一种基于PFGE分析菌株之间的差异基因的方法

摘要

本发明公开了一种基于PFGE分析微生物菌株之间的差异基因的方法，采用限制性内切酶对样品基因组进行酶切，酶切后的DNA利用PFGE技术进行分离，对差异条带进行测序比对，得到的序列即为物种间的差异基因。本发明采用脉冲场凝胶电泳系统（PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis）来寻找不同菌株之间的差异基因，PFGE技术在寻找差异基因方面表现出更高的优越性，此方法操作简单，可行性高，价格低廉。采用本发明所述方法，成功发现了属于同一种属不同亚种的菌株在基因水平上的不同，确立了PFGE技术在寻找同种菌株基因片段差异研究的可行性。

说明书

技术领域

本发明属于基因差异分析领域，具体涉及基于PFGE分析相似微生物菌株之间的差异基因的方法。

技术背景

目前寻找物种间差异基因的方法很多，例如基因芯片技术、原位杂交技术、免疫印迹杂交技术等。这些成熟技术具有准确性与高通量等优点，但它们在实际应用中有很大的局限性。

基因芯片技术利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过DNA芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。基因芯片技术具有高通量、并行性及自动化等优点，它的缺点在于不能对多细胞类型组织中的待检测基因进行精确定位.另外很多蛋白质调节其功能不是依赖其是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化-去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义了。

原位杂交技术是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。该技术可以对mRNA进行定位、定性、定量，表达部位很明确，但是定量不精确。

免疫印迹杂交技术是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，在转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法，是进行蛋白分析最流行和成熟的技术之一。但是该法技术复杂，难于操作。

发明内容

脉冲场凝胶电泳系统（PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis）利用有规律地、变化的电场，使得大分子DNA在泳道中不停的改变方向，使得大分子DNA结构趋于线性，易于在凝胶中前行，从而分离开来。在生物技术领域具有较广泛的应用。然而，利用PFGE技术对同种不同亚种菌之间的差异基因进行分析接方法目前还未见报道。本发明针对上述问题，提供了一种基于PFGE分析相似微生物菌株之间的差异基因的方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种基于PFGE分析菌株之间的差异基因的方法，采用限制性内切酶对样品基因组进行酶切，酶切后的DNA利用PFGE技术进行分离，对差异条带进行测序比对，得到的序列即为物种间的差异基因。

一种基于PFGE分析菌株之间的差异基因的方法，包括以下步骤：

1）将被分析的菌株分别制成包裹DNA的PFGE电泳凝胶块，然后采用限制性内切酶对DNA进行酶切处理；

2）利用脉冲场凝胶电泳系统对酶切后的基因进行电泳分离，得到不同的DNA条带；

3)观察不同菌株对应的条带，找出差异条带，切胶回收该差异片段进行克隆测序，得到差异条带对应的基因序列，即得到菌株之间的差异基因序列。

作为可选方式，在上述方法中，所述酶切处理中所述的内切酶为BamHI、EcoRI、PstI、SmaI、HindIII中的至少一种。作为可选方式，所述酶切处理中可以是分别采用了BamHI、EcoRI、PstI、SmaI核酸内切酶对DNA进行单酶切，也可以分别采用EcoRI-HindIII(EH)、EcoRI-BamHI(EB)、BamHI-HindIII(BH)三种组合对DNA进行双酶切。酶切的目的就是将数量庞大的基因分成多段，尽可能的将序列相同的片段排除，从而将重点集中到含有差异基因的位置。

作为可选方式，在上述方法中，所述内切酶的酶切条件表1所示：

表1不同内切酶的酶切条件

作为可选方式，在上述方法中，还包括酶切位点验证步骤，具体为：从NCBI上查阅所述差异基因的序列，对差异序列上的酶切位点进行分析，验证差异序列是否存在与步骤1）中使用的内切酶相对应酶切位点。通过酶切位点验证步骤确认上述差异基因是从基因全长中通过酶切获得的，排除其他干扰。

