哈茨木霉H-13固体发酵工艺及其应用效果的研究

摘要

化学肥料和有机合成农药对土壤结构的破坏及生态环境的污染，深化了人们对农产品卫生安全性的认识。我国加入WTO后，农产品的农药残留问题尤为突出，国外的绿色壁垒成为挑战我国农产品出口创汇的首要限制因素。当前无公害绿色食品的生产和消费热潮正在兴起，随着化学物质在农业生产中应用限制越来越严，对于在农业生产中发挥重要增产作用的植物生长调节剂无疑提出了更高的要求。国际粮农组织倾听人类的心声，明确提出了种植业不得使用化肥和农药的要求，迫使无数从事该领域研究工作者去寻找天然微生物和生物源农药，借以保护人类生存环境。由木霉产生的代谢物质不仅对植物的病害有抑制作用，并能促进植物生长，而且还能够改善因长期使用化肥而使土壤结构破坏、污染农产品及危害人畜的状况，有可能成为化学合成生长调节剂的极具潜力的替代品之一。 木霉(Trichoderma,spp)属半知菌类丛梗孢目、丛梗孢科真菌，是一种广泛分布的真菌。哈茨木霉 (Trichoderma harzianum) 是木霉属中应用最为广泛的生防菌，在生物防治及促作物生长中有广阔的应用前景。哈茨木霉作为一种新的微生物肥料开发菌，其遗传学特性不稳定，促生长机制尚不明确，因此采用经过N<'+>离子束诱变，筛选出促作物生长的高产菌株哈茨木霉H-13作为发酵工程菌，研究其固体发酵产物对植物生长生理生化特性的影响，具有重要的应用价值。 本文研究了哈茨木霉H-13固体发酵的工艺，探索了碳源、氮源、磷酸盐、固料比、接种量及发酵温度对产孢量的影响；通过单因素试验和正交试验确定固体发酵基料组成为：麸皮、玉米粉按3:1比例配比；固料比水为1:0.04(g/mL)；速效碳(蔗糖1.5％)；有机氮(蛋白胨1.5％)；无机氮(硝酸铵1％)；无机磷(磷酸二氢钾0.05％)；缓冲盐NaH<,2>PO<,4>-Na<,2>HPO<,4>(0.50％-0.50％)；接种量为9％(mL/g)，发酵温度为22℃～24℃～25℃。在上述条件下发酵9d，产孢量高达1.0×10<'10>个/g以上。固体发酵生产木霉分生孢子，与液体相比具有制作简单、成本低廉、孢子含量高、易于保存和运输等特点。 文中以玉米为供试作物，采用盆栽研究哈茨木霉制剂H-13 对玉米幼苗生理生化特性的影响。结果发现试验组经发酵产物处理的玉米苗生长势、叶绿素含量、植株鲜重及干重明显增加，根系活力增强，过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性比对照组显著增加，其中根系活力、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等指标差异极显著(P<0.01)，说明哈茨木霉制剂对玉米种子的生长势、作物苗生长期间有关生理生化指标有着显著的促进，显示该菌株在促进植物生长方面有较大潜能。 本文采用超声法研究，从木霉固体发酵物提取促植物生长赤霉素的工艺条件，探索了超声波功率、料液温度、提取时间、乙醇浓度、固料比及pH值对提取效果的影响。通过正交试验确定提取工艺最佳条件为：功率360W，提取时间35min，乙醇浓度30％，提取液pH2.0，固料比1:20，料液温度45℃。结果表明：采用超声波提取，由于时间短，易控制，不仅能避免赤霉素在高温下的分解，而且提取效果比常规方法提取高了1.7倍，并能极大地缩短提取时间。因此，这是一种极适宜的提取方法，可以被广泛用于实验室内赤霉素的提取及相关研究，为生物合成赤霉素的开发应用有积极的指导意义。综上所述：本文采用哈茨木霉突变菌株(H-13)作为发酵工程菌，通过考察各种营养物质、发酵条件对哈茨木霉H-13菌株生长和目的物产物的效应，采取固体发酵的方式探索了高效木霉孢子发酵工艺及其应用效果：筛选出廉价的固体发酵培养基并且优化固体发酵条件；盆栽试验确定了木霉制剂使用剂型；正交试验优化了超声波辅助提取赤霉素的工艺，为木霉制剂商品化生产及在工农业生产中的应用提供理论依据和技术参数。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1引言

