受阿拉伯糖-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用

摘要

本发明涉及一种受阿拉伯糖-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。首次揭示一种受“阿拉伯糖-细菌密度”二元信号调控的蛋白表达系统(araQS)。巧妙地应用细菌群体感应系统与阿拉伯糖启动子araC-P

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及一种受阿拉伯糖-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。

背景技术

细菌细胞能够释放一种称为自诱导物(Autoinducer，AI)的小分子化学物质，自诱导物随着附近环境中的菌体浓度增加而逐渐积累，当其浓度达到某个阈值时会被细菌检测到并产生响应，使得菌体统一产生基因表达的变化，这个过程被称为群体感应(QuorumSensing，QS)。微生物的群体感应系统是近几年来备受关注的细菌之间相互交流的群体调控机制。其中，最显著的是在费氏弧菌中lux群体感应系统调控了该微生物的生物发光现象。该系统不但首先被人们发现，并且作为典型的革兰氏阴性菌的群体感应系统被详细研究，从自诱导物合成酶的作用机制、自诱导物的详细结构、受体蛋白-自诱导物复合物与DNA的结合方式，最终到整个系统所调控的基因功能，每个方面的点滴发现总能为人们研究微生物的相互通讯提供重要参考。群体感应系统中自诱导物与受体蛋白的结合特异性，调控基因和信号转导中体现出的多样性和复杂性，以及在病原菌中该系统与致病能力的密切联系，使得该机制已成为生物学、医学等领域的研究热点。

群体感应可以通过多种途径进行抑制，在自然生态系统中，大量不同的微生物生活在同一环境中，其中某些微生物能够通过产生某些物质阻断群体感应系统，这个过程称为群体淬灭(QuorumQuenching，QQ)。孢杆菌属的许多细菌如苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生金属依赖性β-内酰胺酶AiiA，能够降解酰基高丝氨酸内酯(如费氏弧菌产生的3-oxo-C₆-HSL)的内酯环，从而达到关闭群体感应的目的。

细菌的群体感应与群体淬灭回路中的各个元件在许多人工基因回路中担任重要的角色，实现了众多生物学功能，研究者们将群体感应系统本身进行重排或者与其他基因相互耦合，构建出许多复杂的人造系统，但是这些系统大多数仅是利用该系统对自然现象的重现或对功能的模拟，真正应用到生产生活中的则很少。因此，如何利用该系统的各方面特性，充分挖掘其实际用途成为基因工程领域的一个重要研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受阿拉伯糖-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于二元信号调控的表达构建物，所述表达构建物包括：细菌群体感应系统编码序列；和阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD调控表达的群体淬灭基因aiiA序列；两者操作性连接。

在一个优选例中，所述的表达构建物中，还包括位于各序列之间以及各序列两端的限制性内切酶位点；特别是包括用于插入外源蛋白编码序列的位点。

在另一优选例中，所述的细菌群体感应系统是基于费氏弧菌(Vibriofischeri)体内系统构建的细菌群体感应系统；较佳地为luxR-PluxR-PluxI-luxI系统。

在另一优选例中，所述的表达构建物中还包括：外源蛋白的编码序列，其与所述的细菌群体感应系统编码序列和操作性连接；且，所述的外源蛋白的表达受到阿拉伯糖浓度以及细菌浓度的双重调控。

在另一优选例中，所述的群体淬灭基因aiiA来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。

在另一优选例中，所述的细菌群体感应系统编码序列包括(按照5’→3’)：LuxR编码序列，LuxR启动子，LuxI启动子，LuxI编码序列。

在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列位于LuxI编码序列的下游。

在另一优选例中，外源蛋白的编码序列与LuxI基因之间存在核糖体结合位点，即两者呈共转录的关系，LuxI基因和外源蛋白的编码基因都受LuxI启动子的控制，luxI基因与外源蛋白的编码基因中间存在核糖体结合位点序列，保证外源蛋白的编码序列可以顺利被翻译成蛋白。

