利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法

摘要

本发明公开一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法，在特定条件下增殖具有高效转化甘油能力的重组大肠杆菌达到高密度，然后在厌氧条件下快速将甘油转化为琥珀酸，所述特定条件是指培养基同时含有甘油和乙酸或其盐作为碳源，发酵初始阶段采用常规有氧培养，维持溶氧水平在10％以上，在菌体达到足够浓度后进入诱导阶段，加入IPTG诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，并限制氧的供应，保持整个诱导阶段溶氧不高于1％。本发明的优点在于：甘油作为生物柴油的副产物，其价格低廉，合成琥珀酸所需的还原力足够，且本发明提供的方法发酵时间短，琥珀酸得率高，具有积极的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸是一种重要的化工原料，是美国能源部在2004年公布的利用可再生资源生产的最有潜力的12种化学砌块之一。它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，可以减少超过250种苯基化学制品的生产和消耗过程中所产生的污染。琥珀酸作为C4平台化合物，可以合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮等。由于可生物降解聚酯等新的下游应用领域的拓展，对琥珀酸的需求量在未来将有很大的增长。现有研究多集中于以糖类为碳源生物合成琥珀酸。

甘油是生物柴油的一种副产物，每生产9kg的生物柴油，便会产生约1kg的粗甘油。随着生物柴油产业的发展，粗甘油的产量也越来越多，其价格也越便宜，有效地将甘油转化为更高附加值的产品显得十分迫切。

厌氧发酵的优点是碳源能够有效地转变为代谢产物，但是大肠杆菌在厌氧条件下且不存在外源电子受体时，不能代谢甘油。近年来有研究发现(BiotechnologyandBioengineering,2006,94(5):821-829)，在控制pH的条件下，大肠杆菌在厌氧时可以代谢甘油。Zhang等(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2010,76(8):2397-2401)通过对大肠杆菌进行代谢改造，使重组大肠杆菌能够在厌氧条件下将甘油转化为琥珀酸，6天厌氧发酵生产的琥珀酸浓度达到13.2g/L。Blankschien等(MetabolicEngineering,2010,12(5):409-419)阻断了大肠杆菌一系列琥珀酸竞争性代谢途径，并引入外源基因编码的丙酮酸羧化酶，构建的重组菌在72小时内琥珀酸产量达到20g/L。不过，大肠杆菌以甘油为碳源进行发酵生产琥珀酸时，代谢甘油慢、琥珀酸产量低的缺点依旧未能得到解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法，其特征在于，所述方法是指在特定条件下增殖具有高效转化甘油能力的重组大肠杆菌达到高密度，然后在厌氧条件下快速将甘油转化为琥珀酸，所述特定条件是指培养基同时含有甘油和乙酸或其盐作为碳源，发酵初始阶段采用常规有氧培养，维持溶氧水平在10％以上，在菌体达到足够浓度后进入诱导阶段，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，并限制氧的供应，保持整个诱导阶段溶氧不高于1％。

作为一个优选方案，甘油在总碳源中比例为60％-80％。

作为一个优选方案，所述菌体达到足够浓度是指菌体密度不低于4-6g干重/L。

作为一个优选方案，诱导阶段溶氧为0—0.1％。

作为一个优选方案，诱导结束后利用CO₂维持厌氧状态。

作为一个优选方案，厌氧阶段的pH通过加入碱式碳酸镁维持在6.3以上。

作为一个优选方案，所述重组大肠杆菌为缺失与琥珀酸生产竞争的一个或多个代谢支路的关键基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因。

