一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法

摘要

本发明公开了一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法。本发明选取茄科青枯菌的特异基因hrpB，设计适合环介导等温扩增的引物FIP、F3、BIP、B3和环引物LoopF，取待检病样的茎基部，用水冲洗干净，取含有维管束的病组织放入灭菌容器中，加入灭菌水，静置，得到待检病样品悬浮液；以待检病样品悬浮液为模板，前述引物进行LAMP反应，通过肉眼观察环介导等温扩增的反应产物，如反应产物为绿色的浑浊液体，即确认病样中含有茄科青枯菌；如反应产物为橙色透明液体，则表明病样不含有茄科青枯菌。本发明具有快速、简便、准确性高、灵敏度高的优点。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，特别涉及一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法。

背景技术

对于茄科青枯菌(Ralstoniasolanacearum)侵染引起的青枯病检测鉴定方法，主要有传统的植物病原细菌分离与鉴定方法、BIOLOGGEⅢMicroStation微生物鉴定系统、PCR鉴定方法及环介导等温扩增(LoopMediatedIsothermalAmplification，LAMP)。

传统的植物病原细菌分离与鉴定方法，主要包括从病样中分离病原菌、获得分离菌株的纯培养、菌落与菌体形态特征观察、生理生化特性测定和致病性测定等步骤，该鉴定过程至少需要1个月以上，工作量大，且需要专业技术人员操作。

BIOLOGGEⅢMicroStation微生物鉴定系统，利用微生物对不同碳源呼吸代谢的差异，通过检测呼吸代谢过程中产生的氧化还原物质与显示物质(如TTC、TV)发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及微生物生长造成的浊度差异(浊度)，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。该系统的鉴定过程需要5-7天，且需要购买昂贵的仪器设备和标准数据库。

PCR鉴定方法，主要包括根据已知茄科青枯菌保守序列设计PCR引物、在PCR管中加入反应成分、PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法较特异、快速、灵敏，成本也较低，但需要购买PCR仪。目前利用PCR检测茄科青枯菌需要2.5h左右。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法。该方法以茄科青枯菌特有基因hrpB序列设计特异性引物，建立环介导等温扩增检测与鉴定植物组织中茄科青枯菌的体系，结果可靠，可应用到实际生产中。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，包括如下步骤：

(1)环介导等温扩增茄科青枯菌引物设计：选取茄科青枯菌的特异基因hrpB，设计适合环介导等温扩增的引物FIP、F3、BIP、B3和环引物LoopF；

FIP：5’-CGCGTAGTCGTCGGACTTTCC-CCGTGCGTATCAGCTCGT-3’；

F3：5’-TTTCGCCGCTGATTTCGA-3’；

BIP：5’-AGTGCGATGAAGAAGCGGAAGA-CAGCTGGTCATCCGAATGG-3’；

B3：5’-CTGCCAGCCGGTATTGC-3’；

LoopF：5’-TCGCTGGGAGGAGTGGT-3’；

(2)检测病样品的准备：取待检病样的茎基部和根部，用水冲洗干净，取含有维管束的病组织；

(3)青枯菌悬浮液制备：用灭菌的镊子将步骤(2)中获取的病组织放入灭菌容器中，加入灭菌水，静置，得到待检病样品悬浮液；

(4)环介导等温扩增法反应：以步骤(3)获得的待检病样品悬浮液为模板，用步骤(1)的引物进行LAMP反应；

(5)鉴别结果：通过肉眼观察环介导等温扩增的反应产物，如反应产物为绿色的浑浊液体，即确认病样中含有茄科青枯菌；如反应产物为橙色透明液体，则表明病样不含有茄科青枯菌。

步骤(2)中所述的病组织的大小优选为2～3mm×3～4mm。

步骤(3)中所述的容器优选为离心管。

步骤(3)中所述的灭菌水的用量优选为大小为2～3mm×3～4mm的病组织配比500μL灭菌水。

步骤(3)中所述的静置的时间优选为10～20分钟；更优选为15分钟。

步骤(4)中所述的LAMP反应的反应体系优选如下：每25μL反应体积中，含1μL待检病样品悬浮液、12.5μL2×反应缓冲液、浓度为50μM的引物FIP和BIP各2μL、浓度为50μM的引物LoopF1μL、浓度为50μM的引物F3和B3各0.5μL、BstDN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL，去离子水补足至25μL。

所述的2×反应缓冲液的组成如下：40mM、pH8.8的Tris-HCl，浓度为20mM的KCl、浓度为16mM的MgSO₄、浓度为20mM的(NH₄)₂SO₄、浓度为体积百分比0.2％的Tween-20、浓度为1.6M的甜菜碱(Betaine)、浓度为2.8mM的dNTPs。

