转基因抗虫玉米HGK60外源插入片段的旁侧序列及其检测方法

摘要

本发明涉及转基因抗虫玉米HGK60外源插入片段的旁侧序列及其检测方法，属于生物技术领域。本发明构建了含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体pmAhG2，得到了转有Bt cry1Ah基因的转玉米植株，筛选到一个抗玉米螟效果显著的转基因事件HGK60；HGK60玉米事件在其基因组第一号染色体上包含有插入基因序列及在玉米基因组的5’侧翼序列和3’侧翼序列，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。可以根据导入玉米的插入序列和侧翼序列的结合区DNA设计引物，特异性地定性、定量检测HGK60事件。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及转基因抗虫玉米植物的检测。

背景技术

玉米(ZeamaysL.)是重要的粮食作物、饲料和工业原料，在国民经济中起着十分 重要的作用。虫害一直是制约玉米产量的重要因素之一，全球范围内玉米害虫约350种，其 中以鳞翅目玉米螟危害最为严重，分布最广。在我国玉米螟危害从北向南一年可发生1～7 代，一般年份春玉米受到玉米螟的危害可造成玉米减产10％左右，大发生年所造成的产量 损失严重时可达30％以上。同时鳞翅目害虫对玉米穗发生侵害时，会产生真菌毒素，对牲畜 的健康造成很多不良的影响，并且该毒素被怀疑可导致癌症。因此，有效地防治虫害对我国 乃至全世界的农业生产具有非常重要的意义。

传统的病虫害防治方法主要包括化学防治和生物防治。化学防治杀虫谱广，见效 快，应急性强，操作方便，但长期喷洒会导致严重的生态问题，包括害虫产生抗药性，对环境 造成污染，对人体健康造成严重危害，毒害害虫的天敌及有益的昆虫等诸多弊端。生物防治 是从生态角度寻求的一种方法，相对安全，减轻了环境污染，但其见效慢，受环境影响较大。 抗虫转基因技术的发展对植物自身抗虫性的提高有十分重要的意义，为虫害的防治提供了 一条新的途径。自1996年第一例转Bt基因抗虫玉米在美国被批准商业化种植以来，全球抗 虫转基因玉米的种植面积逐年增加。

转Bt基因抗虫玉米的研发工作，在国外起步较早并且发展十分迅猛，如孟山都公 司推出的“MON810”抗虫玉米和Syngenta公司推出的“Bt176”和“Bt11”抗虫玉米已产业化推 广，它们都是以玉米螟为防治对象的转Btcry1Ab基因的抗虫玉米；随后迪卡公司推出了转 Btcry1Ac基因抗虫玉米“DBT418”，AventisCropScience公司和杜邦先锋公司分别推出了 转Btcry9C基因抗虫玉米“CBH351”和转Btcry1F基因抗虫玉米“TC1507”，其防治对象主要 是玉米螟。国内的抗虫玉米研究起步比较晚，发展也相对比较缓慢，到目前为止尚无产业化 的转Bt基因的抗虫玉米品种。丁群星等和王国英等(丁群星等，中国科学B辑，1993，23(7)： 707-713；王国英等，中国科学B辑，1995，25(1)：71-76)分别利用子房注射法和基因枪轰击 法将Bt基因导入玉米中，获得了转Bt基因再生玉米植株；王罡和杜娟(王罡等，玉米科学， 2002，10(1)：36-37)用花粉管道法将Bt基因导入玉米进行研究并获得了转基因植株；朱常 香等(朱常香等，山东农业大学学报：自然科学版，2002，33(2)：120-125)采用共转化法将Bt cry1Ab基因和bar基因转入玉米幼胚中，部分转基因植株对玉米螟表现出一定的抗性。

