一种哈茨木霉发酵工艺、可湿性粉剂及其应用

摘要

一种哈茨木霉发酵工艺、可湿性粉剂及其应用，本发明涉及一种发酵工艺、可湿性粉剂及其应用领域。本发明的目的是为解决普通哈茨木霉菌株制作成稳定的可湿性粉剂成本高和植物病害防治效果差的问题。本发明的一种哈茨木霉发酵工艺按以下步骤进行：一、原料的选择与处理；二、配制哈茨木霉固态发酵培养基；三、哈茨木霉的发酵。本发明的可湿性粉剂的制作步骤为：将哈茨木霉发酵得到的分生孢子粉、润湿剂、分散剂、增效剂X和载体混合均匀得到可湿性粉剂。本发明的可湿性粉剂对番茄种子具有促进萌发的作用，对番茄白粉病、灰霉病、叶霉病防治效果显著。本发明的哈茨木霉发酵工艺及可湿性粉剂制作用于促进番茄种子萌发和对番茄病害的防治。

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵工艺、可湿性粉剂及其应用领域。

背景技术

番茄是我国栽培和应用最为广泛的蔬菜之一，近年来我国番茄产业发展态势良好。但是在生产中，病害始终是困扰生产者的一大难题。在广大的生产一线，尤其是保护地反季节栽培，常常多种病害同时发生。目前，在生产过程中对番茄病害的控制仍以化学防治为主。长期大量使用化学农药，严重污染环境，农药残留还会损害人畜健康；而且病原菌易产生抗药性，导致防治效果逐年下降。由此，环境友好、安全有效的生物农药及生物防治技术逐渐受到人们的关注。

生物防治是通过利用自然界物种间的关系来达到控制病虫害的目的。生防菌类是生物农药重要成员，它本身是自然界自然存在的东西，不会污染环境和破坏生态平衡。它防病机制多样，可以有效降低病原菌的耐药能力。多数拮抗菌还会刺激植物的生长发育。不仅可以诱导植物产生抗性，激活植物自身防御系统，使植物对病原菌的入侵产生抵抗，而且能够促进植物自身的生长发育，达到促产增收的效果。

哈茨木霉(Trichoderma.harzianum)是一种生防菌，它适应性好，生长范围广，防病机制多样，可以通过竞争作用、重寄生作用、分泌抗生物质等途径对病原菌产生作用，众多研究发现它对很多植物病害防效显著。但是国内市场上商品化的该类制剂却很少，且现有制剂价格偏高，这是由生产成本决定；外界环境对菌剂的影响比较大，防治效果并不稳定。所以把握“降低成本、稳定效果”这一原则，是该类生物农药推广的关键所在。

发明内容

本发明的目的是为解决普通哈茨木霉菌株制作成稳定的可湿性粉剂成本高和植物病害防治效果差的问题，而提供了一种哈茨木霉发酵工艺及可湿性粉剂与应用。

本发明的一种哈茨木霉发酵工艺按以下步骤进行：

一、原料的选择与处理：选取生活垃圾或农业废弃物为原料，烘干后粉碎机粉碎备用；所述生活垃圾为山丁子叶、葡萄叶和菠萝皮，所述农业废弃物为玉米芯和麦麸；

二、配制哈茨木霉固态发酵培养基：将山丁子叶、葡萄叶、玉米芯、菠萝皮和麦麸加入容器内，得到哈茨木霉固态发酵培养基；所述山丁子叶、葡萄叶、玉米芯、菠萝皮和麦麸的质量比为(3-6):(3-6):(3-6):(1-2):(20-41)；

三、哈茨木霉的发酵：取哈茨木霉WY-1菌液加入步骤二配制的哈茨木霉固态发酵培养基内，培养条件为：初始含水量80％-100％，接种量6％-10％，25℃-28℃培养10d-12d完成哈茨木霉的发酵，得到分生孢子粉；所述哈茨木霉菌液的制备方法为：挑取哈茨木霉(Trichodermaharzianum)WY-1接种到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃-28℃摇瓶培养2d-4d，所述的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)WY-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCCNo.12165。