步骤(4)中所述的LAMP反应的反应条件优选为62℃恒温1h，95℃恒温2min。

所述的植物优选为茄子、番茄、烟草、马铃薯、辣椒、花生、沙姜、生姜、和甘薯中的一种以上。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)快速、简便：本发明直接鉴定植物组织中的青枯菌、鉴定周期为1.5h内，而且非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强。传统的植物病原细菌鉴定方法至少需要1个月，且需要专业技术人员操作；BIOLOG鉴定方法需要5-7天，而且需要购买昂贵的仪器设备和数据库；PCR鉴定方法则至少需要2.5h，也需要购买PCR仪。

(2)准确：本发明是根据茄科青枯菌特异基因序列设计特异的LAMP引物，鉴定结果准确可靠，而BIOLOG微生物鉴定系统所有时因操作差异和检测板不同等原因，导致获得的数据中部分与标准数据库不一致，难以定论。

(3)灵敏度高：环介导等温扩增法所需模板浓度比PCR方法所需模板浓度还要低，相比PCR方法，环介导等温扩增法灵敏度提高10³倍。

附图说明

图1为本发明检测植物病样中的茄科青枯菌的工艺流程图。

图2为实施例2的LAMP反应结果图：其中：管1～5为已知马铃薯植株病样组织，管6为阳性对照，管7为健康的马铃薯植株组织(阴性对照)。

图3为实施例2的已知病样组织的LAMP反应结果图；其中管1～8的模板浓度分别为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，管9为阳性对照，管10为阴性对照。

图4为实施例3的已知病样组织的PCR产物电泳检测图；其中，泳道1为标准分子量(100bpLadderMarker)；泳道2～9的模板浓度分别为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，泳道10为阳性对照，泳道11为阴性对照。

图5为实施例4未知病样组织的LAMP反应结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

以茄科青枯菌的特异基因hrpB(全长为1434bp，Genebank登录号NC_003296)，设计适合环介导等温扩增的引物FIP、F3、BIP、B3和环引物LoopF；

FIP：5’-CGCGTAGTCGTCGGACTTTCC-CCGTGCGTATCAGCTCGT-3’；

F3：5’-TTTCGCCGCTGATTTCGA-3’；

BIP：5’-AGTGCGATGAAGAAGCGGAAGA-CAGCTGGTCATCCGAATGG-3’；

B3：5’-CTGCCAGCCGGTATTGC-3’；

LoopF：5’-TCGCTGGGAGGAGTGGT-3’。

实施例2：对已知病样品的检测鉴定，过程如图1所示。

一、实验材料

应用已知茄科青枯菌侵染引起的马铃薯植株病样组织以及健康的马铃薯植株组织为材料，茄科青枯菌基因组DNA为阳性对照。

二、实验方法

(1)从待检病样品的茎基部取大小约为2mm～3mm×3mm～4mm的茎组织(含有维管束)，5份待测病样为马铃薯病样品，另取一份健康马铃薯样品作对照。

(2)用灭菌的镊子将已表面消毒病茎组织放入干净的离心管中，加入500μL灭菌水，静置15分钟，获得待检病样品的悬浮液。

(3)从上述悬浮液中取1μL于PCR管中，配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括1μL待检病样品悬浮液、12.5μL2×反应缓冲液【Tris-HCl(pH8.8)浓度为40mM、KCl浓度为20mM、MgSO₄浓度为16mM、(NH4)₂SO₄浓度为20mM、0.2％Tween-20、Betaine浓度为1.6M、dNTPs浓度为2.8mM】、浓度为50μM引物FIP和BIP各2μL、浓度为50μM引物LoopF1μL、浓度为50μM引物F3和B3各0.5μL、BstDN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水3.5μL；将PCR管放入PCR仪中，设置反应参数：62℃1hour，95℃2min。

(4)观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。

三、实验结果与分析

LAMP反应结束后，根据反应夜颜色变化进行判定，并拍照。

如图2所示，应用本发明的方法，以1μL茄科青枯菌引起的马铃薯病样茎基部组织悬浮液为模板，可成功使各LAMP反应液颜色呈绿色，而以对照的健康马铃薯样品悬浮液为模板的LAMP反应液颜色呈橘红色，说明该检测方法是准确可靠的。

实施例3：对已知病样品的检测敏感度测定

一、实验材料

应用已知茄科青枯菌侵染引起的马铃薯植株病样组织以及健康的马铃薯植株组织为材料。

二、实验方法

(1)从待检病样品的茎基部取大小约为2mm～3mm×3mm～4mm的茎组织，1份待测病样为已知青枯菌侵染引起的马铃薯病样品，另取一份健康马铃薯样品作对照。

(2)用灭菌的镊子将已表面消毒病茎组织放入干净的离心管中，加入500μL灭菌水，静置15分钟。

(3)从悬浮液中取100μL于PCR管中作为模板母液，将模板母液分别稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7倍，从各梯度稀释液中取1μL作为模板。

