蚯蚓提取物在催化酮亚胺的不对称Mannich反应中的应用

摘要

本发明公开了一种蚯蚓提取物在催化酮亚胺与羰基化合物的不对称Mannich反应中的应用，通过本发明所述合成方法能够较好地合成一系列手性β‑氨基酮，对映选择性可达87％ee。另外，蚯蚓提取物制备过程简单，属于天然催化剂，为可持续、环境友好的制备手性β‑氨基酮提供了一种新的方法。

说明书

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种蚯蚓提取物在催化酮亚胺的不对称Mannich反应中的应用。

背景技术

手性β-氨基酮是多种天然产物和药物的重要结构组成部分，合成此类化合物的一种有效方法为不对称酮亚胺的Mannich反应。然而，上述反应存在以下缺陷：由于酮亚胺C＝N键两端的取代基位阻大，导致酮亚胺的化学活性不高；酮亚胺常存在E和Z同分异构体，在反应中存在竞争作用，导致反应的选择性不理想。到目前为止，使用酮亚胺有效合成具有对映选择性的β-氨基酮衍生物的方法鲜有报道。考虑到使用Mannich反应合成β-氨基酮衍生物的重要性，开发可持续的、环境友好的催化剂来催化这类反应很有必要。

酶作为一种具有高选择性、反应条件温和、环境友好等特点的生物催化剂，在有机合成领域越来越受到重视。然而酶的纯化过程成本较高、费力费时，导致其规模化生产及应用受到限制。因此，开发简单有效的方法来获取生物催化剂，避免昂贵的酶纯化过程很有必要。蚯蚓消化道内存在大量的水解酶，比如蛋白酶、磷酸酶、纤维素酶等。前期研究发现蚯蚓提取物对三组分串联Mannich-Michael反应等具有良好的催化活性，因此，本研究拟利用蚯蚓提取物催化丙酮和酮亚胺的不对称Mannich反应以寻求更合适的β-氨基酮衍生物的合成方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蚯蚓提取物在催化酮亚胺的不对称Mannich反应中的应用，获得的β-氨基酮具有较好的对映选择性。

本发明采取的技术方案如下：

1、蚯蚓提取物在催化酮亚胺与羰基化合物不对称Mannich反应合成β-氨基酮中的应用。

优选的，所述蚯蚓提取物制备方法包括漂洗、匀浆、离心收集上清液，然后对上清液进行透析浓缩、真空干燥的步骤。

优选的，所述羰基化合物为丙酮。

优选的，所述酮亚胺为结构通式为其中，R¹为H时，R²为4-CH₃，3-CH₃，4-F，4-Cl或3-Cl；R²为H时，R¹为H，4-CH₃，4-F，4-Cl或3-Br。

需要说明的是，4-CH₃表示4位取代的甲基，3-CH₃表示3位取代的甲基，以此类推。

优选的，所述反应的反应溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

优选的，所述反应的反应温度为20-50℃。

优选的，蚯蚓提取物的用量为25-125mg/mL溶剂。

优选的，所述酮亚胺与羰基化合物的摩尔比为0.1:1-6。

优选的，所述反应在甲醇中进行，酮亚胺与羰基化合物的摩尔比为0.1:5，反应温度为25℃，蚯蚓提取物的用量为100mg/mL溶剂。

2、蚯蚓提取物催化酮亚胺与羰基化合物不对称Mannich反应合成β-氨基酮的方法，将酮亚胺、羰基化合物、蚯蚓提取物加入溶剂中，在20-50℃下搅拌反应96小时。

本发明的有益效果在于：本发明通过研究表明蚯蚓提取物对于丙酮和酮亚胺的不对称Mannich反应具有较好的催化作用，通过本发明所述合成方法能够较好地合成一系列手性β-氨基酮，对映选择性可达87％ee。另外，蚯蚓提取物制备过程简单，属于天然催化剂，为可持续、环境友好的制备手性β-氨基酮提供了一种新的方法。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述蚯蚓提取物利用赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)制备而得，其制备方法如下：活蚯蚓经自来水清洗5次，使其尽可能将体内污垢吐出，然后再用去离子水清洗2次，将洗净的蚯蚓(200mL体积)与200mL冰冷去离子水混合匀浆、离心(相对离心力＝4250g，5分钟)，取上清液。然后上清液于4℃下透析浓缩(把装上清液的透析袋埋于蔗糖粉末中)。将浓缩的蚯蚓提取物从透析袋中挤出(注意不要沾染上蔗糖)，放入培养皿中，将培养皿置于真空干燥器内，于25℃下干燥。将干燥的蚯蚓提取物用研钵研磨成粉末状，备用。所得的蚯蚓提取物可在4℃下保存一年(活性不变)。