利用上述的哈茨木霉发酵工艺得到的分生孢子粉制备的可湿性粉剂按质量分数包括1％-2％哈茨木霉发酵得到的分生孢子粉、5％-8％润湿剂、3％-6％分散剂和余量的载体；所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠、拉开粉、脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温-80中的一种或几种的组合物；所述分散剂为木质素磺酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐、羧甲基纤维素、聚乙二醇10000中的一种或几种的组合物；所述载体为高岭土、硅藻土、滑石粉、Ca基膨润土、凹凸棒土、沸石粉中的一种或几种的组合物。

本发明的可湿性粉剂的制作方法按以下步骤进行：将哈茨木霉发酵得到的分生孢子粉、润湿剂、分散剂、增效剂X和载体混合均匀得到可湿性粉剂。

本发明的可湿性粉剂的应用：对番茄种子具有促进萌发的作用，对番茄白粉病、灰霉病、叶霉病防治效果显著；具体为哈茨木霉可湿性粉剂100-10000倍液对番茄种子具有明显促进萌发的作用，哈茨木霉可湿性粉剂1000-10000倍液对番茄白粉病、灰霉病、叶霉病防治效果显著。

本发明相对于现有技术的优点：

1.在粉剂的制备中，从能使哈茨木霉更好地适应环境、快速定殖所需的条件考虑，创制增效剂与哈茨木霉粉剂配合使用，通过对白粉病的防治，治疗效果好，药效持效期长。本发明的哈茨木霉可湿性粉剂1000倍液对番茄白粉病、灰霉病、叶霉病防治效果显著，防治效果分别达到82.2％、56.8％、72.4％，效果优于市售哈茨木霉粉剂(57.8％、41.9％、55.8)和化学农药(61.6％、47.2％、43.6％)。该粉剂对番茄种子具有明显促萌发作用，经200-1000倍液浸种处理过的番茄种子，其最高发芽势出现比未处理番茄种子提前2-3d。哈茨木霉可湿性粉剂200倍液，可以显著提高番茄种子的发芽指数、发芽势、胚根长、胚芽长，与对照相比分别提高100.3％、32％、142.3％和86.8％。

哈茨木霉可湿性粉剂100-10000倍液浸种处理均可显著提高番茄的植株生长，其中，株高、根长、茎粗、植株鲜重最大增长率分别为8.4-10.7％、11.0-27％、8.2-10.6％、7.5-34.3％，但是各处理组之间差异较小。

哈茨木霉可湿性粉剂100-1000倍液灌根处理可显著提高番茄的植株生长，且100倍液与1000倍液的效果无显著差异。灌根处理的番茄植株与对照相比在株高、根长、茎粗、植株鲜重的增加分别为20.4％-34.3％、4.1-6.2％、8.3-21.1％、25.1-81.6％。

2.本发明利用生活垃圾、杂草落叶或是一些应用价值不高的廉价农业废弃物为原料，筛选哈茨木霉可用的发酵材料，添加到原有配方中，一方面提高了发酵生物量，另一方面减少麦麸的使用，既降低了发酵成本，同时又废物利用、保护环境。

3.本发明涉及的粉剂具有促生长及防治病害的双重效果，并且粉剂具有效价高、保存期长、施用方便、效果稳定等优点，兼具生物肥料和生物农药的功效。

附图说明

图1为哈茨木霉可湿性粉剂浸种处理对番茄植株长势的影响。其中1为哈茨木霉可湿性粉剂100倍液处理；2为哈茨木霉可湿性粉剂1000倍液处理；3为哈茨木霉可湿性粉剂10000倍液处理；4为对照处理。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的一种哈茨木霉发酵工艺按以下步骤进行：

