一种通过转CmSOS1基因提高切花菊耐盐和耐涝性的方法

摘要

本发明属于基因工程技术和转基因育种领域，公开一种通过转CmSOS1基因提高切花菊耐盐和耐涝性的方法，通过将CmSOS1基因植物表达载体导入切花菊进行超表达以提高切花菊的耐盐和耐涝性。包括如下步骤：(1)构建超表达CmSOS1基因植物表达载体；(2)农杆菌EHA105介导的叶盘法转化菊花；(3)转CmSOS1基因植株的耐盐和耐涝性分析。通过对抗性生根植株进行PCR、定量RT?PCR检测证实CmSOS1基因已整合到转基因植株基因组中并转录表达，对转基因植株进行盐和淹水处理发现超表达株系耐盐和耐涝性提高，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术和转基因育种领域，涉及一种通过转CmSOS1基因提高切花菊耐盐和耐涝性的方法，具体涉及包括有CmSOS1基因的植物表达载体构建、转化细胞、转CmSOS1基因切花菊的培育、鉴定方法及转基因植株的应用。

背景技术

盐胁迫和涝渍胁迫是非生物胁迫中影响植物生长和发育的重要环境因子。菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，用途和栽培地域极广，具有很高的观赏和经济价值，在现代花卉生产中占有十分重要的地位。然而，在菊花周年栽培生产中，往往遭受由于灌溉、施肥等导致的土壤次生盐渍化及夏季田间积水产生的涝害等非生物胁迫，严重影响菊花的生长和发育，甚至导致植株死亡，造成极大的损失。因此，从分子水平层面展开对菊花耐盐和耐涝机理的研究及优异抗逆基因挖掘是加快培育具有优良抗性的菊花新品种的基础。

目前，植物对盐或涝单个限制因子响应的机制均研究的比较详细，但对涝和盐协同胁迫响应机制的研究相对较少。盐胁迫中对植物产生危害的主要离子是钠离子，植物中Na⁺的过量积累会扰乱细胞内的离子稳态，导致K⁺/Na⁺比率降低，膜电位消散，同时引起渗透胁迫和次生氧化胁迫等，导致代谢酶活性和光合作用减弱，从而使植物生长受到抑制，最终细胞死亡(Hasegawa等，2000；Tuteja等，2007；Zhu等，2001)。质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1是植物中唯一可以将Na⁺排出细胞的转运体，在植物耐盐胁迫中发挥重要的作用，主要参与Na⁺从细胞溶质的排出和控制Na⁺长距离运输及其在植物器官中的分配等(Oh等，2009；Olias等，2009；Shi等，2000；Shi等，2002)。此外，涝渍的主要胁迫因子是低氧，即氧浓度远低于空气中的饱和含氧量。在涝滞胁迫下，植物有氧呼吸受到抑制，转变为无氧呼吸，引起能量代谢紊乱，并产生过多的活性氧，从而导致氧化胁迫(Bailey-Serres等，2008；Christianson等，2009；Gupta等，2009；Zabalza等，2009)。在正常生长条件下SOS1mRNA是不稳定的，其快速降解的半衰期约10min，活性氧介导盐胁迫下SOS1mRNA稳定性的增加(Chung等，2008)；在盐或氧化胁迫下SOS1能够通过其C端胞质长亲水尾巴与氧化胁迫响应中重要的信号调节因子RCD1相互作用(Katiyar-Agarwal等，2006)，表明SOS1基因参与植物对氧化胁迫的响应，因此猜测SOS1可能同时参与植物对盐和淹水胁迫的调控，但在植物领域未见相关报道。

参考文献：

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发明内容

针对目前现实生产中切花菊的耐盐和耐涝性较低，而现有技术中缺少关于转CmSOS1基因提高植株的耐盐和耐涝性方面的研究，本发明的目的在于提供如SEQ ID NO.1所示的CmSOS1基因在提高切花菊抗逆性中的基因工程应用。

本发明的另一目的在于提供一种CmSOS1基因植物表达载体。

本发明的又一目的在于提供一种耐盐和耐涝性切花菊的培育方法。

本发明通过农杆菌介导的叶盘法将菊花的内源CmSOS1基因导入切花菊以提高其耐盐和耐涝性，这种新的探索为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供一种新颖而实用的方法。

