两种卤酚化合物在制备抗Ⅱ型糖尿病肾病药物中的应用

摘要

本发明公开了两种卤酚化合物4,5,2'‑三羟基‑2,5'‑二溴二苯甲酮和4,5,2'‑三(4‑吗啉甲酰氧基)‑2,5'‑二氯二苯甲酮的医药新用途，具体为在制备抗

说明书

技术领域

本发明属于化合物新用途领域，涉及两种具有预防和治疗II型糖尿病肾病的卤酚化合物，具体为化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)和化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)在制备抗Ⅱ型糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的主要并发症之一，最终导致肾病(end-stage renal disease,ESRD)。目前中国已有1.14亿糖尿病患者，1.4亿糖尿病前期患者，随着全球范围内的糖尿病患者的不断增加，DN的患病率也随之提高。在西方国家DN是导致ESRD的首要病因，占25％-42％，也是我国ESRD的主要病因。DN在II型糖尿病中的患病率约为20％-25％，DN可由最初出现尿蛋白到高血压、肾病综合征，最终导致肾衰和死亡。

现阶段治疗DN主要是控制血糖、降低血脂、抑制炎症、抗氧化应激，目前临床用药主要是采用血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂(ACEI/ARB)，甚至和降糖药联合用药，而ACEI/ARB的主要功能是通过降低血压和尿微量白蛋白，降低肾小球渗透压，同时改善对胰岛素利用。但是，对多数DN患者，特别是DN IV期以后的患者，应用ACEI/ARB类药物以后多会出现电解质紊乱，易合并高血钾症，同时有引起干咳、体位性低血压等副作用。因此，目前临床上针对该疾病还没有特别有效和特异性的药物，鉴于DN的危险性，寻找合适的治疗药物已成为当下医药界的热点研究方向。

DN的发病机制主要有高糖、肾脏血流动力学异常、血脂代谢紊乱、微血管炎症、氧化应激及遗传因素等。而卤酚化合物2',4,5-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)及其可药用盐和2',4,5-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)及其可药用盐为课题组自主设计合成，具有很强的降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等作用。其活性多样性特别是与DN的发病机制多重契合，具有很好的开发应用前景。

但是到目前为止，对于化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮和化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮的抗Ⅱ型糖尿病肾病的药理作用国内外尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)和化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)的新的药理用途，具体为在制备抗Ⅱ型糖尿病肾病药物中的应用。

本发明的另一个目的在于一种新的抗Ⅱ型糖尿病肾病的药物，该药物以化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮，或者是化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮为活性成分，并且该药物中还包括与所述活性成分组合使用的普通药用载体或赋形剂。该药物能够根据不同的要求制成注射剂、片剂、滴丸剂、固体分散体或胶囊剂等常用制剂。

本发明系首次发现两种卤酚化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)和4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)具有显著的抗Ⅱ型糖尿病肾病的药理活性，具有很好的开发应用价值。

其中，化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)的结构式如下：

化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)的结构式如下：

所述的化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)和化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)都是本领域技术人员所熟知的两种卤酚化合物，其制备方法也是容易实现的。

本发明通过建立SD大鼠II型糖尿病肾病模型，灌胃给予不同剂量两种化合物的固体分散体，期间对血糖、血脂、尿量、尿液、肾功能及炎症因子等相关的各项指标进行监测，证实两种化合物对II糖尿病肾病大鼠具有很强的肾脏保护作用，显示了在预防和治疗糖尿病肾病方面重要的应用前景。

本发明的主要创新点在于：(1)卤酚化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮(LM49)及其可药用盐和4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮(A8)及其可药用盐为申请人自主创制，具有很强的降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等作用，其活性多样性与DN的发病机制多重契合。(2)两种化合物以固体分散体给药均能有效改善Ⅱ型糖尿病肾病大鼠的肾功能，其主要治疗指标尿酸、尿蛋白、尿微量白蛋白、生长转化因子TGF-β1、血糖、低密度脂蛋白等优于目前临床一线药物卡托普利。

附图说明

图1为苏木精-伊红(HE)染色，电镜下观察，各组大鼠肾脏病理学比较(HE×200)；

图2为Masson染色，电镜下观察，各组大鼠肾脏病理学比较(Masson×400)。

具体实施方式

化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮和化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮在制备抗Ⅱ型糖尿病肾病药物中的应用。