一、原料的选择与处理：选取生活垃圾或农业废弃物为原料，烘干后粉碎机粉碎备用；所述生活垃圾为山丁子叶、葡萄叶和菠萝皮，所述农业废弃物为玉米芯和麦麸；

二、配制哈茨木霉固态发酵培养基：将山丁子叶、葡萄叶、玉米芯、菠萝皮和麦麸加入容器内，得到哈茨木霉固态发酵培养基；所述山丁子叶、葡萄叶、玉米芯、菠萝皮和麦麸的质量比为(3-6):(3-6):(3-6):(1-2):(20-41)；

三、哈茨木霉的发酵：取哈茨木霉WY-1菌液加入步骤二配制的哈茨木霉固态发酵培养基内，培养条件为：初始含水量80％-100％，接种量6％-10％，25℃-28℃培养10d-12d完成哈茨木霉的发酵，得到分生孢子粉；所述哈茨木霉菌液的制备方法为：挑取哈茨木霉(Trichodermaharzianum)WY-1接种到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃-28℃摇瓶培养2d-4d，所述的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)WY-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCCNo.12165。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤二所述山丁子叶、葡萄叶、玉米芯、菠萝皮和麦麸的质量比为4:4:4:1:27。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三培养条件为：初始含水量100％，接种量7％，28℃培养10d完成哈茨木霉的发酵。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式利用哈茨木霉发酵工艺得到的分生孢子粉制备的可湿性粉剂按质量分数包括1％-2％哈茨木霉发酵得到的分生孢子粉、5％-8％润湿剂、3％-6％分散剂和余量的载体；所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、拉开粉、脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、吐温-80中的一种或几种的组合物；所述分散剂为木质素磺酸钠(M9)、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐(NNO)、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙二醇10000(PEG10000)中的一种或几种的组合物；所述载体为高岭土、硅藻土、滑石粉、Ca基膨润土、凹凸棒土、沸石粉中的一种或几种的组合物。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是，制得的可湿性粉剂在施用时分别加入质量分数为1％-2％的土豆汁和质量分数为1％-2％的甘油作为助效剂。其他步骤与参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式利用具体实施方式四制备的可湿性粉剂的应用为对番茄种子具有促进萌发的作用并且对番茄白粉病、灰霉病和叶霉病防治效果显著。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五不同的是，哈茨木霉可湿性粉剂100-10000倍液对番茄种子具有明显促进萌发的作用而且哈茨木霉可湿性粉剂1000-10000倍液对番茄白粉病、灰霉病和叶霉病防治效果显著。其他步骤与参数与具体实施方式五相同。

实施例1

本实施例的哈茨木霉发酵工艺按以下步骤进行：

以生活垃圾、农业废弃物、枯枝败叶、野生杂草等为原料，筛选可用发酵材料。采集来的原料置于烘箱中60℃烘干后，用粉碎机粉碎待用。取4g山丁子叶、4g葡萄叶、4g玉米芯、1g菠萝皮和27g麦麸加入容器内，得到哈茨木霉固态发酵培养基；然后加入5ml蒸馏水，充分混匀并高压灭菌20min，冷却后再重复一次灭菌。取哈茨木霉WY-1菌液加入哈茨木霉固态发酵培养基内，培养条件为：初始含水量100％，接种量7％，28℃培养10d完成哈茨木霉的发酵，得到分生孢子粉；所述哈茨木霉菌液的制备方法为：挑取哈茨木霉(Trichodermaharzianum)WY-1接种到马铃薯葡萄糖培养基中，28℃摇瓶培养3d。10d后，取出发酵物，置于烘箱中40℃烘干12h后，用粉碎机粉碎，过200目筛后利用梯度稀释的方法测定发酵产物的活孢子浓度。本实施例的产孢量可达2.79×10¹¹CFU/g。

实施例2

候选载体为高岭土、硅藻土、滑石粉、膨润土、凹凸棒土、沸石粉，候选润湿剂为SDBS、拉开粉、JFC、吐温-80，候选分散剂为M9、NNO、CMC、PEG10000，灭菌干燥后全部粉碎过200目筛，分别添加到培养基中，测定载体对哈茨木霉生长速度和分生孢子萌发率的影响。初筛后，将载体与10％过(200目)筛孢子细粉混配，测量其润湿时间和悬浮率。润湿性和悬浮性参照GB/T14825-93农药可湿性粉剂润湿性和悬浮率测定方法并稍作改动。