本发明的技术方案路线如下：构建包含CmSOS1基因的植物表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法将CmSOS1基因导入切花菊，经过卡纳霉素筛选获得抗性植株，对抗性生根植株进行基因组DNA水平的PCR和转录组水平的定量RT-PCR检测，验证内源基因是否整合到转基因植株的基因组中并发生转录。对转基因株系进行耐盐和耐涝性分析，证实CmSOS1基因在菊花耐盐和耐涝性中的功能。

本发明的目的具体通过以下技术手段实现：

如SEQ ID NO.1所示的CmSOS1基因在提高切花菊抗逆性中的基因工程应用。

上述的应用，其在于：为将CmSOS1基因植物表达载体导入切花菊进行超表达以提高切花菊的耐盐和耐涝性。

上述的应用，其在于：所述的CmSOS1基因植物表达载体采用以下步骤制备：以切花菊‘神马’根部的cDNA为模板、以如SEQ ID NO.2所示的上游引物S-F和如SEQ ID NO.3所示的下游引物S-R为引物进行PCR扩增，高保真获得PCR产物；将PCR产物连接到pEASY^TM-BluntZero>TM-Blunt>4DNA连接酶连接，转化，提取阳性正义表达载体质粒pBIG-CmSOS1-overexpress。

包含有上述CmSOS1基因植物表达载体的转化细胞。

一种耐盐和耐涝性切花菊的培育方法，其在于：将上述的CmSOS1基因植物表达载体导入切花菊中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR检测，获得转CmSOS1基因切花菊。

对阳性转化植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR检测的过程具体包括如下步骤：

(1)PCR检测

分别提取野生型植株和转CmSOS1基因的抗性生根植株的基因组DNA，将抗性基因Kan 作为检测目标，检测植物表达载体是否整合到植物基因组中，引物序列如下：

上游引物Kan-F：序列如SEQ ID NO.14所示，

下游引物Kan-R：序列如SEQ ID NO.15所示；

以提取的DNA为模板，以Kan-F和Kan-R为引物进行PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量RT-PCR分子检测

提取用Kan引物进行PCR扩增检测有目的条带的植株叶片总RNA，消化基因组DNA，反转录合成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，以转空载体株系P0的表达为基准值，采用2^-ΔΔC_T的计算方法对每个转基因植株的相对表达量进行分析，特异引物序列如下：

上游引物DL-F：序列如SEQ ID NO.16所示，

下游引物DL-R：序列如SEQ ID NO.17所示；

所用内参基因为EF1α，引物序列为：

上游引物EF1α-F：序列如SEQ ID NO.18所示，

下游引物EF1α-R：序列如SEQ ID NO.19所示；

经过PCR、荧光定量RT-PCR检测均为阳性，确定获得转基因菊花株系。

上述的CmSOS1基因植物表达载体在培育耐盐和耐涝性菊花上的应用。

上述的转化细胞在培育耐盐和耐涝性菊花上的应用。

通过分别将pBIG-CmSOS1-overexpress表达载体、pBIG-CmSOS1-antisense表达载体和pBIG-amiCmSOS1表达载体转入农杆菌感受态细胞EHA105，获得阳性农杆菌，通过叶盘法将CmSOS1基因导入菊花中，获得转CmSOS1基因切花菊。对转基因株系进行耐盐和耐涝性分析，证实CmSOS1基因在菊花耐盐和耐涝性中的功能。说明超表达CmSOS1提高了转基因株系的耐盐和耐涝性；而反义和干扰CmSOS1，减少植物体内SOS1基因的表达水平均降低了转基因植株的耐盐和耐涝性。

(1)pBIG-CmSOS1-antisense表达载体的构建

在CmSOS1基因cDNA序列中选取长为557bp的片段，根据载体pBIG多克隆位点(MCS)设计引物：

上游引物A-F：序列如SEQ ID NO.4所示，

下游引物A-R：序列如SEQ ID NO.5所示；

在CmSOS1基因的上游和下游分别引入与载体pBIG多克隆位点相反的Sac I和XbaI酶 切位点，高保真获得PCR产物，将上述产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-CmSOS1，将提取的阳性质粒由Sac I和Xba I双酶切得到的CmSOS1片段与Sac I和Xba I双酶切的pBIG载体片段用T₄DNA连接酶连接，转化，获得阳性反义表达载体质粒pBIG-CmSOS1-antisense；