作为可选方式，在上述方法中，还包括差异基因验证步骤，具体为：以步骤3）的得到的差异基因序列的全长或其片段为模板设计引物，然后使用该引物分别以被分析的菌株为模板进行PCR扩增，电泳检测是否能获得所述差异基因序列的全长或其片段。通过该差异基因验证步骤可以证实上述差异基因序列的确存在于菌株的基因组中。

作为可选方式，在上述方法中，还包括差异基因验证步骤，具体为：从基因库中筛选出一种已知基因作为模板设计引物，然后使用该引物分别以被分析的菌株为模板进行PCR扩增，电泳检测是否能获得该已知基因，所述已知基因中含有与步骤1）中使用的内切酶相对应酶切位点，且该已知基因中该酶切位点一侧的基因序列与所述差异基因某一侧端部的基因片段序列相同或与所述差异基因的全长序列相同。采用该差异基因验证步骤可以在差异基因序列本身被内切酶切断的情况下还原差异基因序列。作为可选方式，筛选出的已知基因与所述差异基因的一致性在85%以上。

作为可选方式，在上述方法中，还包括差异基因功能验证步骤，具体为：将所述差异基因序列的全长或其片段或者将含有差异基因序列的全长或其片段且含有相应酶切位点的已知基因，通过转基因技术导入到本来不含该差异基因的菌株中，获得转基因菌株，然后通过比较非菌株与转基因菌株来验证所述差异基因的功能。

作为可选方式，在上述方法中，所述PFGE电泳凝胶块的制备具体包括：

(1)菌种活化：将菌中接种于培养基中活化培养；

(2)菌体收集：离心收集步骤一种培养得到的菌体；

(3)胶块制备：将菌体与琼脂糖混合制成凝胶；

(4)去细胞壁：向凝胶中溶菌酶，37℃孵育去细胞壁；

(5)细胞裂解：将溶菌酶吸出后，向凝胶中加入细胞裂解液，50℃孵育；

(6)去蛋白：将裂解液吸出后，向凝胶中加入PMSF，50℃处理2次，然后用TE缓冲液冲洗胶块。

作为可选方式，采用上述方法对萎缩芽孢杆菌亚型间的差异基因进行分析。

作为可选方式，在上述方法中，所述电泳分离步骤中，电泳缓冲液为0.5×TBE、电泳温度14℃、脉冲角度120°、电压6V/cm，脉冲转换时间为2.16s-63.8s，电泳时间为7~10h。脉冲转换时间以及电泳时间可以根据实际情况改变，减少脉冲时间有利于小片段的DNA分离，增大脉冲时间有利于大片段的DNA分离，对于萎缩芽孢杆菌来说，DNA经过酶切后大片段较多，如果转换时间过小，则许多大片段将不能分开。电泳总时间影响着DNA片段在凝胶中的分布，本发明优选的电泳时间为9h。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

本发明采用脉冲场凝胶电泳系统（PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis）来寻找两株菌的差异基因，PFGE技术在寻找差异基因方面表现出更高的优越性，此技术操作简单，可行性高，价格低廉。采用本发明所述方法，成功发现了属于同一种属不同亚种的两株相似菌株在基因水平上的不同，弥补了PFGE技术在寻找同种菌株基因片段差异研究的空缺。

附图说明：

图1为Ua菌株和ATCC9372菌株DNA的电泳照片；

图2为实施例1中所述的差异基因验证步骤中的PCR反应电泳图。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例仅以萎缩芽孢杆菌为例对本发明所述方法进行说明，本领域技术人员可以很容易的推广到其他种类的微生物菌株，本发明所述方法具有普适性，采用本方法对其他其他种类的微生物菌株的差异基因进行分析，也落入本发明的保护范围。

主要试剂的配制

Cr(VI)标准溶液(1g/L)：取在110℃下烘干2h的重铬酸钾(K₂Cr₂O₇，成都科龙)2.83g，加去离子水溶解，定容至1L，摇匀.其它各浓度Cr(VI)溶液在由此溶液稀释获得.

二苯碳酰二肼显色液(DPC，成都科龙)：称取0.2gDPC，加入到50mL丙酮中，用蒸馏水定容至100mL.