传统的两阶段发酵，包括在充分有氧的条件下增殖菌体，再在厌氧条件下将碳源转变为发酵产物。采用这样的方法，重组大肠杆菌在厌氧阶段甘油代谢速率和目标产物水平都非常低，远远不能满足工业生产的需要。乙酸通常是大肠杆菌有氧培养中产生的副产物，而且对大肠杆菌的生长和外源基因表达有极强的抑制作用。传统的大肠杆菌发酵，通过限制碳源供应和代谢工程等手段阻止乙酸的生成以保证发酵的正常进行。本发明采用的技术方案与传统的技术不同，具体表现在：以甘油和乙酸铵或其他盐为混合碳源，有氧增殖细胞。在此阶段中，甘油和乙酸可以同时被代谢。菌体达到一定浓度后进入诱导阶段，加入IPTG，诱导关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)的表达，维持甘油和乙酸的共代谢，并严格控制供氧，使溶氧水平维持在不超过1％。诱导阶段结束后停止通入空气，充入CO₂进行厌氧发酵，将甘油转化为琥珀酸，并通过加入碱式碳酸镁维持pH。采用这样的技术方案培养的大肠杆菌，甘油摄取和代谢的酶系及合成琥珀酸的酶系均处于加强的状态，因而厌氧阶段甘油代谢速率高，琥珀酸的生产水平高，得率接近理论值。

所述菌体达到足够浓度，是希望完成诱导阶段时，菌体能够达到较高密度，以保证在厌氧阶段有较高的甘油摄取速率和琥珀酸生产速率。为此，开始诱导时需要达到足够高的的菌体密度，例如4～6g(干重)/L或更高。

所述诱导阶段，为加入IPTG到开始厌氧发酵之间的阶段。诱导阶段须保证通入空气，但必须严格控制，溶氧必须维持在不超过1％的水平，优选溶氧控制在0—0.1％。通气的控制对琥珀酸的生产极其重要，通气过量或不足都会严重影响厌氧阶段甘油的利用和琥珀酸生产。

本发明的优点在于：甘油作为生物柴油的副产物，其价格低廉，合成琥珀酸所需的还原力足够，且本发明提供的方法发酵时间短，琥珀酸得率高，具有积极的工业应用前景。另外，甘油转化为琥珀酸的过程是由三碳变四碳的过程，此过程伴随着CO₂的固定，有助于减少温室气体的排放。

附图说明

图1为利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的代谢途径。

图2为实施例5发酵结果。

图3为实施例6发酵结果。

图4为实施例7发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.

野生型大肠杆菌MG1655作为出发菌株进行代谢工程改造。采用RED重组技术阻断其琥珀酸生产的竞争性途径乳酸脱氢酶(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)获得工程菌MLB。将MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pck)克隆并连接到pTrc99a上，构建质粒pTrc99a-pck，将此质粒转化入上述基因工程菌MLB。在以下实施例中，均采用MLB/pTrc99a-pck进行以甘油生产琥珀酸的发酵，有氧生长阶段培养基添加有100mg/L的氨苄青霉素。该菌株由甘油合成琥珀酸的代谢途径如图1所示。

实施例2.

将1mL在甘油管中冷冻保存的菌种MG1655，ML(缺失ldhA)，MB(缺失pflB)和MLB分别接入250mL含有30mLLB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L)的摇瓶中，于37℃、220rpm下有氧培养8小时。取培养好的菌液2mL接入装有100mLM9培养基的500mL摇瓶中，碳源为5g/L甘油，培养12小时。M9培养基含(g/L)：Na₂HPO₄·12H₂O15.12，KH₂PO₄3，NH₄Cl1，NaCl0.5，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCl₂0.011，添加1％的维生素B1溶液0.2mL/L和微量元素混合液0.2mL/L。微量元素混合液组成为(g/L，溶于3mol/LHCl中)：FeSO₄·7H₂O80，MnSO₄·nH₂O10，AlCl₃·6H₂O10，CoCl₂4，ZnSO₄·7H₂O2，Na₂MoO₄·2H₂O2，CuCl₂·2H₂O1，H₃BO₄0.5。无菌离心收集菌体，悬浮于含有15g/L甘油并不含NH₄Cl的M9培养基中，菌体浓度在干重5g/L左右。厌氧发酵在50mL的SEBC瓶中进行，装入20mL上述菌体悬浮液，加入20g/L的碱式碳酸镁，SEBC瓶充入CO₂，密闭瓶盖后于37℃，220rpm下培养72小时。

发酵结果如表1所示，其中两缺失菌株MLB的琥珀酸产量和得率最高。

表1

实施例3.