在另一优选例中，所述的外源蛋白是GAPDH蛋白或报告基因蛋白。

在另一优选例中，所述的阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD调控表达的群体淬灭基因aiiA序列包括操作性连接的：araC序列，P_araBAD启动子和aiiA序列。

在另一优选例中，所述的LuxR编码序列、LuxR启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1中第2523-3275位所示；

所述的LuxI启动子、LuxI编码序列如SEQIDNO:1中第3494-4075位所示；

所述的araC序列如SEQIDNO:1中第1126-2004位所示；

所述的P_araBAD启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1中第782-1095位所示；

所述的aiiA的核苷酸序列如SEQIDNO:1中第29-781位所示。

在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的报告基因蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1中第4090-4797位所示。

在另一优选例中，所述的表达构建物具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种调控外源蛋白表达的方法，所述方法包括：将所述的表达构建物转化宿主菌；从而，当所述宿主菌在含有阿拉伯糖的环境中时，重组表达系统处于“群体淬灭”状态，不表达外源蛋白；但所述宿主菌在缺乏阿拉伯糖的环境中并且菌浓达到使宿主菌产生响应的阈值，重组表达系统处于“群体感应”状态，表达外源蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种重组的宿主菌，所述宿主菌中包含所述的表达构建物。

在一个优选例中，所述的宿主菌是存在群体感应系统的革兰氏阳性或革兰氏阴性菌。

在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于对外源蛋白进行双重调控，所述的双重调控包括：基于阿拉伯糖浓度的调控以及基于细菌浓度的调控；或

用于体内(包括细胞内或动物体内)荧光示踪；其中，所述的外源蛋白是报告基因蛋白；或

用于转入WED多价载体减毒疫苗株以制备疫苗，所述的疫苗免疫后使得动物产生对迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抵御能力；所述的表达构建物是所述的表达构建物且所述的外源蛋白是GAPDH蛋白。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、araQS系统质粒示意图。

图1B、araQS系统核心基因结构以及调控原理示意图。

图2、araQS系统在有/无阿拉伯糖环境中单位菌体相对荧光表达量。

图3、araQS系统在高菌浓和低菌浓环境中单位菌体相对荧光表达量(*表示有显著差异)。

图4、araQS系统在不同宿主中的荧光表达。

图5、携带araQS系统的迟钝侵染J774的荧光表达图像。

图6、携带araQS系统的迟钝侵染斑马鱼幼鱼的荧光表达图像。

图7、多价载体质粒araQS-gapA34示意图。

图8、大菱鲆感染嗜水气单胞菌累积死亡率(A)和WED(araQS-G)疫苗株的相对免疫保护力(RPS)(B)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种受“阿拉伯糖-细菌密度”二元信号调控的蛋白表达系统(araQS)。巧妙地应用细菌群体感应系统与阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD调控表达的群体淬灭基因aiiA相结合，使得外源蛋白的双重调控(包括：基于阿拉伯糖浓度的调控和基于细菌浓度的调控)表达成为可能。

术语

如本文所用，所述的“表达构建物(或称DNA构建物)”或“表达构建体(或称DNA构建体)”指一种已经通过人为干预修饰，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，代表本领域所共知的含义，表示一个基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶结合的DNA序列和转录的起始点。

如本文所用，所述的“二元信号调控”与“双重调控”可互换使用，均是指使外源蛋白受到(i)阿拉伯糖浓度以及(ii)细菌浓度的二重调控。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是“外源”的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源”的。