细胞裂解液：含有1%SDS(成都天泰)、0.5mol/LEDTA、0.01mol/LTris·HCl、0.1mg/L蛋白酶K(大连，TaRaKa)、0.02mol/LNaCl.

PMSF：取0.1742gPMSF(Sigma公司)，溶于10mL无水乙醇中，配制成100mmol/L贮存液，使用时用TE缓冲液稀释至1mmol/L的工作液.

其他试剂均为国产分析纯.

实施例1

PFGE电泳凝胶样品的制备

(1)菌种活化：分别挑取萎缩芽孢杆菌ATCC9372（购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简写为ATCC9372菌株）及萎缩芽孢杆菌Ua（由铀尾矿分离得到，四川省阿坝州若尔盖县铀尾矿库取矿渣样。刮去表层矿渣后，选取表层以下10cm、20cm、50cm的3个不同深度位置进行采样，另取三层的混合矿渣密封备用，实行无菌取样并低温保存。挑取可培养的优势菌株，用Cr(VI)浓度为100mg/L的液体LB培养基筛选，经鉴定为萎缩芽孢杆菌，简写为Ua菌株）单菌落，接种于液体LB培养基中，35℃，120r/min，培养16h。

(2)菌体收集：取2mL菌液于离心管中，4℃，5000rpm，离心5min，去上清后重复本步骤，增加菌体含量。

(3)胶块制备：将得到的菌体重悬于500μL，0.05mol/L的EDTA中，与等体积的2%低熔点琼脂糖(TaRaKa)混匀后加入到制胶模具中，避免气泡产生，每株菌灌制10个胶块，标记好后，加盖放置于4℃冰箱30min。

(4)去细胞壁：凝固好后，将胶块捅出，盛放于2mLEP管中，并向每个胶块中分别加入600μL，20mg/mL的溶菌酶(Sigma)溶液，37℃孵育24h。

(5)细胞裂解：将溶菌酶吸出后，分别向每个胶块中加入600μL细胞裂解液，50℃孵育3h后，更换新鲜裂解液后继续于50℃中孵育16h。

(6)去蛋白：将裂解液吸出后，分别向每个胶块中加入500μL，1mmol/L的PMSF(Sigma)，50℃处理2次，每次2h(注：PMSF现配现用)。然后用TE缓冲液冲洗胶块3次，每次40min。最后将胶块至于600μL，0.5mol/L的EDTA中，4℃冰箱保存。

采用内切酶EcoRI-HindIII组合酶切

(1)取2mLEP管，并标记，向每管中加入180μL灭菌纯水、20μL10×Buffer混匀。

(2)取出样品胶块，放在干净的载玻片上，切成3-4mm宽的胶块，放入离心管中。确保胶块在液面以下。

(3)将EP管放在相应酶切温度的水浴中孵育5-10min。

(4)吸出Buffer向每管中加入170μL灭菌纯水、20μL10×Buffer、5μLEcoRI内切酶和5μLHindIII内切酶后轻轻混匀。在34℃的水浴中孵育6h。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）

(1)溶胶：配制0.5×TBE，用0.5×TBE配制1%PulsedFieldCertified胶(美国Bio-Rad)，放于55-60℃水浴备用。

(2)组装胶槽：按说明组装好胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面接触。

(3)平衡胶块：停止对胶块的孵育，平衡到室温，吸出酶切混合液，向每管加入200μL0.5×TBE,室温平衡5min。

(4)上样：取出胶块，贴在梳子底部，吸去胶块附近多余的液体，室温下风干约5min。

(5)倒胶：从胶槽的下部一侧缓慢到入凉至45℃左右的1%PulsedFieldCertified胶。避免气泡生成。在室温下凝固30min左右，梳子拔出后用1%PulsedFieldCertified胶覆盖加样孔。

