被植物茎、叶迅速吸收，根部吸收很少。可在禾谷类作物、小麦、甘蔗等多种作物上使用。有文献报道于小麦分蘖末期进行叶面喷雾处理1次，有效的降低小麦株高，可防止小麦倒伏。

中国暂未制定小麦上抗倒酯和抗倒酸的最大残留限量值(MRL)，日本规定小麦上抗倒酯为0.6mg/kg，欧盟规定了大麦、黑麦和小麦上的抗倒酸为0.5mg/kg。

《分析试验室2014,33(6)》公开了用超高效液相色谱—串联质谱法同时测定小麦和土壤中抗倒酯及其代谢物残留量的方法。《Korean Journal of Environmental Agriculture2015；34(4)》公开了用超高效液相色谱—串联质谱法同时测定农产品中的抗倒酯及其代谢物抗倒酸的方法。

超高效液相色谱—串联质谱仪价格高昂，且平时维护费用较高，而高效液相色谱仪(HPLC)以其高灵敏度和高精度的技术优势，目前仍然是我国大多数实验室分析环境介质和各种作物体中抗倒酯及其代谢物残留量的首选方法，但是，国内外鲜有采用HPLC同时测定抗倒酯及其代谢物抗倒酸在小麦和土壤等基质中残留量的研究。

发明内容

本发明目的是提供一种能利用高效液相色谱仪同时测定小麦中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量的方法。

本发明提供的基于高效液相色谱仪的同时测定小麦中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量的方法,包括以下步骤：

步骤一混合标准溶液的配制及测定

分别准确称取抗倒酯和抗倒酸标准品，用色谱甲醇溶解并配制成单独标准母液，然后采用梯度稀释法分别取抗倒酯和抗倒酸标准母液配制成抗倒酯和抗倒酸的混合标准溶液，分别配制5－7档质量浓度为0.05～5.00mg/L的抗倒酯和抗倒酸的混合标准溶液，并采用外标法定量分别注入HPLC中进行测定，以各混合标准溶液抗倒酯、抗倒酸的质量浓度C为横坐标、相应的色谱峰面积A1为纵坐标分别绘制抗倒酯、抗倒酸的标准工作曲线，得到抗倒酯、抗倒酸回归方程：抗倒酯A1＝84.929C+0.3868，抗倒酸A1＝79.991C-0.4275，且回归方程的相关系数R²＞0.999>

步骤二样品前处理

将采集的小麦进行剪碎或粉碎后，形成质量为m的小麦样品；

步骤三抗倒酯和抗倒酸的提取

准确称取步骤二制备好的小麦样品置于容器中，加入乙腈使其淹没小麦样品，并用磷酸溶液调节其pH值至酸性，在30℃～35℃下振荡提取30min～60min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用乙腈分两次洗涤残渣，收集全部滤液并放在旋转蒸发仪上于45℃浓缩至近干形成小麦提取浓缩液；

步骤四小麦提取浓缩液的净化

将步骤三制备的小麦提取浓缩液用酸性色谱甲醇定容为V体积后，转入离心管中，再加入硅胶和无水硫酸镁，在涡旋混合仪上涡旋，然后在离心机上以3800r/min离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，形成样品溶液，待HPLC检测；

步骤五样品溶液中抗倒酯和抗倒酸残留量测定结果的计算

采用外标法，运用步骤一测定混合标准溶液的色谱条件对样品溶液进行HPLC测定，测得样品溶液中抗倒酯或抗倒酸的色谱峰面积A2，代入残留量计算公式，求得样品溶液中抗倒酯及其代谢物抗倒酸的质量浓度，即得样品溶液中抗倒酯及其代谢物抗倒酸的残留量，其中残留量计算公式如下：

$>X=\frac{A_2\times C\times V}{A_1\times m}$>

式中：X－样品溶液中抗倒酯或抗倒酸的残留量，mg/kg；

C－混合标准溶液中抗倒酯或抗倒酸的浓度，mg/L；

V－样品最终定容体积，ml；

A1－混合标准溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面积；

A2－样品溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面积；

m－样品质量，g。

所述小麦为小麦植株或小麦麦粒，所述小麦植株剪碎为0.5cm后形成小麦样品，所述小麦麦粒经植物粉碎机粉碎并过20目筛形成小麦样品。

所述步骤二中将乙腈淹没的小麦样品用磷酸溶液调节其pH值至3.0～3.5。

所述酸性色谱甲醇通过在每10mL色谱甲醇中加1滴分析纯磷酸而制得。

所述高效液相色谱仪为美国安捷伦公司生产的1260型高效液相色谱仪。

本发明人利用抗倒酯和抗倒酸在酸性条件下离解减弱而溶于有机溶剂的特点，对小麦麦粒和小麦植株中残留的抗倒酯和抗倒酸进行同时提取、净化并采用HPLC进行分离与检测。该方法线性相关系数均大于0.9996，最小检出量均为2.0×10^-9g,平均回收率在73.12-105.45％之间，相对标准偏差(RSD)在5.54-10.31％范围内，方法的灵敏度、准确度和精密度都符合农药残留检测的要求。