同实施例2，将1mL在甘油管中冷冻保存的菌种MLB/pTrc99a-pck于LB培养基中有氧培养8小时，再将2mL菌液于碳源分别为5g/L甘油，或3g/L甘油加2g/L乙酸钠，或5g/L乙酸钠的M9培养基中培养8或10小时，然后加入0.1mMIPTG诱导4小时。无菌离心收集菌体，同实施例2厌氧培养72小时。

与单一碳源的乙酸盐或甘油相比，甘油和乙酸盐混合碳源培养的菌体在厌氧发酵中琥珀酸比生产速率分别提高44.1倍和1.8倍，结果如表2。

表2

实施例4.

同实施例3将在甘油管中冷冻保存的菌种MLB/pTrc99a-pck1mL接入LB有氧培养8小时，再将1mL，2mL和3mL培养好的菌液分别接入装有50mL，100mL和150mLM9培养基的500mL摇瓶中培养8小时，碳源为3g/L甘油加上2g/L乙酸钠，然后加入0.1mMIPTG诱导4小时。无菌离心收集菌体，同实施例3厌氧培养72小时。发酵结果如表3所示，装液量100mL时琥珀酸产量和比生产速率最高。

表3

实施例5.

同实施例3将1mL在甘油管中冷冻保存的菌种MLB/pTrc99a-pck接入LB培养基中有氧培养8小时。将培养好的30mL菌液接入装有1L发酵培养基的1.5L发酵罐中，初始碳源为50g/L甘油和10g/L乙酸铵。发酵培养基成分为(g/L)：Na₂HPO₄·12H₂O3.75，KH₂PO₄0.75，NH₄Cl1，NaCl0.5，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCl₂0.011，1％维生素B1溶液0.2mL/L，微量元素混合液0.2mL/L。

初始通气量为1vvm，搅拌转速300rpm，在15小时加入0.5mM的IPTG，全过程中调节搅拌转速和通气量使溶氧维持在10％以上，诱导4小时后转入厌氧阶段，通入CO₂维持厌氧状态，并加入20g/L的碱式碳酸镁。发酵过程中当甘油浓度低于5g/L时则加入甘油，当pH低于6.3时添加10g/L的碱式碳酸镁。

发酵结果如图2所示。发酵134小时，其中厌氧发酵阶段持续115.5小时，琥珀酸的终浓度达到8.9g/L，琥珀酸得率为73％，在厌氧发酵阶段琥珀酸的生产速率仅有0.075g/(L·h)。

实施例6.

同实施例5将MLB/pTrc99a-pck在1.5L发酵罐中培养，在24小时加入IPTG，保持培养基中甘油和乙酸的存在，诱导阶段通气量维持在2vvm，搅拌转速850-900rpm，溶氧维持在0。诱导4小时后同实施例5转入厌氧阶段，发酵结果如图3所示，

发酵131小时，其中厌氧发酵阶段持续103小时，琥珀酸的终浓度达到49.1g/L，厌氧发酵阶段琥珀酸的生产速率为0.476g/(L·h)，比实施例5提高了5.35倍。

实施例7.

同实施例5将MLB/pTrc99a-pck在1.5L发酵罐中培养，在26小时加入IPTG，诱导阶段通气量维持在1.5vvm，搅拌转速850-900rpm，溶氧维持在0。诱导4小时后同实施例5转入厌氧阶段，发酵结果如图4所示，发酵207小时，其中厌氧发酵阶段持续177小时，琥珀酸的终浓度达到109.4g/L，琥珀酸得率为95％；在整个厌氧发酵阶段琥珀酸的生产速率达到0.618g/(L·h)，比实施例5提高了7.2倍，比实施例6提高了30％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。