(2)pBIG-amiCmSOS1表达载体的构建

选取与步骤(1)构建中相同的CmSOS1基因片段，登陆MicroRNA引物设计网页，设计CmSOS1特异人工干扰引物：

引物I miR-s：序列如SEQ ID NO.6所示，

引物II miR-a：序列如SEQ ID NO.7所示；

引物III miR*s：序列如SEQ ID NO.8所示，

引物IV miR*a：序列如SEQ ID NO.9所示；

以本实验室改造的pRS300(pRS300属于本领域公开的载体)，即pBSK中包含拟南芥miR319a前体的质粒(酶切位点顺序为EcoR V在前，BamH I在后)为模板，结合pRS300中的引物：

引物A：序列如SEQ ID NO.10所示，

引物B：序列如SEQ ID NO.11所示；

根据人工MicroRNA干扰载体构建原理，高保真扩增目的片段d，将产物d连接到pMD19-T载体，以测序正确的阳性质粒pMD19-d为模板，用与pBIG载体酶切位点方向一致(BamH I在前，Sma I在后)的引物：

上游引物R-F：序列如SEQ ID NO.12所示，

下游引物R-R：序列如SEQ ID NO.13所示；

高保真重新扩增，将获得的PCR产物用BamH I和Sma I双酶切得到的CmSOS1基因片段与BamH I和Sma I双酶切的pBIG载体片段T₄DNA连接酶连接，转化，提取阳性质粒pBIG-amiCmSOS1。

本发明的有益效果：

1.本发明通过转基因技术，将内源CmSOS1基因导入菊花基因组中并正常转录表达，获得耐盐和耐涝性菊花稳定表达抗性，对环境不产生污染，能填补现有技术的空白，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

2.本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，通过对转空载体株系(P0)和各两个转基因株系(Z1、Z2、F1、F2、i1和i2)进行CK(浇灌ddH₂O)、S(盐处理，即浇灌200mM>2O，水面高于植株基质表面2-3cm)和S+WL(淹200mM>

附图说明

图1 pBIG-CmSOS1-overexpress和pBIG-CmSOS1-antisense植物表达载体构建流程图

图2植物表达载体pBIG-amiCmSOS1构建过程的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图

a：pRS300质粒图谱；b：以pRS300为模板质粒扩增的a，b，c，d片段；M1：DL2000。

图3转CmSOS1基因抗性植株形成过程

a：抗性愈伤组织；b：抗性芽的筛选；c：生根筛选；d：转基因植株

图4转pBIG-CmSOS1抗性生根植株Kan基因检测电泳图

M1：DL2000；1：阳性质粒对照；2：野生型植株；3-6：转pBIG-CmSOS1-overexpress抗性

植株；7-11：转pBIG-CmSOS1-antisense抗性植株；12-16：转pBIG-amiCmSOS1抗性植株。图5转pBIG-CmSOS1及转空载体株系P0中CmSOS1基因相对表达量水平

P0：转pBIG空载体株系；Z1、Z2：转pBIG-CmSOS1正义株系；F1、F2：转pBIG-CmSOS1

反义株系；i1、i2：转pBIG-CmSOS1干扰株系(下同)。

图6 4种处理下转空载体和转基因株系的表型观察，标尺＝1.0cm

P0：转pBIG空载体株系；Z1、Z2：转pBIG-CmSOS1正义株系；F1、F2：转pBIG-CmSOS1反义株系；i1、i2：转pBIG-CmSOS1干扰株系；CK：浇灌ddH₂O；S：盐处理，即浇灌200mM>2O，水面高于植株基质表面2-3cm；S+WL：淹200mM>

图7 4种处理14d后转空载体和转基因株系的存活率分析

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照本领域的公知手段。

实施例1.

(1)pBIG-CmSOS1植物表达载体的构建

1)pBIG-CmSOS1-overexpress表达载体的构建

根据菊花‘神马’CmSOS1基因(序列如SEQ ID NO.1所示)序列信息及表达载体pBIG多克隆位点(MCS)，设计在CmSOS1基因的上游引入Xba I酶切位点，下游不引入任何酶切位点的特异引物：