Btcry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所张杰研究员课题组是从国内苏 云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)菌株BT8中分离克隆的一个新型杀虫蛋白基 因(专利号：200410009918)。该基因的编码区为3549bps，编码1182个氨基酸，分子量为 134kDa。Cry1Ah蛋白对鳞翅目害虫具有高毒力，对棉铃虫、水稻二化螟的杀虫活性强于 Cry1Ac蛋白；对亚洲玉米螟的杀虫活性强于Cry1Ac、Cry1Ab蛋白。对Cry1Ah活性区的研究表 明，自ATG至2001bp共667个氨基酸的多肽片段(65kDa)同样具有高毒力，是活性必需区段， 对玉米螟、棉铃虫、小菜蛾和二化螟的杀虫活性与全长Cry1Ah蛋白相当(Xueetal，FEMS microbiologyletters,2008，280(1):95-101)。

国内已有将cry1Ah基因单独转化玉米或者和其他基因组合转化玉米的应用，如孙 鹤等(JournalofIntegrativeAgriculture2015,14(2):305-313)、李秀影等(Journal ofIntegrativeAgriculture，2014,13(5):937-944)、戴军等(生物技术通报，2014，5：62- 68)、赫福霞等(作物杂志，2012，6：29～33)、杨召军等(中国农业科技导报，2012，14(4)：39- 45)、李圣彦等(中国农业科技导报，2011，13(6):20～26)、岳同卿等(农业生物技术学报， 2010，18(4)：638-644))、王悦冰等(ChineseScienceBulletin，2008，53(2)：3185-3190)。 在前面所述的文献中，虽然转化的都是Btcry1Ah基因，但是由于影响基因表达的因素也包 括启动子、调控序列、基因的不同密码子优化形式、筛选标记基因以及不同的转化方式，产 生的转基因材料各不相同，外源基因的表达水平也存在很大差别，外源基因插入到玉米的 基因组上的位置也各不相同。由于外源基因整合到玉米基因组上的位置会影响外源基因的 表达，若想获得表达量高、抗虫效果好的转基因植株，需要从大量转化事件中筛选，并经过 多代的遗传稳定性检测，才可以获得有产业化前景的抗虫玉米，同时，转基因玉米事件插入 玉米基因组的边界序列可作为该转基因材料的身份标签，在染色体的一个插入位点可作为 一个独立的转化事件，可以利用特异性引物检测出来。本发明获得的转基因玉米是一个新 型的转化事件，其插入玉米基因组中的位置与其他转基因事件不同，其边界序列可作为身 份标签做特异性鉴定。

发明内容

本发明构建了含有Btcry1Ah基因的植物表达载体pmAhG2，得到了转有Btcry1Ah 基因的转玉米植株，筛选到一个抗玉米螟效果显著的转基因事件HGK60；通过染色体步移的 方法获得了其5’端边界序列和3’端边界序列，两端的边界序列可以作为本转化事件的特异 检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件HGK60特异性检测，并应用于检 测试剂盒的开发。

转基因抗虫玉米HGK60外源插入片段的3’端旁侧DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。

转基因抗虫玉米HGK60外源插入片段的5’端旁侧DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示。

用于检测上述的3’端旁侧DNA的特异性引物，其核苷酸序列如下：

3’F：GCATGTCTATTACGCAAAGGTC，

3’R：GGTCTCAGGCATTCGCATTCAG。

用于检测上述的5’端旁侧DNA的特异性引物，其核苷酸序列如下：

5’F:CGAAACAAGAAAAATGTTTCCTTAG，

5’R:GTGCGCGCTAGCTGGCGTGTT。

转基因抗虫玉米HGK60的PCR检测方法，其特征在于：其PCR引物为上述的特异性引 物。

所述特异性引物为：

3’F：GCATGTCTATTACGCAAAGGTC，

3’R：GGTCTCAGGCATTCGCATTCAG，

所述PCR反应得到的片段大小为1124bp。

所述特异性引物为：

5’F:CGAAACAAGAAAAATGTTTCCTTAG，

5’R:GTGCGCGCTAGCTGGCGTGTT，

所述PCR反应得到的片段大小为628bp。

上述的特异性引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。

一种检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求4或5所述的特异性引物。

上述旁侧DNA、或者特异性引物、检测试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

本发明将载体pmAhG2(结构见图1)通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴 定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用 侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用 灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至 恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛 选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基 上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并 转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养 基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培 养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室大地，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗 散粉后进行授粉，并收获果实。