1)标准硬水配制：称取无水氯化钙0.304g和带结晶水的氯化镁0.139g，于1000mL烧杯中，加600mL水溶解后，倒人100mL容量瓶中。用300mL水分次冲洗烧杯，冲洗液一并倒入容量瓶中，用水将容量瓶定容，摇匀(参照GB/T5451-2001)。

2)润湿性测定：取342mg/L标准硬水100ml注入250ml烧杯中，将此烧杯置于25℃恒温水浴中，使其液面与水浴液面齐平。称取5g试样，将其从与烧杯口齐平位置一次均匀倾倒在烧杯液面上，加样时立即用秒表计时，直至试样全部润湿为止，记下润湿时间，重复测5次取平均值。

3)悬浮性测定：参照GB/T14825-93农药可湿性粉剂悬浮率测定方法稍改动：称取试样0.1g，置于装有10ml标准硬水的离心管(50ml，带盖)中，震荡摇匀，用水稀释至25ml，盖上盖，以离心管底部为轴心，1min内上下颠倒30次，打开盖，30℃水浴静置30min，用吸管轻轻吸取1/10液体，测量该液体中有效成分含量。

通过生物相容性实验筛选出适合的载体、表面活性剂，通过润湿性、悬浮性比较，综合考虑表面活性剂性能及来源、价格等各方面因素，确定载体及表面活性剂添加量，得到哈茨木霉可湿性粉剂配方为1％孢子粉+6％吐温-80+4％NNO+滑石粉(填充)。创制增效剂与其配套使用，以白粉病为对象，增效剂X增效比达69.23％，效果显著(图1)。

本实施例可湿性粉剂的制作按以下步骤进行：

哈茨木霉纯菌接种到PDA培养基中，28℃培养10d后制成孢子浓度为10⁸CFU/ml的孢子悬液，按4％的接种量接种于培养瓶中180rpm震荡培养3d作为种子液，接到固体发酵基质中，28℃培养10d后40℃烘干利用万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集哈茨木霉分生孢子粉。测定分生孢子粉的活孢量，并置于4℃备用。取获得的分生孢子粉1g加入载体、润湿剂5g、分散剂5g制成哈茨木霉分生孢子粉剂。哈茨木霉分生孢子粉剂施用浓度为1000倍液，施用时分别加入1％土豆汁和1％甘油作为助效剂。

(一)哈茨木霉可湿性粉剂促生作用

将哈茨木霉粉剂进行不同浓度稀释，对番茄种子浸种处理，对番茄苗进行灌根处理，探究菌剂浸种、灌根对番茄种子、番茄苗的促生效果，并确定适合的浸种、灌根浓度。结果表明哈茨木霉孢子液浸种对番茄种子具有促进萌发的作用，孢子浓度为1/2×10⁷CFU/ml时，效果最好。菌剂浸种、灌根处理对番茄植株有较好的促生作用，最佳浓度为菌剂1000倍稀释液(表1)。

表1不同菌剂浓度灌根对番茄植株生长的影响

(二)哈茨木霉菌剂对番茄常见病害的防治效果

通过对木霉粉剂进行不同浓度稀释，用于番茄常见病害(灰霉病、叶霉病、白粉病)的防治，以化学药剂(80％多菌灵可湿性粉剂)、市售木霉(美国拜沃3亿/g哈茨木霉可湿性粉剂)为对照，探究创制的菌剂病害防效，并得到合适的使用浓度。哈茨木霉可湿性粉剂对温室地栽番茄白粉病、室内盆栽番茄灰霉病、叶霉病防治效果显著，菌剂1000倍液效果最显著(表2、表3)。

表2哈茨木霉可湿性粉剂对室内盆栽番茄灰霉病的防治效果

表3哈茨木霉可湿性粉剂对室内盆栽番茄叶霉病的防治效果