(6)调试主机：加入2.5L新配制的0.5×TBE，打开主机和泵的开关，使得泵设在70。打开冷凝机，确保预设温度在14℃。

(7)设置电泳参数：脉冲角度120°、电压6V/cm，脉冲转换时间为2.16s-63.8s，电泳时间为9h。

电泳图片获取及胶回收

(1)电泳结束后取出胶，放在盛放700mL1μg/mL的EB溶液的托盘内，染色40min，于凝胶成像系统中照相观察，ImageLab软件保存并分析结果。

(2)观察分析两株菌的差异条带，切胶回收该差异片段（只存在于Ua菌株对应的凝胶中，如图1所示），放置于事先称重的EP管中，按照MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0(TaRaKa)胶回收试剂盒说明书进行回收。

(3)回收片段通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，进行克隆测序，得到3128bp的差异基因序列，如SEQNO.1所示。

(4)测序结果在NCBI中比对进行Blast比对。差异基因序列起始端碱基AATTC与内切酶EcoRI酶切位点G-AATTC相对应，末端碱基A与内切酶HindIII酶切位点A-AGCTT相对应，这与研究中所用的内切酶相符合。

差异基因验证

经Blast发现，差异序列包含YthA基因序列和YtiB基因序列.将YthA基因序列(1393bp)与差异片段比对后发现YthA基因序列完全包含在差异片段基因序列中，一致性达到41.56%(SEQNO.1中第59~1451个碱基对应的序列)；将YtiB基因序列(568bp)与差异片段比对后发现YtiB基因序列位于差异片段基因序列尾部，共有370bp匹配，一致性达到95.26%(SEQNO.1中第2759~3128个碱基对应的序列)。

利用DNAMAN软件对YtiB基因序列(GeneID:938087)进行分析，得到YtiB基因序列上存在HindIII内切酶酶切位点，使得YtiB基因序列在中间被切断，差异片段中YtiB基因序列表现出不完整性。

利用引物设计软件PrimerPremier6.0设计YtiB基因检测引物，分别以ATCC9372菌株和Ua菌株为模板进行PCR反应，电泳检测YtiB基因的有无。

引物序列1：F：5’-AGGGACAACGAACATGAGTCT-3’

R：5’-AGTCGATCCCGTTCCTGAAA-3’

引物序列2：F：5’-GGATACTCGTCTGGTTGAACTG-3’

R：5’-ACACTCGCTTCCACTGAATCA-3’

引物序列1仅在以Ua菌株为模板的条件下可扩增YtiB基因全基因序列（见图2），序列2仅在以Ua菌株为模板的条件下可扩增YtiB基因序列内324bp的序列（见图2），YtiB基因完整存在于Ua菌株基因组中，而不存在于ATCC9372菌株基因组中。由此证明，该差异基因确实存在，PFGE法寻找差异基因的方法是可行的。

差异基因的Cr(VI)去除功能验证

发明人在研究中发现ATCC9372菌株对Cr(VI)耐受及去除能力明显高于Ua菌株，经分析，上述差异基因序列包含YthA基因和YtiB基因。YthA基因能够编码出细胞色素bd型辅酶氧化酶，该酶常常出现在某些固氮菌中，去除氧或减少氧作为电子传递链的一部分；YtiB基因能够编码出碳酸酐酶，该酶能够催化碳酸分解为二氧化碳和水：HCO₃^--+H⁺→H₂CO₃+H₂O，在细胞内有着维持酸平衡的作用。由此可见，ATCC9372菌株与Ua菌株在对核素的耐受性及去除能力上表现出的不同，有可能是由于这类酶的表达量不同或是由于编码该酶的基因缺失所引起的。两株菌只有在DNA水平有所差异后，通过同种酶切后才能切出不同的条带，而这些基因的差异有很大可能会影响该基因编码的酶类的表达，所以通过研究差异基因能找到ATCC9372菌株与Ua菌株去除核素差异的机理。由于差异条带中包含的YthA基因与NCBI上查阅的序列一致性较低，仅为41.56%，而YtiB基因序列与查阅到的序列(ID:938087)相似度较高，为95.26%，所以选取YtiB基因进行差异基因Cr(VI)去除功能的验证。

