基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用

摘要

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用，属于水体检测技术领域。解决了现有技术中基于基因工程的微生物水体毒性检测方法使用价格昂贵的光谱仪器和底物，成本高的问题。本发明的基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用是先将能够自分泌电子媒介体的基因工程细菌接种到能够保证其正常繁殖的培养基中，然后将培养基等体积分装为两份以上的样品，对照样品加入体积为V的去离子水，检测样品加入体积为V的待测水样，培养基因工程细菌，最后观察对照样品和检测样品的颜色，如果检测样品与对照样品颜色一致，则待测水样无毒，如果检测样品与对照样品颜色不一致，则待测水样有毒。应用过程中不需要使用价格昂贵的底物和仪器，可以用肉眼直接观察结果。

说明书

技术领域

本发明属于水体检测技术领域，具体涉及一种基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用。

背景技术

随着现代化工农业的快速发展，人类生活水平得到提高的同时环境也受到越来越严重的污染，尤其是水环境，大量的有机物、重金属、农药等进入到水环境中，成为水体污染的主要来源，并且通过食物链的层层放大和累积严重威胁人、畜的饮食安全。因此，为了应对严峻的水污染挑战，近年来，各种水体总毒性检测、监测技术迅速发展，成为人们预警水环境是否污染，并判断受污染程度的重要手段。

现有技术中的水体毒性检测方法，水体毒性的测定主要有理化方法和生物学方法。化学物理分析方法能定量分析污染物中主要成分的含量，但是不能直接和全而地反映各种有毒物质对环境的综合影响。且水中有害化学污染物和有机污染物种类繁多，大多数有机物在水中含量又极微，要全部分析检测和研究这些污染成分，工作量非常巨大。生物检测能够直接反应复杂水体环境中所有组分的综合作用，可以弥补理化检测方法的不足，因此在水污染研究中，它已经成为检测和评价水体环境的重要手段之一。

现有技术，生物检测水体毒性的方法主要有发光细菌检测、藻类检测、鱼类检测、水蚤类检测、微生物检测等。其中，发光细菌检测操作简便、快速、灵敏、费用低、实用性强，但是如果想保证可靠的质量控制，维护周期长。藻类检测个体小、繁殖快，对毒性敏感，易于分离培养，但是工作量大，测试周期长。鱼类检测水环境十分敏感，应用广泛，但是需要培养鱼类，实验周期长。水蚤类检测繁殖快、易培养，对多种毒物敏感、易观察，但是蚤类的年龄和类别对结果有影响，难以判断蚤类是否处于合适的状态，而完成这些判断需要长期的经验积累。微生物检测具有检测速度快，稳定性好，自动化程度高，选择性高，灵敏度高，成本低，检测结果易比对等优点，综合了几种检测方法的优点，近年来，得到了广泛关注。其中，基于基因工程微生物水体毒性检测方法是一个新的研究热点。如在微生物体内引入具有启动子(Promotor)和报告基因(Reporter)的质粒，启动子如fabA,dnak或者grpE等，报告基因主要为lacZ(β-半乳糖苷酶)或者gfp(具有荧光性质的荧光素酶)等；当有毒性物质存在时，启动子会对毒性分子做出响应，从而诱导合成报告基因对应的功能酶，使微生物可以合成相应的酶，并将底物分解成可以用电化学方法检测的物质或者发出荧光信号(Tessema,D.A.,etal.,Freeze-dryingofsol–gelencapsulatedrecombinantbioluminescentE.colibyusinglyo-protectants.SensorsandActuatorsB:Chemical,2006.113(2):p.768-773.)。该检测方法能够反应水体是否具有毒性，但是该检测过程需要使用荧光仪器和价格昂贵的底物，检测成本较高，因此不适于广泛应用。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中基于基因工程微生物的水体毒性检测方法使用价格昂贵的光谱仪器和底物，成本高的技术问题，提供一种基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用。