一种抗Ⅱ型糖尿病肾病的药物，其活性成分为化合物4,5,2'-三羟基-2,5'-二溴二苯甲酮，或者是化合物4,5,2'-三(4-吗啉甲酰氧基)-2,5'-二氯二苯甲酮。该药物中还包括与所述活性成分组合使用的普通药用载体或赋形剂。该药物可根据具体要求制成注射剂、片剂、滴丸剂、固体分散体或胶囊剂等常用剂型。

以下通过具体的实验实施例来对本发明中的两种卤酚化合物具有抗II型糖尿病肾病的功能作进一步的阐述，需要说明的是以下的实施例都为说明性的，并不对本发明做任何限定。

材料

实验动物：

雄性SD大鼠，体重180～220g，动物来源：中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK-(京)2014－0013，合格证号：11400500008465，本试验所用动物及相关处置符合动物福利的要求，实验开展前要经过本机构动物福利委员会的伦理审查。

饲料：

高糖高脂饲料配方：10％猪油，20％蔗糖，2.5％胆固醇，0.5％胆酸钠，67％基础料。饲料来源：北京科澳协力饲料有限公司，许可证号：SCXK-(京)2014－0010，合格证号：11002900016120。

药品与试剂：

LM49(由山西医科大药物化学实验室制备，纯度≥99.5％，批号为20150320)；A8(由山西医科大药物化学实验室制备，纯度≥99.5％，批号为20150112)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)(USP26，江阴嘉丰化工有限公司)；吐温80(药用级，四川金山制药有限公司)；无水乙醇(分析纯，北京化学试剂公司)；卡托普利(上海旭东海普药业有限公司，生产批号140603)；链脲佐菌素(Sigma，生产批号1126C038)；大鼠白细胞介素-1β酶联免疫检测试剂盒(南京建成，批号1501261)；大鼠白细胞介素-6酶联免疫检测试剂盒(南京建成，批号1412271)；大鼠微量白蛋白(Alb)酶联免疫检测试剂盒(南京建成，批号1506201)；大鼠可溶性细胞间黏附分子(sICAM-1)检测试剂盒(南京建成，批号1501201)；大鼠白肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫检测试剂盒(南京建成，批号1507281)；大鼠白血管内皮细胞黏附分子(sVCAM-1)酶联免疫检测试剂盒(南京建成，批号1508221)；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成，批号20151010)；BCA蛋白定量试剂盒(博士德生物，批号10K12B46)；尿素(BUN)试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司，批号P1311021)；尿酸(UA)试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司，批号PF1405011)；肌酐(CREA)试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司，批号D1404063)；临床化学综合质控血清(上海复星长征医学科学有限公司，批号842UN)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成，批号20150126)；大鼠核转录因子(NF-κB)酶联免疫试剂盒(南京建成，批号1507251)；SOD试剂盒(WST-1法，南京建成，批号20150127)；Masson染液(南京建成，批号20150915)。

仪器：

恒温水浴锅(上海和呈仪器制造有限公司)；BP-121S电子天平(上海精密科学仪器公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；血糖仪(美国强生)；酶标仪(Rayto,RT-6100)；低速自动平衡离心机(河北省安新县白洋离心机厂)；超低温冰箱(Haier)；Konelab Prime 30全自动生化分析仪(美国Thermo)。

固体分散体的制备：

采用溶剂法制备：按LM49、PVPK30、tween80的质量比为1:5:1和A8、PVPK30、tween80的质量比为1:4:1，分别精密称取各药，用适量无水乙醇溶解，不断搅拌混合均匀，置于60℃水浴上蒸发除去无水乙醇，得到粘稠状物，置于-20℃冰箱中冷冻2h，取出置于真空干燥箱中干燥24h，待脆化后粉碎过80目筛，置于干燥器中保存备用。

糖尿病肾病动物模型制备：

健康成年雄性SD大鼠(180-220g)高糖高脂饲料喂食4周，隔夜禁食，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40mg/kg，正常组注射同体积的柠檬酸钠缓冲液，72h后，禁食12h，测造模大鼠空腹血糖，连续3次空腹血糖>16.7mmol/L认为糖尿病造模成功。造模成功后的大鼠，给药期间继续喂食高脂饲料，正常组喂普通饲料。