利用转基因技术，选取ATCC9372菌株为宿主菌，以pBE-SDNA为载体，将YtiB基因导入ATCC9372菌株中（将导入YtiB基因的ATCC9372菌株命名为ATCC9372-YtiB）得到ATCC9372-YtiB，在含40mg/LCr(VI)的LB培养基中培养，以ATCC9372菌株为对照，每组三个重复。

以ATCC9372菌株为对照，Cr(VI)浓度为0mg/L时，ATCC9372-YtiB菌株的生长状况未发生明显变化，说明转基因操作和目的基因未对菌株造成伤害，但在40mg/LCr(VI)的培养基中，ATCC9372-YtiB对Cr(VI)耐受性出现下降，这可能与菌株对Cr(VI)去除能力的差异有关。ATCC9372菌株的去除能力高于ATCC9372-YtiB菌株.对40mg/LCr(VI)，ATCC9372菌株在48h的去除率达到96.33%，ATCC9372-YtiB菌株仅达到84.38%，去除率下降了约12%，初步说明YtiB基因对Cr(VI)的去除是负相关的。

实施例2

PFGE电泳凝胶样品的制备

(1)菌种活化：分别挑取萎缩芽孢杆菌ATCC9372（购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简写为ATCC9372菌株）及枯草芽孢杆菌168（购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简写为168菌株）单菌落，接种于液体LB培养基中，35℃，120r/min，培养16h。

其余步骤与实施例1相同。

分别采用EcoRI和PstI内切酶进行单酶切

(1)取2mLEP管，并标记，向每管中加入180μL灭菌纯水、20μL10×Buffer混匀。

(2)取出样品胶块，放在干净的载玻片上，切成3-4mm宽的胶块，放入离心管中。确保胶块在液面以下。

(3)将EP管放在相应酶切温度的水浴中孵育5-10min。

(4)吸出Buffer向每管中加入175μL灭菌纯水、20μL10×Buffer、5μLEcoRI内切酶或5μLPstI后轻轻混匀。在37℃的水浴中孵育6h。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）

具体方法与实施例1相同。

电泳图片获取及胶回收

具体方法如实施例1，在EcoRI内切酶单酶切体系中，通过对ATCC9372菌株中特有的一个条带测序得到3031bp的差异基因序列，如SEQNO.2所示；在PstI内切酶单酶切体系中，通过对168菌株中特有的一个条带测序得到1846bp的差异基因序列，如SEQNO.3所示。

如SEQNO.2所示的差异基因序列起始端碱基AATTC和末端碱基G分别与内切酶EcoRI酶切位点G-AATTC相对应，如SEQNO.3所示的差异基因序列起始端碱基G和末端碱基CTGCA为内切酶PstI酶切位点CTGCA-G相对应，分别与所用的内切酶相符合。

差异基因验证

设计差异基因检测引物，分别以ATCC9372菌株和168菌株为模板进行PCR反应，电泳检测差异基因的有无。

引物序列3：F：5’-GAATTCCCGGAGACAGCATTA-3’

R：5’-GGAAACCGATTTTGGGAATTC-3’

引物序列4：F：5’-CTGCAGCCGGGATCGCCGGCT-3’

R：5’-ACGCAAATGAGCCGGCTGCAG-3’

采用引物序列3仅在以ATCC9372菌株为模板时可扩增差异基因SEQNO.2的全基因序列，说明差异基因完整存在于ATCC9372菌株基因组中，而不存在于168菌株基因组中。采用引物序列4仅在以168菌株为模板时可扩增差异基因SEQNO.3的全基因序列，说明差异基因完整存在于168菌株基因组中，而不存在于ATCC9372菌株基因组中。由此证明，对应的差异基因确实存在。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>西南科技大学

<120>一种基于PFGE分析菌株之间的差异基因的方法

<130>0

<160>3

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>3128

<212>DNA

<213>Bacillusatrophaeus

<400>1

aattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcagcttaaggcccagggaacttcaat60

tgcccattttaccttttcttcatttgcatccgtaaagccgccgatcgctaacggcgcatg120

cgacctggtttcaaacagcccttccgctcccgccagtttttccggctgatatttataaag180

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<210>2

<211>3031

<212>DNA

<213>Bacillusatrophaeus

<400>2

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