本发明提供一种基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用，步骤如下：

步骤一、将基因工程细菌接种到能够保证该基因工程细菌正常繁殖的培养基中，得到接种后的培养基；

所述基因工程细菌能够自分泌电子媒介体；

步骤二、将接种后的培养基等体积分装为两份样品，一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，另一份样品加入体积为V的待测水样，得到检测样品；

或者将接种后的培养基等体积分装为三份以上的样品，一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，剩余样品分别加入体积为V的相同浓度或者不同浓度的待测水样，得到检测样品；

步骤三、相同培养条件下，培养对照样品和检测样品，观察对照样品和检测样品的颜色，如果培养后的检测样品与对照样品颜色一致，则待测水样无毒，如果培养后的检测样品与对照样品颜色不一致，则待测水样有毒。

优选的，所述基因工程细菌是通过铜绿色假单胞菌P.Aeruginosa中rhlIR基因簇过表达获得的。

优选的，所述步骤一中，保证该基因工程细菌正常繁殖的培养基为灭菌的抗生素与灭菌的培养基的混合物，所述抗生素为四环素，与灭菌的培养基混合后，终浓度为100-200ug/mL，或者为四环素与氨苄青霉素混合物，与灭菌的培养基混合后，四环素的终浓度为100-200ug/mL，氨苄青霉素的终浓度为50-150ug/mL。

优选的，所述培养基为PB培养基、M9培养基、LB培养基、PYO培养基中的一种。

优选的，所述灭菌的培养基是通过将培养基超声混匀，封口，在121℃，1个大气压下灭菌20min后，冷却得到的。

优选的，所述灭菌的抗生素是通过将抗生素溶于去离子水中，然后用0.05～0.5μm的滤膜过滤得到的。

优选的，所述步骤三的培养条件是：将对照样品和检测样品在10～45℃的恒温摇床中以100～250rpm的转速培养10～35h。

优选的，所述培养时间为15h，培养温度为30℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用，使用能够自身分泌电子媒介体的基因工程细菌作为水体总毒性检测的微生物受试体，在水体总毒性检测中，以细菌分泌的电子媒介体为水体总毒性检测的信号分子，检测过程中不需要使用价格昂贵的底物，而且电子媒介体具有显著的颜色的特征，可以用肉眼直接观察结果，显著的降低了基于基因工程微生物的水体总毒性检测方法的使用成本，具有明显的成本优势。

附图说明

图1为本发明的基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用的流程图；

图2为实施例1的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图3为实施例2的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图4为实施例3的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图5为实施例4的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图6为实施例5的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图7为实施例6的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果；

图8为实施例7的基因工程细菌检测水体总毒性的检测结果。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明专利要求的限制。

本发明的基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用，基因工程细菌能够自分泌电子媒介体，当水体含有毒性物质时，细菌的繁殖和活性受到影响，分泌的电子媒介体浓度变少，电子媒介体具有显著的颜色的特征，可以用肉眼直接观察结果，因此与对照样品有颜色差异的检测样品即为有毒水体，颜色差异越大，毒性越大。

本发明的技术方案如图1所示，先将基因工程细菌接种到能够保证该基因工程细菌正常繁殖的培养基中。然后将接种后的培养基等体积分装为两份以上的样品。如果将培养基等体积分装为两份样品，则一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，另一份样品加入待测水样，得到检测样品；如果是将培养基等体积分装为多于两份的样品，一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，剩余样品分别加入体积为V的待测水样(可以是分别加入相同浓度的待测水样，提高检测准确性；也可以分别加入不同浓度的待测水样，进行梯度检测，根据浓度变化，寻找到对所取水样的检测下限，也可以根据浓度和颜色的对应关系，得到标准比色卡)，得到检测样品。最后，在相同培养条件下，培养对照样品和检测样品，当待测水样为毒性样品时，毒性物质会抑制细菌的繁殖及活性，从而导致细菌分泌的电子媒介体的量减少，观察对照样品和检测样品的颜色，可以对水体总毒性进行检测，如果培养后的检测样品与对照样品颜色一致，则待测水样无毒，如果培养后的检测样品与对照样品颜色不一致，则待测水样有毒。需要说明的是，上述过程中，待测水样是唯一的影响因素。