种植转基因玉米于大田，在玉米长至六叶期时人工接玉米螟初孵幼虫，转基因玉 米HGK60(保藏编号CGMCCNo.12264)没有受到玉米螟危害，抗玉米螟效果显著，通过染色体 步移的方法获得了其5’端边界序列和3’端边界序列，两端的边界序列可以作为本转化事件 的特异检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件HGK60特异性检测，并应 用于检测试剂盒的开发。

转基因玉米HGK60，分类命名为玉米，Zeamays

保藏号为CGMCCNo.12264

保藏日期：2016年3月29日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101

附图说明：

图1用于玉米转化的植物表达载体pmAhG2示意图

图2玉米转化植株的PCR检测结果，其中M为DM5000DNAMarker；1是阳性对照，以 质粒pMAhG2为模板扩增产物；2为非转基因植株；3是空白对照，以水为模板扩增产物；4-6是 以转基因玉米基因组DNA为模板扩增的产物。

图3插入片段酶切位点示意图B：BamHI；H：HindIII；S：SacI

图4转基因玉米HGK60的southernblot杂交结果，CK+含cry1Ah基因片段； sample1、sample2和sample3为HGK60事件三个不同植株，分别以BamHⅠ、HindⅢ和SacⅠ酶切， ck-是非转基因玉米以HindⅢ酶切

图5转基因玉米HGK60田间抗虫性鉴定，左：转基因植株；右：非转基因植株

图6转基因玉米HGK60外源插入片段示意图

图7染色体步移方法检测左侧翼序列，M为DNAMarker；1为第2轮PCR结果，2为第三 轮PCR结果

图8插入片段5’端边界序列检测PCR图，M为DNAMarker；1、2为PCR扩增产物

图9插入片段3’端边界序列PCR图，M为DNAMarker；1、2为PCR扩增产物

图10插入片段3’端边界序列PCR图，M为DNAMarker；1为阴性对照；2-4为PCR扩增 产物

图11插入片段在玉米基因组中的位置

具体实施方式

实施例1、转基因玉米事件HGK60的获得

1、用于玉米转化的植物表达载体的构建

本研究的植物表达载体为pmAhG2(保存于中国农业科学院生物技术研究所)，图谱 见图1。植物表达载体的骨架为pCAMBIA3300，在载体的多克隆插入来自玉米泛素蛋白的 ubiquitin启动子、改造的Btcry1Ah基因(专利号：ZL200410009918.9，见SEQIDNO：3) 和NOS终止子，同时插入的筛选标记基因是G2-aroA基因，G2-aroA基因是从长期草甘膦污染 的土壤中分离的一株草甘膦高耐受性菌株——荧光假单胞杆菌G2菌株中克隆的编码EPSPS 酶(专利号：ZL03826892.2)，G2-aroA基因由玉米ubiquitin启动子驱动，终止子为NOS， 筛选标记基因表达盒与Btcry1Ah基因表达盒相连，共同插入到骨架载体pCAMBIA3300构建 得到pmAhG2(见SEQIDNO：4)。

2、农杆菌转化玉米幼胚获得转化植株

将载体pmAhG2通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的 1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一 次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干， 放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上 培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培 养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化， 见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生 培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生 根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后， 待转化苗生长状态良好后转移至温室大地，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行 授粉，并收获果实。参照(FrameBR，PlantPhysiology，2002，129:13-22)

培养基为侵染培养液：N6盐和N6维生素(Chu等，ScienceSinica，1975，18:659- 668)，1.5mg/L2,4-D，0.7/Lg脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖(pH5.2)，过滤灭菌，于4 ℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(AS)，终浓度为100μM；

共培养培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L 植物凝胶(pH5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的 AS，300mg/L的半胱氨酸；

恢复培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/L MES，4g/L植物凝胶(pH5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银和 200mg/L的羧苄青霉素；

筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mM草胺膦；

再生培养基：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶(pH5.8)， 高压灭菌。

3、转化植株的PCR检测

3.1玉米基因组DNA的小量提取(试剂盒购自北京普博欣生物公司)：

(1)取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。

(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl65℃预热缓冲液GP1的离心管中 (实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放 在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。

(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2， 充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7.