如本文所用，“外源蛋白(基因)”是指欲(拟)调控的蛋白(基因)，也即由本发明的方法调控表达的蛋白(基因)。

如本文所用，所述的“动物”指非人动物，更特别地为非哺乳动物的动物，如鱼类。

如本文所用，所述的“含有阿拉伯糖的环境”一般是指阿拉伯糖浓度高于0.1mg/ml，更特别地例如高于0.2mg/ml、高于0.3mg/ml或高于0.4mg/ml的环境。所述的“缺乏阿拉伯糖的环境”一般是指阿拉伯糖浓度低于0.4mg/ml量，更特别地例如低于0.3mg/ml、低于0.2mg/ml、低于0.1mg/ml或无阿拉伯糖的环境。本领域技术人员应理解，当本发明的表达构建物转化不同的宿主菌或将转化的宿主菌在不同的系统中培养时，可允许所述的“含有阿拉伯糖的环境”或“缺乏阿拉伯糖的环境”有上下的浮动，这种浮动是本领域技术人员根据本发明的思路易于进行调整的。

如本文所用，所述的“菌浓达到使宿主菌产生响应的阈值”一般是指菌浓在OD₆₀₀＝0.1-0.8范围内，较佳地0.3-0.4范围内。本领域技术人员应理解，当本发明的表达构建物转化不同的宿主菌或将转化的宿主菌在不同的系统中培养时，可允许该阈值有上下的浮动，这种浮动是本领域技术人员根据本发明的思路易于进行调整的。

如本文所用，所述的“阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD调控表达”是指阿拉伯糖启动子P_araBAD受到araC编码的蛋白的调控，发生开启或关闭，该调控表达系统是本领域已知的。

基本原理

本发明的二元信号调控外源蛋白表达的原理为：

(i)基于阿拉伯糖的调控：当包含本发明的表达构建物的宿主菌在含有阿拉伯糖的环境中生长时，阿拉伯糖启动子开启，表达内酯酶蛋白AiiA，自诱导物被迅速降解为无功能的小分子，宿主菌处于群体淬灭状态，外源蛋白表达关闭；当包含本发明的表达构建物的宿主菌在缺乏阿拉伯糖的环境中生长时，在AraC调控下，P_araBAD关闭，AiiA蛋白不表达，不会导致宿主菌产生群体淬灭。

(ii)基于宿主菌浓度的调控：当所述宿主菌在缺乏阿拉伯糖的环境中，且菌浓达到使宿主菌产生响应的阈值时，开启外源蛋白的表达。

表达构建物和宿主菌

本发明提供了一种二元信号调控的表达构建物，其包括：细菌群体感应系统编码序列和阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD调控表达的群体淬灭基因aiiA序列，两者操作性连接。

所述的群体感应(QS)系统来自于多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中。作为本发明的优选方式，所述的QS包含两个重要组分：LuxR表达系统和LuxI表达系统，LuxR为转录调节蛋白，与信号结合来偶联基因的表达；LuxI蛋白为合成信号分子的酶，其合成信号分子AHLs。随着细菌群体密度增大，AHLs浓度不断增加，达到一定的阈值时，与LuxR蛋白结合，形成的LuxR蛋白-AHLs复合物可激活目的基因(其表达外源蛋白)的表达。

当包含本发明的表达构建物的宿主菌在含有阿拉伯糖的环境中生长时，结合阿拉伯糖的AraC蛋白呈现为诱导的状态，其能够招募RNA聚合酶结合到启动子P_araBAD上，使得启动子P_araBAD开启，驱动其下游aiiA基因表达；aiiA基因表达的群体淬灭蛋白AiiA，能够将群体感应自诱导物3-oxo-C6-HSL降解，关闭群体感应系统。反之，当包含本发明的表达构建物的宿主菌在不含有阿拉伯糖的环境中生长时，单纯的AraC蛋白呈现为阻遏蛋白的状态，其能够结合到启动子P_araBAD的特定位置上，改变启动子P_araBAD的空间结构，使得启动子P_araBAD关闭，其下游aiiA基因不表达，群体感应系统不受影响。