本发明中只要工程细菌能够分泌电子媒介体就能实现本发明检测水体总毒性的效果，没有特殊限制。但经发明人研究，下述的基因工程细菌能够很好的实现上述效果，因此，本发明基因工程细菌优选通过铜绿色假单胞菌P.Aeruginosa(保藏号CGMCC1.860)中rhlIR基因簇过表达获得，具体改造过程可以参照文献：一种基于基因工程细胞色素细菌生物传感系统对丁酰高丝氨酸内酯群体感应信号的量化(Ageneticallyengineeredwhole-cellpigment-basedbacterialbiosensingsystemforquantificationofN-butyrylhomoserinelactonequorumsensingsignal，BiosensorsandBioelectronics25(2009)41-47)。

作为优选，本发明提供一种上述基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用，步骤如下：

步骤一、将培养基超声混匀，封口，在121℃，1个大气压下灭菌20min，得到灭菌后的培养基，然后冷却备用；

其中，培养基没有特殊限制，采用能够培养相应基因工程细菌的培养基皆可，优选为PB培养基、M9培养基、LB培养基、PYO培养基中的一种，上述几种培养基皆可以通过本领域技术人员熟知方式获得；

步骤二、将抗生素溶于去离子水中，得到抗生素溶液，然后用0.05～0.5μm的滤膜过滤，得到灭菌后的抗生素，置于4℃冰箱中冷藏备用；

其中，抗生素为四环素或者四环素与氨苄青霉素混合物；

步骤三、在灭菌过的超净台中，将灭菌后的抗生素与灭菌后的培养基混合，得到混合后培养基，当抗生素为四环素时，混合后培养基中四环素的浓度为100-200ug/mL，当抗生素与氨苄青霉素混合物时，混合后培养基中四环素的浓度为100-200ug/mL，氨苄青霉素的浓度为50-150ug/mL；

步骤四、在灭菌过的超净台中，将基因工程细菌接种到步骤三的混合后培养基中，混匀后，将培养基等体积分装为两份样品，一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，另一份样品加入体积为V的待测水样，得到检测样品，或者将培养基等体积分装为多于两份的样品，一份样品加入体积为V的去离子水，得到对照样品，剩余样品分别加入体积为V的待测水样，得到检测样品，然后将对照样品和检测样品在10～45℃的恒温摇床中以100～250rpm的转速培养10～35h，优选培养时间为15h，培养温度为30℃。

步骤五、观察对照样品和检测样品的颜色，如果培养后的检测样品与对照样品颜色一致，则待测水样无毒，如果培养后的检测样品与对照样品颜色不一致，则待测水样有毒。如果想获得更准确的结果，可以使用光谱仪器或者电化学仪器。

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

步骤一、取1L的PB培养基，用透气膜封口，在121℃，1个大气压下灭菌20min，冷却备用；

步骤二、配制50mL的抗生素，超声混匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中冷藏备用，抗生素为四环素和氨苄青霉素的混合物，其中，氨苄青霉素的浓度为10mg/mL，四环素的浓度为15mg/mL；

步骤三、在灭菌过的超净台中，将0.9mL除菌后的抗生素加入89.1mL灭菌后的培养基中；

步骤四、在灭菌过的超净台中，将基因工程细菌(通过假单胞菌P.aeruginosaCGMCC1.860中rhlIR基因簇过表达获得，能够分泌高浓度的吩嗪结构的电子媒介体)接种到步骤三含有抗生素的培养基中，混匀后，将培养基等体积分装为五份(每份18mL)，其中一份加入体积为2mL的去离子水，其余四份加入体积为2mL，浓度分别为25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的3,5-二氯苯酚(3,5-DCP)，即五份试样中3,5-DCP的浓度分别为(a)0mg/L,(b)2.5mg/L,(c)5mg/L,(d)10mg/L和(e)20mg/L的3,5-DCP，在30℃恒温摇床中以220rpm转速培养15h。