(4)环介导等温扩增反应(LAMP)

配制环介导等温扩增反应液，包括1μL各梯度稀释液、12.5μL2×反应缓冲液【Tris-HCl(pH8.8)浓度为40mM、KCl浓度为20mM、MgSO₄浓度为16mM、(NH4)₂SO₄浓度为20mM、0.2％Tween-20、Betaine浓度为1.6M、dNTPs浓度为2.8mM】、浓度为50μM引物FIP和BIP各2μL、浓度为50μM引物LoopF1μL、浓度为50μM引物F3和B3各0.5μL、BstDN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水3.5μL；将PCR管放入PCR仪中，设置反应参数：62℃1h，95℃2min。

(5)结果鉴定

反应结束后，观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。

如图3所示，应用本发明的方法，以1μL母液以及10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍稀释液为模板的LAMP反应液均呈绿色，10^-6和10^-7倍稀释液为模板的LAMP反应液为橘红色。

(6)PCR反应

配制PCR反应体系，25μL反应体系包括1μL各梯度稀释液，PremixTaq(dNTPMixture各0.4mM，TaKaRaTaq0.05U/μL，Mg²⁺浓度为3mM)12.5μL、浓度分别为3μM的茄科青枯菌特异引物759f(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3')和760r(5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3')各1μL，1μLDMSO，加灭菌的双蒸水8.5μL至总体积为25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性15sec、59℃退火30sec、72℃延伸30sec，30个循环，72℃最终延伸10min。

(7)结果鉴定

PCR反应结束后，取各反应产物10μL分别点样于质量体积百分比为(w/v)2.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，进行电泳，125V恒压电泳45min；在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。

电泳结果如图4所示：分别以母液、10^-1、10^-2倍稀释液为模板，可成功地扩增到预期大小为280bp的特异目的片段，这些片段大小与阳性对照的片段大小一致，而10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7倍稀释液和健康马铃薯样品均未扩增出特异条带。

将图3和图4相比，LAMP检测鉴定茄科青枯菌的敏感度比PCR反应扩增鉴定茄科青枯菌的敏感度高10³倍。

实施例4：对未知病样品的检测鉴定试验

一、实验材料

对采自多个地区田间的9种不同植物疑似青枯病样品或无症状健康样品进行检测。

二、实验方法

对来自广东多个地区采集到的9种不同植物样品进行取样，共取得17个样品并进行编号，各号样品所对应的植物种类、采集地点以及症状表现等信息如表1所示。检测鉴定所采用的方法同实施例1所用方法相同，并用PCR方法加以比较验证，PCR所采用的方法同实施例2所用方法相同。

三、实验步骤

(1)从待检样品的茎基部取大小约为2mm～3mm×3mm～4mm维管束茎组织，并进行表面消毒，从不同的待检样品(茄子、番茄、烟草、马铃薯、辣椒、花生、沙姜、生姜、甘薯)中共取17份样品组织。

(2)用灭菌的镊子将已表面消毒病茎组织放入干净的离心管中，加入500μL灭菌水，静置15分钟。

(3)从悬浮液取1μL液体于PCR管中，配制环介导等温扩增反应液，包括1μL各梯度稀释液、12.5μL2×反应缓冲液【Tris-HCl(pH8.8)浓度为40mM、KCl浓度为20mM、MgSO₄浓度为16mM、(NH₄)₂SO₄浓度为20mM、0.2％Tween-20、Betaine浓度为1.6M、dNTPs浓度为2.8mM】、浓度为50μM引物FIP和BIP各2μL、浓度为50μM引物LoopF1μL、浓度为50μM引物F3和B3各0.5μL、BstDN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水3.5μL；将PCR管放入PCR仪中，设置反应参数：62℃1h，95℃2min。

(4)反应结束后，观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。

四、实验结果与分析

如图5及表1结果显示：待检的17个样品中1、2、3、5、6、9、10、11、12、13、14、15和17号样品均为阳性，即病样中含有茄科青枯菌，是由茄科青枯菌侵染引起的；4、7、8和16号样品为阴性，即样品中不含茄科青枯菌，不是由茄科青枯菌侵染引起不正常或是健康植株，而且本发明方法检测结果与PCR方法鉴定的结果完全一致(见表1)，从而进一步验证了该检测鉴定方法的可靠性。

表1应用本发明方法及PCR检测方法鉴定不同来源待检样品的结果比较

注：+表示为阳性，－表示为阴性

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。