本领域技术人员一般认为，蛋白或其编码基因之间的相互融合通常会导致蛋白或基因功能的相互影响，导致活性发生变化。然而，本发明人出乎意料地发现，在所述的QS系统中的适当位置，连接上araC-P_araBAD调控表达的群体淬灭基因aiiA的表达系统，对于QS系统的功能并没有影响。该发现使得构建本发明的二重调控系统成为可能。

作为本发明的优选方式，所述的外源蛋白的编码序列位于LuxI编码序列的下游。该位置上，其能够受到群体感应系统以及AiiA的良好调控。

本发明的构建物中，各元件之间还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还可包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主菌。在本发明的方法中，所述的宿主菌可以是革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法；常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

表达方法

本发明还提供了一种调控外源蛋白表达的方法，包括：将本发明所述的表达构建物转化宿主菌；从而，当所述宿主菌在含有阿拉伯糖的环境中时，重组表达系统处于“群体淬灭”状态，不表达外源蛋白；但所述宿主菌在缺乏阿拉伯糖的环境中并且菌浓达到使宿主菌产生响应的阈值，重组表达系统处于“群体感应”状态，表达外源蛋白。

在本发明的具体实施例中，从费氏弧菌lux群体感应基因出发，构建了受密度信号依赖的表达回路，最终获得了产量较高的群体感应表达系统。基于上述细菌密度依赖的一元信号调控表达系统，本发明人通过添加阿拉伯糖启动子、群体淬灭基因等基因元件，进一步将“阿拉伯糖”信号引入其中，使细菌密度依赖的一元表达系统升级为同时受到了多元信号的综合控制，构建了“阿拉伯糖-细菌密度”二元调控蛋白表达系统araQS。对上述系统在体外模拟信号的条件下进行表达检测，发现上述二元调控表达系统araQS能够受到多种信号的严格调控，表明群体感应系统经过修饰、改造后可改变原有单一的密度依赖的表达特性，升级为受多重信号调控的表达系统。上述二元调控表达系统在不同细菌宿主中表达性能良好，为在不同宿主菌中的应用奠定了基础。

在进一步的具体实施例中，本发明人以红色荧光基因katushka作为报告基因，以鱼类病原微生物迟钝爱德华氏菌减毒疫苗株WED作为细菌载体，选择J774巨噬细胞以及斑马鱼幼鱼和成鱼作为体内环境，系统分析了上述二元调控表达系统在体内环境的表达规律，发现无论在巨噬细胞还是斑马鱼体内，这个系统能够有效地响应体内信号的调控，开启表达红色荧光，反映了该系统响应体内信号而开启蛋白表达的特性。

在更进一步的具体实施例中，本发明人将嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的有效保护性抗原GAPDH连入上述二元调控表达系统，转入到E.tardaWED减毒疫苗株中开发成为细菌多价载体疫苗候选株，并以大菱鲆(Scophthatmusmaximus)为临床实验动物进行了疫苗免疫保护效力评价，发现接种上述候选疫苗株的大菱鲆对迟钝爱德华氏菌野生株EIB202和嗜水气单胞菌毒株LSA34的注射攻毒产生了良好的免疫保护能力。

本发明采用直接对细菌群体感应回路进行改造的方式，使群体感应表达回路不仅受到细菌密度的控制，而且受到培养环境中阿拉伯糖浓度的影响。该方式构建的系统结构简单，调控有效，且大大降低了培养过程中的代谢负担。

本发明以最简约的改造方式赋予群体感应表达系统“限阿拉伯糖启动”的新特性，构建了响应“阿拉伯糖-细菌密度”二元信号的表达调控系统。该系统能够响应阿拉伯糖信号，继而开启群体感应系统的表达。本发明的技术方案具有良好的生产应用价值。