给药6周后，用代谢笼收集6h尿。

禁食过夜，腹腔麻醉，抽取腹主动脉血检测相关指标。用生理盐水将肾洗净，记录双肾重量，计算肾脏系数(双肾重量/体重)。纵切取左侧肾的同一部位肾组织(包括肾小球和肾小管)浸入10％中性福尔马林中用于病理形态学分析。另一部分用于生化指标检测，右侧肾用于机制研究，储存在-80℃冰箱中。

组别及剂量设计：

造模成功后，除正常组(10只)外，其它动物随机分为8组，每组12只。分为模型组、LM49固体分散体低剂量组(含药量为3mg/kg)、LM49固体分散体中剂量组(含药量为9mg/kg)、LM49固体分散体高剂量组(含药量为27mg/kg)、A8固体分散体低剂量组(含药量为3mg/kg)、A8固体分散体中剂量组(含药量为9mg/kg)、A8固体分散体高剂量组(含药量为27mg/kg)、卡托普利对照组(含药量为15mg/kg)。

给药方法：

给药途径：灌胃。

给药体积：正常对照组和模型组给予生理盐水1.0ml/100g，阳性对照，LM49固体分散体高、中、低剂量组，A8固体分散体高、中、低剂量组分别给予不同浓度的药物，给药体积为1.0ml/100g。

药物配制：固体分散体用生理盐水溶解，阳性对照用0.5％CMC-Na混悬给药。

给药时间：于造模结束开始给药。

给药频次：每周给药7天，共给药6周。

统计学方法：

运用IBM SPSS Statistics 20软件进行数据处理，数据以表示，各组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，根据方差齐性检验结果，如方差齐采用LSD检验，如方差不齐采用Dunnett's T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果与分析：

1、LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响

表1 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05

表2 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠尿酸及生长转化因子的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

表3 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠尿液中尿蛋白及微量白蛋白的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

2、LM49、A8对糖尿病肾病大鼠血清中血糖水平的影响

表4 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠血清中血糖的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

3、LM49、A8对糖尿病肾病大鼠血清中胆固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平的影响

表5 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠血清中清中胆固醇及甘油三酯水平的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

表6 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠血清中HDL-C,LDL-C水平的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

4、LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾组织中炎症因子的影响

表7 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾组织中炎症因子TNF-α,NF-κB及粘附分子ICAM-1的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

表8 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾组织中炎症因子IL-1β,IL-6及粘附分子VCAM-1的影响(n＝6)

注：与正常注比较，^##P<0.01,^##P<0.05；与模型组比较，^□□P<0.01，^□P<0.05；与低剂量组比较，^▲▲P<0.01，^▲P<0.05；与中剂量组比较，^○○P<0.01，^○P<0.05；与卡普利组比较，^●●P<0.01，^●P<0.05

5、LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾组织中氧化因子的影响

表9 LM49、A8对糖尿病肾病大鼠肾组织中氧化因子的影响(n＝6)

上述研究表明LM49有明确的抗大鼠糖尿病肾病作用，可有效减轻肾组织病变，能显著降低大鼠血清中尿酸、血糖、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白水平，及肾组织中生长转化因子、尿蛋白和尿微量白蛋白水平，显著抑制肾组织中TNF-α、NF-κB、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达，降低肾小管水样病变、肾小球纤维化水平。同时上述结果也表明，LM49有很强的抗大鼠糖尿病肾病作用，其主要治疗指标尿酸、尿蛋白、尿微量白蛋白、生长转化因子TGF-β1、血糖、低密度脂蛋白等优于目前临床一线药物卡托普利，显示了重要的应用前景。

A8有更强的抗大鼠糖尿病肾病作用，可有效减轻肾组织病变，能显著降低大鼠血清中尿酸、糖化血红蛋白、血糖、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白水平及肾组织中生长转化因子、尿蛋白和尿微量白蛋白水平，显著抑制肾组织中TNF-α、NF-κB、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达，降低肾小管水样病变、肾小球纤维化水平。同时上述结果表明，A8有很强的抗大鼠糖尿病肾病作用，其主要治疗指标肾脏指数、尿酸、尿蛋白、尿微量白蛋白、生长转化因子TGF-β1、血糖、低密度脂蛋白等明显优于目前临床一线药物卡托普利，显示了重要的应用前景。

结论：

通过上述实验可以说明化合物LM49和A8具有明确的抗Ⅱ型糖尿病肾病的功能。尤其是高剂量组效果更显著，化合物A8比LM49具有更高的抗Ⅱ型糖尿病肾病活性，显示了很好的应用开发前景。