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，加入40μlddH₂O洗脱DNA。

3.2扩增cry1Ah基因片段用引物：

m4Ah1：5'-GCATCTCCACCTACACCGACTA-3'

m4Ah2：5'-CGGCTGGAATCTGGGTAATC-3'

目的片段大小：831bp

3.3PCR反应体系如下：

扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火40s，72℃延伸50s，

扩增循环数为35；最后72℃延伸10min。

PCR检测阳性植株为转基因植株，检测结果见图2。

4、转基因植株的southernblot检测

4.1玉米基因组DNA的大量提取：

CTAB法略改进：

(1)称取5g叶片，液氮充分研磨成粉(勿使材料融化)后加入50mL的离心管中；

(2)加入15mL2×CTAB缓冲液((Tris100mM，NaCl1.4M，20mMEDTA，2％CTAB， 0.1％巯基乙醇)充分混匀，65℃进行水浴1小时；

(3)冷却至室温后，加入15mL的氯仿/异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀至乳浊液，室温 下放置15～60分钟；

(4)室温下12,000rpm离心15min；

(5)将上清液转入到干净离心管后，加入2/3体积的异丙醇，上下颠倒数次，挑出 DNA，放入干净的1.5mL离心管；

(6)将DNA用70％乙醇清洗2次，空气干燥1小时；

(7)500μlTE溶解DNA后，再加入5μlRNaseA(10mg/mL)，在4℃过夜溶解或37℃1 小时溶解；

(8)加入500μl苯酚，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离 心管；(9)分别加入250μl苯酚和氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至 另一离心管；

(10)加入500μl氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至10mL离 心管中；

(11)加TE至3mL，然后加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积3MNaAc，上下颠倒数 次；

(12)将沉淀出的DNA用70％乙醇清洗2次；转移DNA至1.5mL离心管，空气干燥并溶 于500μlTE，DNA定量，备用。

4.2基因组DNA小量酶切的预实验：

混匀后，于37℃酶切2～3hr；酶切反应物在0.7％琼脂糖上电泳分离，检查酶切效 果。

4.3基因组DNA的大量酶切：

基因组DNA100μg

酶(10U/μL)5μL

(本实验选用BamHⅠ、HindⅢ和SacⅠ酶切)

10×Buffer40μL

Total400μL

混匀后于37℃酶切10hr；取2μl酶切产物进行电泳分离，检查酶切效果；酶切完全 后，对酶切产物进行沉淀，加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，混匀 后，于-20℃放置2hr；于12,000rpm，4℃离心20min，弃上清，往沉淀中加入1ml70％乙醇， 12,000rpm离心2min弃上清,沉淀吹干后溶于30μlddH₂O中备用。

4.4Southernblot杂交

(1)制备0.7％的琼脂糖凝胶，在30μl基因组DNA酶切产物中加入6μl6×loading buffer进行电泳分离，上样后静置10min，开始时采用低电压，待溴酚蓝跑出加样孔2～3cm 后，加大电压至50V，电泳5～6小时；

(2)电泳结束后，依次对凝胶进行如下处理：0.125M盐酸中浸泡胶10min，凝胶中溴 酚蓝变为黄色；蒸馏水处理凝胶5min；中和液中浸泡胶30min；

(3)采用毛细管转移方法将DNA转移至尼龙膜(具体操作见《分子克隆》实验手册)；

(4)转膜结束后6XSSC浸泡尼龙膜5min，将尼龙膜置超净台内吹干或室温晾干；

(5)80℃，烘膜2hr，固定DNA样品；

(6)标记探针：按照试剂盒中探针制备的方法进行，以质粒pmAhG2为模板，m4Ah1、 m4Ah2为引物，PCR程序同上述检测程序，探针大小为831bp，测定探针浓度；

(7)预杂交：用镊子小心将尼龙膜装入杂交管中，小心操作不要产生气泡，然后加 入42℃预热的DIGEasyHyb杂交液(地高辛标记和检测试剂盒Ⅱ和PCR地高辛探针合成试 剂盒购自Roche公司)10mL，42℃预杂交3h；