应用

本发明构建的二元信号调控系统以及转化有该二元信号调控系统的宿主菌具有多方面的用途，包括但不限于：

(i)用于在细胞内或动物体内调控外源蛋白的表达，使得外源蛋白在特定的环境下进行表达，可实现时空可调性地表达。

(ii)用于进行宿主菌的示踪：将所述的外源蛋白设置为一种报告基因蛋白，从而当在缺乏阿拉伯糖环境下发生表达时，实现宿主菌的示踪。该过程也包括在动物体内进行宿主菌的示踪。所述的报告基因可以是荧光蛋白的编码基因或荧光素酶基因等。

(iii)用于载体疫苗的制备：将所述的外源蛋白设置为一种特定的抗原蛋白(当其在体内表达时，能够诱导抗体的产生)，藉由二元调控系统调控抗原蛋白的表达，实现抗原在体内的可调性地表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

将苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)群体淬灭基因aiiA引入到群体感应表达系统中，作为调控表达系统的开关。aiiA基因表达的群体淬灭蛋白AiiA，能够将群体感应自诱导物3-oxo-C₆-HSL降解，关闭群体感应系统。另外，引入阿拉伯糖启动子P_araBAD来控制aiiA基因。当宿主在含有阿拉伯糖的环境中生长时，在araC感应下，P_araBAD启动子开启了aiiA基因的表达，系统处于“群体淬灭”状态，系统不会表达外源蛋白；一旦将阿拉伯糖从培养环境中去除，在araC感应下，P_araBAD启动子关闭，系统即处于“群体感应”状态，外源蛋白就会得到高效表达。

实施列1、“阿拉伯糖-细菌密度”二元信号调控的蛋白表达系统araQS的基因构建

以费氏弧菌VibriofischeriES114(购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，平台资源编号1535C0001000010071)基因组为模板为模板，以QS-F和QS-R为引物(表1)，将费氏弧菌(VibriofischeriES114)luxR-PluxR-PluxI-luxI(简写为qs)进行扩增制备基因片段1；以红色荧光蛋白Katushka编码序列为模板，以ka-F和ka-R为引物，将红色荧光报告基因katushka进行扩增制备基因片段2；以pUTat质粒为模板，以pUT-F和pUT-R为引物，将pUTat质粒(pUTat质粒制备：将商业质粒pUC18(TaKaRa公司)使用PvuII/NdeI双酶切，除去其中的lac启动子和多克隆位点；继而替换成pBV220质粒(张智清，中国预防医学科学院病毒学研究所)中的多克隆位点和rrnBT1T2转录终止位点。最后将pUC18中的复制子替换为pAT153质粒中的复制子(参见XiaoY等，Vaccine.201129:6986-93；GuanL等，Infectionandimmunity.201179:2608-18))进行反向PCR扩增并线性化制备基因片段3。三个基因片段之间有多个碱基相互同源，使用无缝克隆试剂(ClonExpressIIOneStepCloningKit，南京诺唯赞生物科技有限公司)将其重组为完整的质粒pUTat-qs-katushka。

以pBad/HisA质粒(Invitrogen公司)，以ara-F和ara-R为引物，将阿拉伯糖启动子araC-P_araBAD进行扩增；以苏云金芽孢杆菌Bt4Q7基因组为模板，以aiiA-F和aiiA-R为引物，将群体淬灭基因aiiA进行扩增；使用pUT-F2引物和pUT-R2引物将上述构建的质粒pUTat-qs-katushka进行反向扩增并线性化。这三个基因片段之间仍有多个碱基相互同源，继续使用无缝克隆的方式进行拼接，形成完整的质粒，基因形式为pUTat-qs-katushka-TT-araC-P_araBAD-aiiA，该系统的示意图如图1A-B所示，该系统称为araQS(aiiA)。其中，pUTat质粒中自带的TT将qs-katushka模块和araC-P_araBAD-aiiA分隔开，一定程度避免两模块在转录水平上的相互干扰。