上游引物S-F：序列如SEQ ID NO.2所示，

下游引物S-R：序列如SEQ ID NO.3所示；

以切花菊‘神马’根部的cDNA为模板，高保真扩增含有酶切位点的目的片段，50μL反应体系：5×Phusion HF PCR Buffer 10.0μL，S-F、S-R引物各1.0μL，dNTP mix 1.0μL(10.0mmol L^-1)，DMSO>2O>2O>2O补足20.0μl；37℃酶切1h；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pBIG载体片段和目的基因CmSOS1片段。用T₄DNA连接酶(Fermentas)连接两个回收的产物，连接反应体系10μL：10×T₄DNA>4DNA连接酶1μL；22℃连接1h，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取阳性正义表达载体质粒pBIG-CmSOS1-overexpress(图1a)；

2)pBIG-CmSOS1-antisense表达载体的构建

在CmSOS1基因cDNA序列中选取长为557bp的片段，根据载体pBIG多克隆位点(MCS)设计引物：

上游引物A-F：序列如SEQ ID NO.4所示，

下游引物A-R：序列如SEQ ID NO.5所示；

在CmSOS1基因的上游和下游分别引入与载体pBIG多克隆位点相反的Sac I和XbaI酶切位点，高保真获得PCR产物，连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性 质粒pMD19-CmSOS1，分别对上述阳性质粒和pBIG载体质粒用Sac I和Xba I进行双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收，用T₄DNA连接酶连接，转化，获得阳性反义表达载体质粒pBIG-CmSOS1-antisense(图1b)，高保真扩增、双酶切和连接体系同构建正义表达载体pBIG-CmSOS1-overexpress；

3)pBIG-amiCmSOS1表达载体的构建

选取与步骤(2)构建中相同的CmSOS1基因片段，登陆MicroRNA引物设计网页，设计CmSOS1特异人工干扰引物：

引物I miR-s：序列如SEQ ID NO.6所示，

引物II miR-a：序列如SEQ ID NO.7所示；

引物III miR*s：序列如SEQ ID NO.8所示，

引物IV miR*a：序列如SEQ ID NO.9所示；

以本实验室改造的pRS300(图2a)，即pBSK中包含拟南芥miR319a前体的质粒(酶切位点顺序为EcoR V在前，BamH I在后)为模板，结合pRS300中的引物：

引物A：序列如SEQ ID NO.10所示，

引物B：序列如SEQ ID NO.11所示；

根据人工MicroRNA干扰载体构建原理，高保真扩增目的片段d，PCR反应(a)、(b)、(c)反应体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL(10μmol L^-1),dNTP>-1)，Pfusion>2O>2O溶解。此回收产物用于进行PCR(d)反应，50μL反应体系：10×PCR>-1),dNTP>-1)，Pfusion>2O>

上游引物R-F：序列如SEQ ID NO.12所示，

下游引物R-R：序列如SEQ ID NO.13所示；

高保真重新扩增，将获得的PCR产物由BamH I和Sma I双酶切得到的CmSOS1基因片段与BamH I和Sma I双酶切的pBIG载体片段用T₄DNA连接酶连接，转化，提取阳性质粒pBIG-amiCmSOS1，高保真扩增、双酶切和连接体系同构建pBIG-CmSOS1正义表达载体。

(2)农杆菌EHA105介导的叶盘法转化菊花

1)农杆菌EHA105感受态细胞的制备

取-70℃保存的根癌农杆菌EHA105于含50ug/ml利福平的YEB板划线，28℃培养2-3d，从YEB平板上挑取单菌落，接种于50ml含50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD₆₀₀达0.5-0.6，菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心收集菌体，将菌体重悬于2ml预冷的含15％甘油的0.1M无菌CaCl₂溶液中，200μl/管分装，冰浴保存立即使用，或液氮速冻1min，-80℃保存备用。

2)冻融法转化农杆菌

分别各取5μl pBIG-CmSOS1-overexpress、antisense和amiRNA质粒，加入100μl感受态细胞，冰浴30min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，加入800μl YEB液体培养基，28℃，200rpm培养4-6h，菌液涂布于YEB固体平板上(含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，28℃倒置培养2-3d，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于菊花的遗传转化。