(8)杂交：首先进行探针的处理，将标记的探针于99℃变性6min，立即放于冰中冷 却2min。取7mLDIGEasyHyb杂交液，加入处理过的探针(25ng/mlHyb杂交液)，轻轻混匀 小心不要产生气泡，放入杂交炉中，42℃杂交16～20h；

(9)洗膜：先用50mL的2×SSC，0.1％SDS溶液室温下洗涤两次，每次15min。然后用 0.5×SSC，0.1％SDS溶液50mL65℃洗涤两次，每次30min。用镊子将膜小心取出转入装有 50mLWashingbuffer的平皿中振荡洗涤1～5min；

(10)用100ml1×Blockingsolution室温孵育60min；

(11)用20mlAntibodysolution孵育30min；

(12)用50mlWashingbuffer洗涤2次，每次30min；

(13)在20mlDetectionbuffer中平衡2～5min；

(14)用镊子将膜平放于两层保鲜膜之间，先将上层保鲜膜提起，然后加入1ml CSPD底物，从一端缓慢放下上层保鲜膜，使底物均匀地覆盖在膜的表面，于室温静置5min；

(15)用玻璃棒赶出多余液体，用滤纸吸干膜外的底物，37℃孵育10min；

(16)将封好的尼龙膜至于相夹中，在暗室中用X光片压片并进行曝光、显影、定影。

5、转基因植株的抗虫性鉴定

(1)玉米植株生长至6～8片叶时，将玉米螟初孵幼虫接在玉米心叶中，每株接40～ 60头玉米螟初孵幼虫，接虫2周后调查食叶级别。

(2)抗虫性标准采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准：

1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。

4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。

7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。

(3)抗性级别分类：1～2.9级(高抗)，3～4.9级(抗虫)，5～6.9级(感虫)，7～9级 (高感)。同时选择非转基因玉米作为阴性对照，接虫方法与转基因材料完全相同。2周后，统 计玉米植株受玉米螟危害情况：在检测的442株转基因植株中，有1-4.9级的转基因植株139 株，5-6.9级的有35株，7-9级的植株有268株，其中有一株只有针尖大小的虫孔，并且在茎秆 和花穗均没有玉米螟危害，该植株为HGK60(图5)。

实施例2、转基因玉米事件HGK60的外源基因插入位点分析

根据转基因玉米事件HGK60的Southernblot结果进行分析：如图3所示的载体酶 切位点，在插入表达盒中有3个BamHⅠ酶切位点，以大小为831bp的地高辛标记的m4-cry1Ah 基因片段作为探针1进行杂交时，无论外源片段有几个拷贝插入，都会杂交获得1条大小为 4.6Kb的片段(图4)，3个样品表现出相同的杂交条带；在插入表达盒中有1个HindⅢ酶切位 点，3个SacⅠ酶切位点，这些酶切位点均位于cry1Ah基因3’端，不会影响对cry1Ah基因拷贝 数的鉴定，结果是HindⅢ、SacⅠ酶切产物都杂交出2个条带(图4)，证明是两个拷贝的插入。

通过Southernblot分析，cry1Ah基因在HGK60事件中是以两个拷贝插入，为了验 证外源基因插入是单位点插入还是双位点插入，将HGK60事件与郑58自交系杂交，检测子一 代外源基因分离比，在检测的255个后代中，有128个阳性植株，阳性植株和阴性植株的比例 是1：1，初步证明外源基因插入在同一染色体上。按照插入片段的不同插入形式(头对头，尾 对尾，头对尾和尾对头)设计引物，以HGK60玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增。