将构建完成的专利以CaCl₂转化法转化大肠杆菌(Top10)。

表1

实施列2、检测“阿拉伯糖-细菌密度”二元系统araQS响应阿拉伯糖信号的表达规律

携带上述表达系统的大肠杆菌宿主分为两组，分别在含有阿拉伯糖和不含有阿拉伯糖的LB培养基(向常规LB培养基中添加阿拉伯糖至终浓度为0.4mg/ml)中进行培养，10h之后离心，使用PBS清洗菌体并将OD₆₀₀定为1，各取100μl悬浊液加入96孔板，置于荧光酶标仪中检测单位菌体量的相对荧光值，结果如图2。

相对于空白对照菌株(相对荧光值RFV为300左右)，在没有阿拉伯糖的培养基中，含有araQS(aiiA)系统的宿主表达出了强烈的荧光(相对荧光值RFV为13000左右)。这说明，在没有阿拉伯糖的环境中，阿拉伯糖启动子的关闭状态很严谨，几乎没有群体淬灭蛋白AiiA的表达，群体感应系统完全处于开启表达状态，生产了足量的目的蛋白。这也说明，虽然加入了araC-P_araBAD-aiiA模块，在其关闭状态下，并不会对群体感应系统的开启产生影响，也不会降低系统的表达量。在预先添加阿拉伯糖的培养环境下，宿主表达的荧光值相对于系统开启表达时有了大幅下降(相对荧光值RFV为2000左右)，系统明显处于群体淬灭状态。这表明阿拉伯糖开启了P_araBAD启动子，产生了大量的AiiA群体淬灭蛋白，有效降解了菌体内的自诱导物，关闭了群体感应系统和目的基因的表达。

实施列3、“阿拉伯糖-细菌密度”二元系统araQS响应细菌密度信号的表达

作为对照的pET表达系统：将katushka基因通过NcoI/BamHI双酶切位点连接到表达质粒pET28-a(购买于Novagen公司)上，使其受到pET28a质粒上T7启动子的控制，将该质粒pET28-a-katushka转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。该系统的表达受环境中IPTG诱导物浓度的控制，诱导时添加的诱导物IPTG浓度为1.0mmol/L。该表达系统具有表达效率高的特点，但是不具备响应细胞密度的特性。因此，以此作为对照。

将前述制备的携带araQS系统的大肠杆菌宿主与携带作为对照的pET表达系统的宿主分别在持续低密度环境和正常的生长环境下进行培养。培养基中均不添加阿拉伯糖，以抑制群体淬灭基因aiiA的表达，开启群体感应系统。经过相同时间后，检测两株菌在不同环境下的相对荧光强度，结果如图3所示。

使用T检验来分析两种菌株在不同环境下表达量的差异。araQS系统的p值远小于0.05，说明其在不同菌体浓度下的RFV具有显著差异。虽然araQS系统的RFV相对于对照pET表达系统偏低，但是在不同细胞浓度下的表达量差别巨大。尽管在检测过程中，培养基里不添加阿拉伯糖，没有表达aiiA基因，但是低密度培养环境下，系统仍然感受到了低细胞浓度信号，关闭了群体感应系统。在正常培养环境中，系统感受到了高细胞浓度信号，开启表达。这证明了该系统仍明显受细菌密度信号的影响，具有群体感应依赖特性。

实施列4、检测“阿拉伯糖-细菌密度”二元系统araQS在多种细菌宿主中的适应性

能够适应不同的宿主环境是一个优秀表达系统的重要指标。将前述制备的araQS系统使用钙转化或电转化的方式分别转入迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中。携带有该系统的各宿主分为两组，分别在含有阿拉伯糖的培养基(向常规LB培养基中添加阿拉伯糖至终浓度为0.4mg/ml)中和空白LB培养基(常规LB培养基)中进行培养，9h后，用PBS将各组清洗，OD₆₀₀定为1，置于荧光酶标仪中进行相对荧光表达量的检测，考察在阿拉伯糖环境中系统的严谨性和无阿拉伯糖环境中系统的表达量。