3)农杆菌介导的叶盘法转化菊花

以组培瓶中的切花菊‘神马’苗顶端叶片为受体材料，切成0.5cm×0.5cm叶盘，近轴面(有叶脉的一面)向下置于预培养培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)中预培养2-3d，浸入备好的农杆菌菌液中侵染8-10min，用滤纸吸干叶盘上附着的菌液后接种到共培养培养基(MS+1/0.5 6-BA/NAA)上，28℃暗培养3d后转入脱羧培养基(MS+1/0.56-BA/NAA+500mg/L Carb)上，脱羧培养5-7d，然后转入筛选培养基(MS+1/0.5-0.36-BA/NAA+350-200mg/L Carb+10-8mg/L Hyg)进行继代选择培养3-4代。在筛选培养初期，转化的叶盘分化出抗性愈伤组织(图3a)，随着继代培养基中逐渐降低筛选压，愈伤组织分化出抗性不定芽(图3b)，待分化出的抗性芽长到2-3cm时转入生根筛选培养基上(MS+8mg/L Hyg)进行生根筛选(图3c)，初步获得长势正常的抗性植株(图3d)。

(3)转CmSOS1基因抗性植株的分子检测

1)PCR检测

分别提取野生型植株和转CmSOS1基因的抗性生根植株的基因组DNA，将抗性基因Kan作为检测目标，检测植物表达载体是否整合到植物基因组中，引物序列如下：

上游引物Kan-F：序列如SEQ ID NO.14所示，

下游引物Kan-R：序列如SEQ ID NO.15所示；

以提取的DNA为模板，Kan-F和Kan-R为引物进行PCR反应，扩增体系为：10×PCRBuffer 4μL，上、下游引物各1.0μL，dNTP mix 2.0μL(2.5mmol L^-1)，rTaq>2O补足体积25μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如>

2)荧光定量RT-PCR分子检测

提取用Kan引物进行PCR扩增检测有目的条带的植株叶片总RNA，消化基因组DNA，反转录合成第一链cDNA，按照荧光定量试剂盒(Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，反应程序为：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃20s，40个循环。每个样品重复3次，以转空载体株系P0的表达为基准值，采用2^-ΔΔC_T的计算方法对每个转基因植株的相对表达量进行分析，特异引物序列为：

上游引物DL-F：序列如SEQ ID NO.16所示，

下游引物DL-R：序列如SEQ ID NO.17所示；

所用内参基因为EF1α，引物序列为：

上游引物EF1α-F：序列如SEQ ID NO.18所示，

下游引物EF1α-R：序列如SEQ ID NO.19所示；

荧光定量表达分析显示，正义株系CmSOS1相对表达量均明显高于转空载体株系P0，其中株系Z2CmSOS1表达量是P0的2.65倍；反义株系CmSOS1表达量均低于转空载体株系，其中株系F1CmSOS1表达量为P0的0.55倍；人工干扰植株中CmSOS1基因表达量与转反义情况相似，株系i1CmSOS1表达量是P0的0.42倍(图5)，证实内源基因已转入切花菊基因组中并表达。

(4)转CmSOS1基因植株后代的耐盐和耐涝性分析

分别各选取2个pBIG-CmSOS1-overexpress、antisense和amiRNA表达载体转化‘神马’的转基因株系(Z1、Z2、F1、F2、i1和i2)及1个转空载体株系(P0)进行盐和淹水处理。通过对这7种阳性株系的大量扩繁及扦插，得到长势一致的插穗，将生长一致的转基因及转空载体植株种植于一次性塑料杯中，栽培基质为按1:1比例混合的营养土：蛭石混合物，种植于温室(光周期为长日照：16h光/8h暗，光下温度为22℃，暗中温度为18℃，相对湿度为68％-75％)，待转基因植株展开8-10片叶时控水处理7d，进行以下4种处理，分别为：CK(浇灌ddH₂O)、S(盐处理，浇灌200mM>2O，水面高于植株基质表面2-3cm)和S+WL(淹200mM>

如图6和7所示，处理24h后，所有植株表型变化不明显，而处理14d后，盐处理和淹水加盐处理下Z1和Z2的长势均优于P0，而i1、i2、F1和F2的长势均弱于P0，存活率统计发现处理14d后，盐或淹水单独处理Z1和Z2的存活率在69％-76％之间，P0株系的存活率 为51％-53％，而i1、i2、F1和F2的存活率为33％-38％；盐和淹水协同处理后所有植株存活率均降低，反义和干扰株系中存活率最低，为20％-22％，转空载体株系P0存活率降低为31％，正义株系存活率则可达49％-51％。由此可见，超表达CmSOS1提高了转基因株系的耐盐和耐涝性；而反义和干扰CmSOS1，减少植物体内SOS1基因的表达水平均降低了转基因植株的耐盐和耐涝性。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的实例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。