2材料与方法

2.1试验菌株

2.2仪器与试剂

2.2.1仪器

2.2.2试剂

2.3哈茨木霉H-13固体发酵条件的研究

2.3.1斜面培养基

2.3.2固体发酵方法

2.3.3生物量测定

2.3.4固体培养基的确定

2.3.5外加碳源对产孢量的影响

2.3.6外加氮源对产孢量的影响

2.3.7磷酸盐对产孢量的影响

2.3.8培养基含水量产孢量的影响

2.3.9接种量对产孢量的影响

2.3.10发酵温度对产孢量的影响

2.3.11正交试验

2.4哈茨木霉制剂H-13对玉米幼苗生理生化特性的影响

2.4.1木霉制剂的制备

2.4.2试验设计

2.4.3木霉制剂对黄瓜、辣椒和玉米出苗的影响

2.4.4室内盆栽玉米

2.4.5生物学指标测定

2.4.6叶绿素含量的测定

2.4.7根系活力的测定

2.4.8丙二醛含量的测定

2.4.9过氧化氢酶活性的测定

2.4.10过氧化物酶活性的测定

2.4.11超氧化物歧化酶活性的测定

2.5木霉菌发酵产赤霉素的超声波提取工艺研究

2.5.1发酵方法

2.5.2提取方法

2.5.3赤霉素定量测定

2.5.4提取方法的比较

2.5.5超声波功率对提取效果的影响

2.5.6温度对提取效果的影响

2.5.7超声波作用时间对提取效果的影响

2.5.8溶剂浓度对提取效果的影响

2.5.9料液比对提取效果的影响

2.5.10 pH值对提取效果的影响

2.5.11正交试验

3结果与分析

3.1哈茨木霉H-13固体发酵条件的研究

3.1.1固体发酵培养基的确定

3.1.2外加碳源对产孢量的影响

3.1.3外加氮源对产孢量的影响

3.1.4磷酸盐对产孢量的影响

3.1.5培养基含水量对产孢量的影响

3.1.6接种量对产孢量的影响

3.1.7发酵温度对产孢量的影响

3.1.8正交试验

3.1.9优化条件下哈茨木霉生长及产孢与时间的关系

3.2哈茨木霉制剂H-13对玉米幼苗生理生化特性的影响

3.2.1木霉制剂对黄瓜、辣椒和玉米出苗的影响

3.2.2木霉制剂促进玉米幼苗生长

3.2.3木霉制剂提高玉米苗叶绿素含量

3.2.4木霉制剂提高玉米根系活力

3.2.5木霉制剂降低玉米叶片中丙二醛的含量

3.2.6木霉制剂提高玉米叶片中过氧化氢酶活性

3.2.7木霉制剂提高玉米叶片中过氧化物酶活性

3.2.8木霉制剂提高玉米叶片中超氧化物歧化酶活性

3.3木霉菌发酵产赤霉素的超声波提取工艺研究

3.3.1紫外分光光度法测定赤霉素的标准曲线

3.3.2提取方法的比较

3.3.3超声波功率对提取效果的影响

3.3.4温度对提取效果的影响

3.3.5超声波作用时间对提取效果的影响

3.3.6溶剂浓度对提取效果的影响

3.3.7料液比对提取效果的影响

3.3.8 pH值对提取效果的影响

3.3.9提取条件的优化

4讨论

4.1培养基组成类型对固体发酵效果的影响

4.2理化条件对固体发酵的影响

4.3哈茨木霉制剂H-13对玉米幼苗生理生化特性的影响

4.4木霉制剂使用剂型的研究

4.5木霉菌发酵产赤霉素的超声波提取工艺研究

5结论

参考文献

附图

致谢

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