其结果如图4所示。在三种不同的表达宿主中，araQS系统均能在添加阿拉伯糖的环境中维持较低的漏表达量，而在不含有阿拉伯糖的培养基中均产生了比较高的荧光表达量。阿拉伯糖启动子P_araBAD和群体淬灭基因aiiA在不同的宿主中都可以正常工作，这显示出该系统良好的稳定性和广宿主适应性。这为该系统在不同宿主中的实际应用打下了基础。

实施例5、“阿拉伯糖-细菌密度”二元系统araQS在J774巨噬细胞中用于示踪系统

动物体和细胞体内是典型的缺乏阿拉伯糖的环境，经过前述实施例的验证，araQS进入细胞内缺乏阿拉伯糖的环境并进行增殖后，将会自动开启蛋白表达。

J774是一种小鼠单核巨噬细胞，由BALA/C小白鼠网织细胞肉瘤分离筛选而来，在脊椎动物体内参与非特异性免疫和特异性免疫。其能够以固定细胞或游离细胞的形式对细胞内的碎片及病原体进行吞噬或消化作用，并激活其他免疫细胞，对病原体作出反应。迟钝爱德华氏菌是一种典型的兼性胞内寄生菌，通过侵入宿主体的上皮和巨噬细胞，在其中进行扩增，导致系统性感染和出血性败血症的发生。因此，当含有araQS表达系统的迟钝爱德华氏菌对J774细胞进行侵染时，会被J774吞噬到细胞内部，对病原菌造成体内环境，诱导araQS系统表达荧光，进行细胞内菌体的示踪过程。

如图5，无论在荧光显微镜还是共聚焦显微镜视野下，携带有araQS系统的迟钝爱德华氏菌在J774巨噬细胞中表现出了明显的红色荧光，说明araQS系统能感应巨噬细胞中缺乏阿拉伯糖的体内信号，启动群体感应回路。群体感应回路在菌株侵染到细胞体内之后仍能正常工作，说明这套系统具有良好的稳定性。

在0h时，细菌刚从各自的培养基中转移至细胞培养基，对于araQS系统，侵染之前的培养基中含有高浓度阿拉伯糖，致使P_araBAD启动子开启表达AiiA群体淬灭基因，降解了培养环境中的自诱导物，表达系统的群体感应回路都呈关闭状态，因此没有荧光表达。到4h时红色荧光变得明显，到8h时，随着细菌的扩增，在培养环境中产生了更多的自诱导物分子。这些自诱导物分子为群体感应回路提供了高细菌浓度信号，更加提高了系统的表达量，红色荧光更为明显。

实施例6、检测“阿拉伯糖-细菌密度”二元系统araQS在斑马鱼中的表达

斑马鱼是一种小型(体长4～6cm)的鲤科热带淡水鱼，斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，是研究胚胎发育分子机制和遗传学的优良资源。借助斑马鱼胚胎透明、幼鱼近似透明的这个特点，我们可以简单地将含有araQS系统的宿主菌加入到斑马鱼的养殖环境中。通过斑马鱼的吞饮，将含有宿主菌的水体吸入体内，为宿主菌创造体内环境，诱导其开启表达。

将斑马鱼幼鱼放入BL21(araQS)的PBS悬浊液中，持续2h，之后放回水体中继续饲养，8h时取出，放在荧光显微镜中观察明场和588nm激发光下的荧光场，其叠加图如图6所示。

斑马鱼幼鱼吞饮进体内的菌株，经过8h的体内诱导，在体内表达出明显的红色荧光。红色荧光的出现说明了这套表达系统在鱼体内能够充分地被诱导开启，鱼体内缺乏阿拉伯糖的环境信号为表达系统的正常工作奠定了基础。同时也说明，在宿主菌与斑马鱼体内细胞相互作用的过程中，不会对我们引入的群体感应回路产生抑制作用，显现出这套系统的相对独立性。从图中可以看出，大多数菌体积聚在斑马鱼的胃肠道，与细菌主要通过被吞饮的方式进入鱼体肠胃的事实是吻合的。理论上，在细菌聚集的区域，自诱导物分子的浓度会较高，菌体显现出的红色荧光也会较强。通过观察鱼体内荧光表达的强弱，可以判断大多数菌体的存在区域，这显现出了该群体感应表达系统响应体内信号、随密度增加而开启蛋白表达的特性。

