声明
第一章 文献综述
1.1 几丁质简述
1.2 几丁质酶简述
1.2.1 昆虫几丁质酶分类及其功能
1.3 几丁质酶抑制剂及其功能
1.3.1 几丁质酶抑制剂的分类
1.4 玉米黏虫及其防治方法
1.5 RNAi的发现
1.6 昆虫不同RNAi途径与机制
1.6.1 siRNA途径
1.6.2 miRNA途径
1.7 人工miRNA的概述
1.8 RNAi途径中的关键蛋白
1.9 RNA干扰信号在昆虫体内的传递
1.9.1 显微注射法
1.9.2 口服饲喂递送法
1.9.3 植物介导的递送法
1.10 影响昆虫RNAi效率的潜在因素
1.10.1 昆虫核酸酶
1.10.2 昆虫肠道 pH
1.10.3 dsRNA 的长度
1.11 研究目的与意义
1.12 技术路线
第二章 hpMsChi1/2-Ox转基因水稻抑制黏虫的生长发育
2.1 实验材料
2.1.1供试玉米黏虫
2.1.2 试剂、菌株和载体
2.2 实验方法
2.2.1 Southern杂交实验
2.2.2 Northern blot检测
2.2.3 实时荧光定量PCR检测
2.2.4 玉米黏虫生理测定
2.3 结果与讨论
2.3.1 转基因水稻基因组DNA的酶切
2.3.2 靶标基因探针制备
2.3.3 鉴定转基因水稻的拷贝数
2.3.4 转基因水稻的玉米黏虫饲喂实验
2.3.5 不同转基因水稻株系沉默效率的比较
2.3.6 小RNA文库的建立与高通量测序
2.4 本章小结
第三章 几丁质酶全长ORF克隆、重组表达及水解活性分析
3.1 实验材料
3.1.1供试玉米黏虫
3.1.2 试剂、菌株和载体
3.2 实验方法
3.2.1 玉米黏虫MsChi2基因表达谱分析
3.2.2 MsChi2基因克隆载体的构建
3.2.3 MsChi2基因原核表达载体的构建
3.2.4 MsChi2重组蛋白体外活性鉴定
3.2.5 Western blot检测
3.2.6 几丁质酶活性检测
3.3 结果与讨论
3.3.1 MsChi2基因时空和织特异性的表达谱分析
3.3.2 MsChi2蛋白生物信息学分析
3.3.3 MsChi2重组蛋白诱导表达与纯化
3.3.4 Western blot分析
3.3.5 MsChi2蛋白几丁质酶酶活性检测
3.4 本章小结
第四章 几丁质酶抑制剂杀虫活性分析
4.1 实验材料
4.1.1供试玉米黏虫
4.1.2 试剂、菌株和载体
4.2 实验方法
4.2.1 体外转录合成dsRNA
4.2.2 几丁质酶抑制剂饲喂实验
4.2.3 几丁质酶粗酶液提取方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 体外合成玉米黏虫MsChi2基因dsRNA
4.3.2 几丁质酶抑制剂对玉米黏虫的杀虫实验
4.4 本章小结
第五章 PTA表达盒系统提高玉米黏虫靶基因沉默效率
5.1 实验材料
5.1.1 试剂、植物材料和载体
5.2 实验方法
5.2.1 构建报告基因的PTA表达盒
5.2.2农杆菌转化及侵染实验
5.2.3 报告基因PTA表达盒的沉默效应的检测
5.2.4 构建玉米黏虫靶标基因的PTA表达盒
5.3 结果与讨论
5.3.1 PTA表达系统的建立
5.3.2 报告基因的单独的amiRNA或tRNA片段的扩增
5.3.3 Golden Gate无缝组装以及表达载体的构建
5.3.4 报告基因PTA表达盒的RNAi效率验证
5.3.5 玉米黏虫多靶基因特异性PTA表达盒的构建
5.3.6 玉米黏虫MsREase基因的结构域预测以及进化树分析
5.3.7 玉米黏虫的靶基因单个amiR和tRNA片段的扩增
5.3.8 玉米黏虫靶基因PTA表达盒的组装以及表达载体的构建
5.3.9 获得稳定表达PTA表达盒的转基因玉米
5.3.10 PTA-Ox 玉米饲喂黏虫
5.3.11 不同转基因玉米株系沉默效率的比较
5.4 本章小结
第六章 玉米黏虫RNAi途径核心蛋白的功能验证
6.1 实验材料
6.1.1试剂、菌株和载体
6.2 实验方法
6.2.1 MsAGO2、MsSID1和MsDcr2基因的原核表达载体的构建
6.2.2 原核表达MsAGO2、MsSID1和MsDcr2蛋白
6.2.3 Western blot检测
6.2.4 凝胶迁移实验
6.2.5 体外检测Dicer酶切割活性实验
6.3 结果与讨论
6.3.1 玉米黏虫RNAi通路核心蛋白结构域及进化树分析
6.3.2 玉米黏虫RNAi通路核心蛋白诱导表达与纯化
6.3.3 Western blot分析
6.3.4 玉米黏虫MsAGO2蛋白酶活性检测
6.3.5 体外检测玉米黏虫MsDcr2蛋白切割活性
6.3.6 MsSID1蛋白酶活性检测
6.4 本章小结
第七章 全文讨论与结论
7.1 讨论
7.2 结论
7.3 创新点
附 录
参考文献
已发表的论文及参加科研项目情况
致 谢
内蒙古大学;
