一个簇毛麦凝集素类受体激酶基因及其表达载体和应用

摘要

本发明公开了一个簇毛麦凝集素类受体激酶基因及其表达载体和应用，属于基因工程领域。Hv-LecRK的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自二倍体簇毛麦(Haynaldia villosa,L.,2n＝2x＝14,基因组VV)，可以和白粉病抗性相关基因Hv-CMPG互作，在抗白粉病二倍体簇毛麦中受白粉菌诱导表达增强。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明Hv-LecRK基因的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。因此，Hv-LecRK可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦凝集素类受体激酶基因及其表达载体和应用。

背景技术

由专性寄生真菌小麦白粉病菌(BlumeriagraminisDCf.sp.tritici)引起的小麦白粉病是小麦(TriticumaestivumL.,2n＝6x＝42,基因组AABBDD)最严重的叶部病害之一，在中国及其他许多国家广泛发生。该病在小麦整个生育期都可发生，并且可侵害小麦地上植株各个部分，以叶片和叶鞘为主。

随着栽培品种、栽培条件以及气候条件的影响，目前我国小麦白粉病危害呈加重趋势。白粉病能用杀菌剂防治，但化学防治必然增加人力、物力投入，而且还会引起环境污染等生态问题，因此发掘抗病基因、培育抗病品种是防治小麦白粉病的有效措施。明确小麦抗白粉病的机制，克隆抗病相关基因，可以为小麦白粉病防治、小麦抗白粉病育种提供重要的理论和物质基础。

栽培小麦的亲缘物种在长期进化和自然选择过程中，保留了大量的抗病虫害、抗逆、优质等有益基因，是普通小麦品种改良的重要基因来源，因此，研究和利用亲缘物种抗病基因，是改良小麦抗病性的重要途径。

簇毛麦(HaynaldiavillosaL.,2n＝2x＝14,基因组VV,)是普通小麦的二倍体亲缘物种，具有高抗白粉病的优良性状。在研究过程中发现，来自簇毛麦的Hv-CMPG基因受白粉病诱导快速上调表达，在抗白粉病中发挥重要的正向调控作用。Hv-CMPG基因编码一个E3连接酶，参与泛素化过程，识别目标底物蛋白并对其进行泛素化修饰(HershkoA,TheUbiquitinSystem.Springer,1998)，或与底物蛋白互作或通过26S蛋白酶体将底物蛋白降解。

发明内容

本发明的目的提供一种受体蛋白激酶基因Hv-LecRK。

本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK，来自二倍体簇毛麦(Haynaldiavillosa,VV,2n＝14)，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。

该受体激酶基因编码的蛋白质Hv-LecRK，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。

含有所述的凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK的表达载体。

所述的含有权利要求1所述的凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK的表达载体优选以pBI220为出发载体，将权利要求1所述的Hv-LecRK基因插入载体pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。

所述的凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

所述的含凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果

本发明首次从簇毛麦中克隆得到了一个和白粉病抗性相关基因凝集素类受体激酶基因Hv-LecRK及其所编码的蛋白质Hv-LecRK，为簇毛麦中首次报道。将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。Hv-LecRK用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够提高小麦的白粉病抗性。

附图说明

图1Hv-LecRK基因的克隆

M：DL2000；1：Hv-LecRK基因

图2Hv-LecRK在二倍体簇毛麦白粉菌诱导后的叶片中的Q-PCR分析

X轴：0h、30min、45min、1h、2h、6h、12h、24h、48h、72h分别表示簇毛麦接白粉菌后的不同时间段；Y轴：Hv-LecRK基因在不同样品中受白粉菌诱导后的表达倍数。

图3Hv-LecRK过量表达载体构建

图4利用单细胞瞬间表达技术研究Hv-LecRK抗病效应

图5Hv-LecRK转化扬麦158T₀代植株PCR鉴定

图6Hv-LecRK转化扬麦158T₀代植株离体鉴定

具体实施方式

实施实例1Hv-LecRK基因的克隆

在本实验室前期的研究中发现Hv-CMPG基因在小麦抗白粉病中起重要作用，为更好地研究Hv-CMPG基因抗白粉病的机制，以Hv-CMPG基因为诱饵利用酵母双杂交技术，筛选酵母双杂交文库获得Hv-LecRK基因。设计引物P1：ATGGCCTTGGTCGTGTGCCCC(SEQIDNO.3)和P2：TCATCTTCCACCTGAGATGTA(SEQIDNO.4)，以簇毛麦受白粉菌诱导后24h的cDNA为模板，克隆Hv-LecRK基因，得到Hv-LecRK基因的全长，序列为SEQIDNO.1(图1)。

实施例2Hv-LecRK基因受白粉菌诱导的表达特征

将高抗白粉病的簇毛麦品系91C43(编号：PI368886，引自英国植物园)(参考文献：齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源—基因Pm21，作物学报，1995，21(3):257-262)播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵(周围用圆柱状透明塑料片隔离，顶端用滤纸封闭，形成无白粉菌的环境)。待三叶期，把在感病品种苏麦三号上培养的南京本地混合白粉菌新鲜孢子轻轻抖落在簇毛麦的幼苗上。接种白粉菌后的簇毛麦叶片保存在16℃。接种后0h、30min、45min、1h、2h、6h、12h、24h、48h、72h取样，置于－70℃冰箱内保存备用。用TRIZOL(Invitrogen)提取受白粉菌诱导的簇毛麦叶片的RNA，利用AMV酶(Takara)合成反转录第一链，得到反转录产物。