实施例7、基于araQS系统的WED多价载体减毒疫苗株的构建以及疫苗株WED(araQS-G)在大菱鲆中的免疫评价

WED多价载体减毒疫苗株参见XiaoJ等，Fish&shellfishimmunology.201335:632-41。

以嗜水气单胞菌LSA34(获自上海阿华生物工程研究所)的基因组为模板，以gap-F和gap-R为引物，扩增获得嗜水气单胞菌的GAPDH蛋白编码基因gapA34，将之替换掉pUTat-qs-katushka-TT-araC-P_araBAD-aiiA中的katushka，使gapA34基因的表达受到araQS系统的控制，质粒图谱如图7所示。

将这个体内诱导表达质粒转入迟钝爱德华氏菌监督疫苗株WED中，使其成为载体疫苗株WED(araQS-G)。

为了评价该多价疫苗使大菱鲆产生的对迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抵御效果，首先将上述构建的疫苗按表2所示对大菱鲆进行腹腔注射免疫，同时注射生理盐水作为对照。4周之后对接受接种的鱼进行嗜水气单胞菌LSA34和迟钝爱德华氏菌EIB202(获自上海阿华生物工程研究所)的攻毒。

表2、大菱鲆的免疫、攻毒分组

攻毒2周后，各组鱼的死亡情况趋于稳定，开始计算每组的死亡率以及最终的相对免疫保护力(图8)。

接种生理盐水的免疫组在进行LSA34攻毒之后，很快出现了大规模死亡的情况，其累积死亡率在2d时已经超过50％，最终死亡率达到平均85％，说明LSA34的攻毒能够对大菱鲆产生比较严重的杀伤。在设定的攻毒剂量下，对照组并未全部死亡，说明该攻毒剂量是比较合理的。

接种空WED菌的免疫组死亡率与生理盐水对照组相似，最终死亡率达到平均73％。尽管WED菌株似乎有对LSA34的交叉免疫保护作用，但微乎其微，相对免疫保护力仅不到14％。这说明仅仅对大菱鲆接种空的WED菌株虽然可以有效使鱼体产生针对迟钝爱德华氏菌的抵御能力，但是对另一种嗜水气单胞菌的侵染是无能为力的。相比之下，携带有araQS-G系统的WED载体疫苗株接种大菱鲆时，会给鱼体带来针对LSA34的较强的抵抗能力，接种这种载体疫苗的鱼获得了57％的免疫保护力。这说明体内诱导表达系统能够感受到大菱鲆的体内信号，开启群体感应回路，启动保护性抗原的表达。

对于野生迟钝爱德华氏菌毒株EIB202的侵染，攻毒结果显示无论接种了WED还是WED(araQS-G)疫苗株的免疫组都能够对其产生显著的抵御能力(RPS均达到70％以上)。这说明接种该疫苗菌的大菱鲆鱼不仅能够感受到宿主菌WED的刺激对其产生免疫应答，同时也能够感应到araQS体内诱导表达系统所产生的保护性抗原蛋白GAPDH，从而产生针对LSA34的抵御能力。

上述结果说明araQS体内诱导表达系统能够感受到大菱鲆的体内信号，开启群体感应回路，启动保护性抗原的表达。该结果展示了araQS系统作为载体疫苗的应用前景，一方面该系统实现了利用体内信号对群体感应回路的调控和体内诱导抗原的表达，另一方面该系统的广宿主适应性保证了其能够在不同宿主菌中作为多价疫苗载体。

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