一、溶剂对反应的影响

以酮亚胺1a^1d和丙酮的Mannich反应为模型，蚯蚓提取物作为催化剂，于25℃下反应96小时，结果列于表1中。数据显示，在Mannich反应中，溶剂对蚯蚓提取物的催化活性和选择性都有很大的影响。反应以DMSO和DMF为溶剂时，分别得到了82％ee和89％ee的高对映选择性，但收率都非常低(表1，序号3和4)。用乙醇作溶剂时，产物ee值为76％，但收率也仅有9％(表1,序号2)。而当反应用甲醇作溶剂时，收率升至18％，同时ee值为58％(表1,序号1)。在CH₂Cl₂、MeCN和EtOAc中，只有微量产物被观察到。为了获得较好的收率，我们选择甲醇作为反应溶剂。

表1.溶剂对蚯蚓提取物催化的不对称Mannich反应的影响^a

^a反应条件:酮亚胺1a(0.2mmol),丙酮(4.0mmol),蚯蚓提取物(30mg),溶剂(1.0mL)在25℃搅拌96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H手性柱)。

二、蚯蚓提取物的用量对反应的影响

为了找到合适的催化剂用量，研究蚯蚓提取物的量对模型反应的影响(表2)。结果显示，当蚯蚓提取物的用量为100mg时，反应得到27％的收率(表2,序号4)，而继续增加蚯蚓提取物的用量时，产物的收率并没有提高。另外，从表中可以看出，催化剂用量对产物的对映选择性没有明显影响。因此，我们选择100mg蚯蚓提取物作为反应的催化剂用量。

表2.蚯蚓提取物的用量对不对称Mannich反应的影响^a

^a反应条件:酮亚胺1a(0.2mmol)，丙酮(4.0mmol)，蚯蚓提取物(25-125mg)，和MeOH(1.0ml)在25℃下搅拌96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H手性柱)。

三、丙酮用量对反应的影响

经过上述优化，反应的收率依然很低。通过对反应进行监测发现在生成少量产物的同时，还有大量酮亚胺1a未参与反应。为进一步提高反应收率，继续探讨丙酮的量对模型反应的影响。当丙酮的用量为2.0mmol时，反应的收率仅为13％(表3,序号1)。在丙酮的量由2.0mmol升至10.0mmol的过程中，反应的收率不断增加。而当反应的原料配比为：丙酮(10.0mmol)，酮亚胺1a(0.2mmol)，反应的收率可达41％。但进一步增加丙酮的用量，反应的收率并没有升高，反而降低了。因此，我们选择10.0mmol为丙酮的最佳用量。

表3.丙酮的用量对蚯蚓提取物催化的不对称Mannich反应的影响^a

^a反应条件:酮亚胺1a(0.2mmol)，丙酮(2.0-12.0mmol)，蚯蚓提取物(100mg)，和MeOH(1.0ml)在25℃下搅拌96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H手性柱)。

四、温度对反应的影响

由于温度是影响酶催化反应的关键因素，对酶稳定性，反应选择性和产率都有显著影响，因此，研究温度对蚯蚓提取物催化Mannich反应的影响是非常有必要的。如表4所示，反应在25℃下进行时，可以得到较好的对映选择性(70％ee)。继续升高温度，反应收率并没有显著提高，但对映选择性有所下降。当反应温度升至50℃，反应的对映选择性明显下降，收率也显著减少。综合考虑，我们选择25℃为最佳反应温度。

表4.温度对蚯蚓提取物催化的不对称Mannich反应的影响^a

^a反应条件:酮亚胺1a(0.2mmol)，丙酮(10mmol)，蚯蚓提取物(100mg)，MeOH(1.0ml)在20-50℃下搅拌96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H手性柱)。