应用能扩增Hv-LecRK的特异引物P3：ACGCTTAGGGGACTTCG(SEQIDNO.5)和P4：CCTTCGCCCACAGGTTA(SEQIDNO.6)，对该基因在受白粉菌诱导样品中进行Q-PCR分析。PCR反应在Q-PCR仪(RocheLightCycler480，Roche)上扩增。20μlPCR反应体系中含2μlcDNA,10μl2×SYBREXTaqTM(TakaRa)，0.4μl引物P1(10μM)和P2(10μM)。扩增参数为：95℃5min，然后95℃10s、60℃30s，72℃15s，共41个循环。反应结束后，计算相对表达量：根据得到的CT值计算目标基因在处理后的不同时间点相对于未处理的相对表达量，即2^-△△CT。其中，△△C_T＝(C_T.Target-C_T.Tublin)_Timex-(C_T.Target-C_T.Tublin)_Time0。Timex表示任意时间点，Time0表示未处理点。结果表明，和看家基因(Tubulin)相比较，在簇毛麦叶片中Hv-LecRK受白粉菌诱导上调表达，在簇毛麦叶片受白粉菌诱导45min后表达水平达到峰值，之后开始下调，并在24h-72h维持高表达水平。Q-PCR的结果表明，Hv-LecRK可能与白粉病抗性相关(附图2)。

实施例3Hv-LecRK正义表达载体构建

利用上述经白粉菌诱导后的簇毛麦cDNA为模板，以可扩增Hv-LecRK基因蛋白编码区的引物对P3(CGGGATCCATGGCCTTGGTCGTGTGCC(SEQIDNO.5))和P4(GGGGTACCTCATCTTCCACCTGAGATG(SEQIDNO.6))进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI双酶切将扩增目标片断插入到载体pBI220(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907)的35S启动子后面的多克隆位点BamHI和KpnI之间。由此将目标基因Hv-LecRK克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:LecRK(图3)。

实施例4利用单细胞瞬间表达方法将Hv-LecRK基因转入小麦叶片

单细胞瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(公知公用,Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。本研究利用单细胞瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击Hv-LecRK细胞的白粉菌吸器指数与未轰击Hv-LecRK细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。

载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5mleppendorf管中，加入1ml70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使金粉完全沉淀。12,000rpm离心1min后弃上清。加入1mlddH₂O，涡旋混匀后，离心弃上清(重复3次)。最后加入500μl50％甘油涡旋混匀，备用。

包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg，如质粒浓度较大不够5μl的用ddH₂O稀释成5μl/1μg的浓度)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl2.5MCaCl₂，然后加入20μl0.1M亚精氨(现配先用)，涡旋3min。

静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl100％酒精，充分涡旋，以备使用。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施Hv-LecRK与GUS基因共转化时，将含有Hv-LecRK基因表达载体pBI220:LecRK的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与Hv-LecRK基因进行共转化时，Marker基因GUS转入的细胞也是Hv-LecRK转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为Hv-LecRK的表达细胞。

基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1molLNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmolLEDTA，5mmolL铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/mlX-Gluc，0.1％TritonX-100，20％甲醇，)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。

白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，细胞会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(公知公用,Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单独转化GUS基因时，感白粉病小麦品种扬麦158中的吸器指数为62.68％；当GUS基因与Hv-LecRK共转化感白粉病小麦品种扬麦158后，统计了GUS基因表达(即Hv-LecRK表达)且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当Hv-LecRK转入后，扬麦158的吸器指显著下降，平均从62.68％降到35.98％(图4)。该结果说明，Hv-LecRK的瞬间过量表达可以显著地降低吸器指数，Hv-LecRK对白粉菌具有抗病作用。

实施例5Hv-LecRK的稳定遗传转化及基因功能研究

利用基因枪介导的遗传转化方法(邢莉萍.小麦/簇毛麦抗白粉病相关基因的转化及功能鉴定[D].南京农业大学，2007)将pBI220:HvLecRK转化感病品种扬麦158的幼胚愈伤组织。挑取预培养7d的约2500个扬麦158幼胚愈伤组织，轰击前在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4–5h，将携有目的基因HvLecRK的过量表达载体pBI220:HvLecRK通过基因枪轰击法转化到扬麦158中，轰击后在高渗培养基上继续培养16h。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)，筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺lmmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT1mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+KT1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中，至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2d，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共280棵。

提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P5(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC(SEQIDNO.7))和基因内部引物P6(GAGGTAGTAGCCCGTAGGGTAGGA(SEQIDNO.8))进行PCR扩增，鉴定阳性转基因植株。PCR程序：10-50ng/ul基因组模板，10μM的P5和P6各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl2.5mM的dNTP；1.5μl25mM的Mg²⁺；0.25μl(5U/μl)Taqpolymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃45s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测，其中9株可以扩增600bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：LecRK-T₀-16-3、LecRK-T₀-19-1、LecRK-T₀-19-2、LecRK-T_0-33-5、LecRK-T₀-36-1、LecRK-T₀-37-1、LecRK-T₀-38-4、LecRK-T₀-40-4、和LecRK-T₀-55-3(图5)。

用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种，对所有PCR鉴定的T₀代阳性植株进行白粉病抗性鉴定，同时接种转基因受体品种扬麦158作为对照。抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-2级为高抗、3-4级为中抗、5级以上为感病。苗期离体抗性鉴定的两次重复结果表明：扬麦158表现为中感或高感，阳性转基因植株均表现为高抗(表1，图6)。

表1Hv-LecRK转基因T₀代植株的白粉病抗性鉴定