附图说明

图1抗倒酯和抗倒酸混合标准溶液(5mg/kg)的色谱分离图。

图2麦粒的空白样品色谱图。

图3麦粒添加0.50mg/kg的色谱分离图。

图4小麦植株空白样品色谱图。

图5小麦植株添加0.50mg/kg的色谱分离图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1：

(1)样品前处理

小麦植株样品：采集的小麦植株样品，经剪碎为0.5cm左右。麦粒样品：将上述采回的麦粒样品经植物粉碎机粉碎并过20目筛。

(2)抗倒酯及其代谢物抗倒酸的提取

准确称取已制备好的小麦植株(或麦粒样品)样品10.0g，置于250mL具塞三角瓶中，加入40mL乙腈，并用适量的磷酸溶液调节其pH值至酸性(pH值为3.0～3.5)，在35℃下振荡提取30min～60min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用30mL乙腈分两次洗涤残渣，收集全部滤液转入250mL磨口三角瓶中，在旋转蒸发仪(45℃)上浓缩至近干，形成提取浓缩液。

(3)提取浓缩液的净化

将提取浓缩液利用硅胶进行分散固相萃取净化，具体操作是将上述小麦植株或麦粒样品的提取浓缩液用酸性色谱甲醇(10mL色谱甲醇中加1滴分析纯的磷酸)定容至2.0mL后，转入5.0mL离心管中，再加入0.2g硅胶和0.05g无水硫酸镁，在涡旋混合仪上涡旋2min，然后在离心机上以3800r/min离心2min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，形成样品溶液，待HPLC检测。

(4)混合标准溶液的配制

分别准确称取抗倒酯(纯度为99.0％)和抗倒酸(纯度为99.0％)标准品各0.1010g，用色谱甲醇溶解并配制成质量浓度为1000.0mg/L的单独标准母液。然后采用梯度稀释法分别取抗倒酯和抗倒酸的标准母液配制成抗倒酯和抗倒酸的混合标准溶液，分别配制抗倒酯和抗倒酸的质量浓度均为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/L的混合标准溶液，并分别注入HPLC中进行测定，分别以抗倒酯、抗倒酸的质量浓度(x，mg/L)为横坐标、相应的色谱峰面积(y)为纵坐标分别绘制抗倒酯、抗倒酸的标准工作曲线，进而得到抗倒酯、抗倒酸的回归方程和相关系数如表1所示。根据信噪比RSN＝3，测得各物质的最小检出量。

表1抗倒酯和抗倒酸的回归方程、相关系数和最低检测浓度

由表1可知，各物质在一定线性范围内的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9996。同时最低检测限(最低检测浓度和最小检出量)表明，此方法可以检测到含量较低的物质。因此该方法可对样品进行准确分析且具有较高的灵敏度。

(5)高效液相色谱分析

由此确定抗倒酯和抗倒酸HPLC测定的色谱条件如下：高效液相色谱仪：1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)紫外检测器；色谱柱：Agilent Zorbax色谱柱(250mm×4.6mm，5.0um)；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：20uL；流动相为甲醇：0.1％磷酸水溶液(65：35，v/v)；波长：280nm。

在上述色谱分析条件下，标准物质抗倒酸的相对保留时间为6.9min左右，抗倒酯的相对保留时间为12.4min左右(见图1)。

(6)回收率和精密度

分别向小麦植株和麦粒样品中添加抗倒酯和抗倒酸的混合标准溶液，使抗倒酯和抗倒酸的质量浓度分别为0.10、0.50和5.00mg/kg，共3档浓度，每档浓度重复5次，用上述选定的色谱条件分析与检测测定其回收率，结果见表2。

表2抗倒酯及抗倒酸在小麦植株和麦粒中的加标回收率及其相对标准偏差(n＝5)

由此可见，本发明建立了HPLC法同时检测小麦中抗倒酯及其代谢物，该方法线性相关系数均大于0.9996，最小检出量均为2.0×10^-9g,最小检测浓度均为0.05mg/kg，平均回收率在73.12-105.45％之间，相对标准偏差(RSD)在5.54-10.31％范围内，方法的灵敏度、准确度和精密度都符合农药残留检测的要求。

(7)样品溶液中抗倒酯或抗倒酸残留量测定结果的计算

运用上述色谱条件对样品溶液进行HPLC测定，测得样品溶液中抗倒酯和抗倒酸的色谱峰面积，代入残留量计算公式，求得样品溶液中抗倒酯及其代谢物抗倒酸的质量浓度，即得样品溶液中抗倒酯及其代谢物抗倒酸的残留量。残留量计算公式如下：

$>X=\frac{A_2\times C\times V}{A_1\times m}$>

式中：X－样品溶液中抗倒酯或抗倒酸的残留量，mg/kg；

C－混合标准溶液中抗倒酯或抗倒酸的浓度，mg/L；

V－样品最终定容体积(提取浓缩液净化中的定容体积)，ml；

A1－混合标准溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面积；

A2－样品溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面积；

m－样品前处理后的样品质量，g。

(8)实际样品的测定

采用上述方法对2015年采集于湖南省长沙市东岸乡施以不同含量抗倒酯、不同施药次数的小麦植株和麦粒样品进行抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量检测，部分结果见表3-4。

表3抗倒酯在小麦麦秆和麦粒中的残留量

注：ND系指抗倒酯在麦秆和麦粒中的残留量低于其最小检测浓度(0.10mg/kg)，其中麦秆以风干麦秆重量计。

表4抗倒酸在小麦麦秆和麦粒中的残留量

注：ND系指抗倒酸在麦秆和麦粒中的残留量低于其最小检测浓度(0.10mg/kg)，其中麦秆以风干麦秆重量计。