检测引物：

G2fprimer：5’-TCCTCGCAGCCTTCAACAATACTCCC

1Ahrprimer：5’-GCACGAACTCGGAGAGCAGAAACT

PCR反应体系如下：

反应条件：

94℃，2min；98℃，10s，55.7℃，30s，68℃，2min，30个循环；72℃，10min

PCR产物测序结果表明插入的两个拷贝是以尾对头的方式反向插入到玉米基因组 中的，示意图见图5，外源基因是单位点插入。

实施例3通过染色体步移获得转基因事件HGK60的5’端和3’端旁侧序列

插入到玉米基因组的外源片段如图6所示，两个拷贝的改造的cry1Ah基因和改造 的G2-aroA标记基因串联在一起反向插入到玉米染色体上，因为ubiquitin启动子是来自玉 米泛素蛋白基因，玉米基因组中含有该基因，所以用染色体步移方法不易获得侧翼序列，因 此从G2-aroA基因开始设计引物，从G2-aroA的5’端往3’端扩增。

特异性引物设计如下：

SP1：TCCTCGCAGCCTTCAACAATACTCCC(位于G2-aroA基因上)

SP2：GGTCTCAGGCATTCGCATTCAG(位于G2-aroA基因上)

SP3：AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGA(位于nos上)

染色体步移试剂盒购自TaKaRa公司(GenomeWalkingKit)，试剂盒里有4种简并 引物，用SP1、SP2分别和4种简并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)进行2轮扩增，根据扩增效果，最后 选择了AP4引物，用AP4引物与SP3进行了第三轮的扩增，得到的条带送去测序。

(1)1stPCR反应

以SP1为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，以AP1为例，进行1stPCR反应。 反应体系：

反应条件：

(2)2ndPCR反应

取第一轮PCR反应产物5μl电泳，根据第一轮电泳条带亮度选择稀释倍数。取1μL稀 释产物作为模板进行第2轮反应，以SP2为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，进行2nd PCR反应。

反应体系：

反应条件：

(3)3rdPCR反应

取1μl第二轮PCR反应产物作为模板，以SP3为上游引物，AP4为下游引物，进行3rd PCR反应。

反应体系：

反应条件：

(4)取2nd和3rdPCR反应产物各5μl，1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图见图7，第 三轮PCR产物测序，测序结果为载体序列和玉米基因组序列，获得的玉米基因组序列通过 MaizeGDB数据库检索，位于玉米第一号染色体上。获得序列为插入片段的3’端侧翼序列，见 SEQIDNO：1。

(5)插入片段的5’端侧翼序列的获得

由于在插入片段的3’端是ubiquitin启动子序列，在玉米基因组中也存在着相同 序列，利用染色体步移的方法很难获得边界序列，根据已经获得的3’侧翼序列，检索已知的 玉米基因组序列，在载体的cry1Ah基因内部和推测的5’侧翼序列设计特异性引物进行PCR 扩增。

特异性引物：

AhF:GCACGAACTCGGAGAGCAGAAACT(cry1Ah基因内)

GR1:GAGCACGACAACGAGACAGA(玉米基因组上)

反应体系：

反应条件：

PCR产物测序。电泳结果见图8。

测序结果表明在驱动cry1Ah基因的ubiquitin启动子5’端缺失了352bp，由于外源 片段的插入，玉米基因组中有27bp缺失，两个拷贝插入正好反向插入到缺失27bp的玉米基 因组中，插入序列的5’侧翼序列见SEQIDNO：2。

图11为插入片段在玉米基因组中的位置。

实施例4、转基因玉米事件HGK60旁侧序列的应用

为了检测转基因玉米事件，设计特异性引物检测转基因玉米HGK60事件，按照3’端 侧翼序列和插入片段序列设计引物如下：

3’F：GCATGTCTATTACGCAAAGGTC(插入片段3’端)

3’R：GGTCTCAGGCATTCGCATTCAG(G2-aroA基因)

片段大小1124bp

反应体系：

反应条件：

PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图9，可扩增出1124bp的条带。

插入片段5’侧翼序列特异性引物

5’F:CGAAACAAGAAAAATGTTTCCTTAG(Ubi启动子)

5’R:GTGCGCGCTAGCTGGCGTGTT(插入片段5’端)

扩增条带大小为628bp

反应体系：

反应条件：

PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图10，可扩增出628bp的条带。 同时，因为本研究的转基因事件的插入位点是特异性的，可以利用5’侧翼序列与载体序列和3’ 侧翼序列与载体序列设计特异性引物检测该转化事件，并利用特异性引物开发检测试剂盒。