步骤五、用肉眼直接观察五份样品的颜色，通过对比各种有毒溶液与标准溶液的颜色差异判定样品的毒性大小。结果如图2所示，可以看出，随着3,5-DCP浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d和e的顺序由深绿逐渐变为黄色，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为e＞d＞c＞b。

实施例2

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤四中的培养温度由30℃变为37℃，其他步骤与实施例1相同。检测结果如图3所示，可以看出，随着3,5-DCP浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d和e的顺序由深绿逐渐变为黄色，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为e＞d＞c＞b。

实施例3

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤四中的培养时间由15h变为20h，其他步骤与实施例1相同。检测结果如图4所示，可以看出，随着3,5-DCP浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d和e的顺序由深绿逐渐变为黄色，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为e＞d＞c＞b。

实施例4

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤四中的其余四份培养基加入体积为2mL，浓度分别为25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的Cu²⁺，即五份试样中Cu²⁺的浓度分别为(a)0mg/L,(b)2.5mg/L,(c)5mg/L,(d)10mg/L和(e)20mg/L，其他步骤与实施例1相同。检测结果如图5所示，可以看出，除了标准溶液变为深绿色，加入Cu²⁺的各个溶液颜色和培养前的培养基的颜色没有差别，可见此方法对Cu²⁺的检测比较灵敏，加入少量的Cu²⁺就可以抑制基因工程细菌的繁殖，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒。

实施例5

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤四中的其余四份培养基加入体积为2mL，浓度分别为25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的Zn²⁺，即五份试样中Zn²⁺的浓度分别为(a)0mg/L,(b)2.5mg/L,(c)5mg/L,(d)10mg/L和(e)20mg/L，其他步骤与实施例1相同。检测结果如图6所示，可以看出，标准溶液变为深绿色，加入Zn²⁺的溶液都变为墨绿色，但是随着Zn²⁺浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d和e的顺序逐渐变深。可见加入Zn²⁺可以促进基因工程细菌的繁殖以及电子媒介体的分泌，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为e＞d＞c＞b。

实施例6

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤三和步骤四更换为：在灭菌过的超净台中，将1.8mL除菌后的抗生素加入178.2mL灭菌后的培养基中，将基因工程细菌接种到含有抗生素的培养基中，混匀后，将培养基等体积分装为十份(每份18mL)，其中一份加入体积为2mL的去离子水，其余九份加入体积为2mL，浓度分别为(a)0mg/L,(b)0.78mg/L,(c)1.56mg/L,(d)3.13mg/L,(e)6.25mg/L,(f)12.5mg/L,(g)25mg/L,(h)50mg/L,(i)100mg/L和(j)200mg/L的Hg²⁺，在30℃恒温摇床中以220rpm转速培养15h。其他步骤与实施例1相同。检测结果如图7所示，可以看出，标准溶液变为深绿色，随着Hg²⁺浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d、e、f、g、h、i和j的顺序逐渐由深绿色变为培养基的本色，检测限为6.25mg/L，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为j＞i＞h＞g＞f＞e＞d＞c＞b。

实施例7

基因工程细菌在水体总毒性检测中的应用：

将实施例1步骤四中的其余四份加入体积为2mL，浓度分别为(b)12.5mg/LCd²⁺和12.5mg/LCr³⁺，(c)25mg/LCd²⁺和25mg/LCr³⁺，(d)50mg/LCd²⁺和50mg/LCr³⁺，(e)100mg/LCd²⁺和100mg/LCr³⁺，其他步骤与实施例1相同。检测结果如图8所示，可以看出，标准溶液变为深绿色，随着Cd²⁺和Cr³⁺的混合物浓度的增加，样品颜色依a、b、c、d和e的顺序逐渐由深绿色变为培养基的本色，检测样品和对照样品颜色不一致，待测水样有毒，毒性大小顺序为e＞d＞c＞b。