五、反应底物扩展

在上述优化实验条件下对反应底物进行扩展(表5)，结果显示酮亚胺芳环上取代基不同，反应的收率和选择性也会有一定的差异。例如，当酮亚胺中R¹为3-Br时，反应取得最好的收率51％和最高的ee值87％(表5,序号5)。当酮亚胺中R²为4-Cl时，也得到了较好的收率50％和较高的ee值84％(表5,序号9)。而当酮亚胺中R²为3-Cl时，只得到很低的收率5％(表5,序号10)。化合物的对映体过量值和绝对构型是通过高相液相分析，并与参考文献中相应化合物的数据的比较而确定的。

表5.蚯蚓提取物催化的不对称Mannich反应底物扩展^a

^a反应条件:酮亚胺1(0.2mmol)，丙酮(10mmol)，蚯蚓提取物(100mg)，甲醇(1.0ml)在25℃下搅拌72-96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H，OD-H，IC手性柱)。

六、对照实验

我们进行了一系列对照实验，来验证蚯蚓提取物在Mannich反应中的催化作用。从表6中序号1的数据可知，在无蚯蚓提取物的情况下，得不到目标产物。在最优反应条件下，添加蚯蚓提取物，反应的收率达到41％，ee值为70％，表明蚯蚓提取物确实对Mannich反应起到了催化作用。由于盐酸胍和尿素都能破坏蛋白质的三维结构，从而导致酶失活。因此我们用盐酸胍和尿素分别处理蚯蚓提取物，再将处理后的蚯蚓提取物用于催化模型Mannich反应，分别得到了16％和19％的低收率，同时ee值也明显下降(表6,序号3和5)。蚯蚓提取物被苯甲基磺酰氟(PMSF，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)处理之后，催化活性大大降低，只得到了5％的低收率，对映选择性也明显下降(表6,序号7)。另外，由于重金属离子会导致蛋白质分子变性，从而使酶失去活性。因此，我们用AgNO₃和CuSO₄分别处理蚯蚓提取物，再将处理后的蚯蚓提取物用于催化模型Mannich反应。结果显示，AgNO₃处理后的蚯蚓提取物活力明显降低，只得到了5％的低收率(表6,序号9)。CuSO₄处理后的蚯蚓提取物，则完全失去了对模型反应的催化作用(表6,序号11)。上述提到的各种抑制剂本身对模型反应均没有影响(表6,序号4,6,8,10和12)。这些数据表明，在Mannich反应中起催化作用的是蚯蚓提取物中的酶，并且蚯蚓消化道内大量存在的丝氨酸蛋白酶起到关键作用。

表6.对照实验^a

^a除非另有说明，所有反应条件为：酮亚胺1a(0.2mmol)，丙酮(10mmol)，催化剂，MeOH(1.0ml),在25℃下搅拌96小时。

^b经硅胶柱层析纯化后的收率。

^c高效液相色谱测定(AD-H)。

^dn.d.:未检测到产品。

^e蚯蚓提取物(100mg),去离子水(1mL)和盐酸胍(6.0mmol)的混合物在30℃下搅拌8小时，冻干。

^f蚯蚓提取物(100mg),去离子水(1mL)和尿素(8.0mmol)的混合物在30℃下搅拌8小时，冻干。

^g蚯蚓提取物(100mg),THF(1mL)和PMSF(0.6mmol)的混合物在30℃下搅拌2小时，旋蒸除去THF。

^h蚯蚓提取物(100mg),去离子水(1mL)和AgNO₃(0.25mmol)的混合物在30℃下搅拌8小时，冻干。

ⁱ蚯蚓提取物(100mg),去离子水(1mL)和CuSO₄(0.2mmol)的混合物在30℃下搅拌8小时，冻干。

通过上述一系列实验，最终确定反应为：酮亚胺1(0.2mmol)、蚯蚓提取物(100mg)、丙酮(10.0mmol)和MeOH(1.0ml)的混合物在25℃下搅拌反应，通过TLC监测，直到反应不再明显进展，滤去蚯蚓提取物(使用40mm布氏漏斗和定性滤纸)，滤饼用乙酸乙酯洗涤(3×10ml)，旋蒸除去滤液中的溶剂，粗产品通过硅胶柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15-10：1(v/v))，获得目标产物。对映体过量值通过高效液相色谱法利用手性柱测得。相应的外消旋体使用四氢吡咯催化Mannich反应获得。本发明研究表明，蚯蚓提取物对于丙酮和酮亚胺的不对称Mannich反应具有催化作用。通过本发明所述合成方法能够较好地合成一系列手性β-氨基酮，对映选择性可达87％ee。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。