青霉G蛋白信号通路对糖苷水解酶合成调控初探及其在构建表达系统中的应用

摘要

植物为主的生物质资源是自然界最大的再生资源库，也被看作生物燃料以及生物炼制最大的原料库，因此有效地降解这些以多糖（纤维素或淀粉）形式储存的生物质是实现可再生资源利用的关键。利用微生物产生的糖苷水解酶来降解自然界储藏的淀粉或木质纤维素是生物质利用的有效途径。青霉是自然界中广泛存在的一种腐生丝状真菌，草酸青霉（Penicillium.oxalicum，原名为斜卧青霉P.decumbens）114-2是本实验室从土壤中分离得到的一株生长快速，与里氏木霉相比，酶组分更加丰富，组成更加合理，其高产突变株也已经用于工业纤维素酶生产多年。随着其基因组测序以及相关组学分析的完成，其高产纤维素酶的机理得到一定的揭示。然而纤维素酶的表达调控是一个多水平且复杂的过程，而近年来关于纤维素酶转录水平的调控研究已经相对较多，研究者们逐渐将目光转向纤维素酶被诱导的前期过程，若能解析清楚纤维素信号转导过程或者发现关键的信号转换蛋白，将对认识纤维素酶的调控机制以及进一步进行高产菌株的改造具有重要的指导意义。
　　除了通过理性的改造进一步提高菌株产酶量的同时，人们也在努力探索降解木质纤维素等生物质材料的最优酶系配比以及高性能的单酶组分。丝状真菌如草酸青霉、里氏木霉，虽然能分泌数量较多的糖苷水解酶，但仍然有相当数量的糖苷水解酶基因处于沉默状态，这些未被表达或者表达量极低的基因中很可能就包含全新的或者性能更加优良的单酶组分。而要获得对这些未知蛋白的了解，首先必须将它们有效表达出来，但由于蛋白在合成过程中的折叠和糖基化的差异性，常用的大肠杆菌以及酵母表达系统有时并不能将来源于丝状真菌的蛋白有活性地表达出来，因此，构建合适的表达系统将是方便且大规模挖掘新酶资源的重要前提。
　　本论文的主要研究内容和结果如下:
　　1.G蛋白信号信号转导通路对在糖苷水解酶合成调控中的功能研究
　　首先通过生物信息学分析，我们在草酸青霉中找到了八个最有可能参与纤维素酶信号转导途径的蛋白，它们包含G蛋白偶联膜受体以及胞内激酶，对它们进行单基因敲除后并未发现这些基因的缺失对菌株表型及胞外糖苷水解酶的表达产生明显影响。
　　然后，我们研究了接受G蛋白偶联膜受体信号的异三聚体G蛋白。发现G蛋白的α亚基PGA3在草酸青霉的淀粉酶和纤维素酶表达过程中起不同的调控作用。当草酸青霉缺失了PGA3后，胞外的淀粉酶几乎不分泌，主要纤维素外切酶CBHI的分泌没有受到明显影响，而胞外β-葡萄糖苷酶BGL1的酶活力也显著下降。而持续性激活PGA3后，淀粉酶活力显著升高，CBHI酶活力和BGL1的酶活力略有下降。进一步对相应糖苷水解酶的转录水平进行检测发现，缺失株中淀粉酶活力的下降以及激活株中淀粉酶活力的上升主要是由淀粉酶基因amy15A的表达量下调和上调引起。另外，在缺失pga3后，外切酶酶活虽然无明显变化，但其转录水平明显上调，而激活株以及突变株中β-葡萄糖苷酶bgl1的转录水平变化趋势不明显。而当在突变株△pga3培养过程中，胞外添加cAMP或者其类似物db-cAMP后，又能恢复淀粉酶的分泌，这说明淀粉酶的表达依赖于PGA3介导的胞内cAMP水平。通过对PGA3的缺失株以及激活株中与纤维素酶以及淀粉酶相关转录因子分析发现，这种对淀粉酶以及纤维素酶的不同的调控方式主要由cAMP所介导的转录因子AmyR表达水平不同而引起的。
　　2.草酸青霉低背景组成型蛋白表达系统的构建和应用研究
　　首先，通过敲除草酸青霉114-2中的最主要的淀粉酶Amy15A得到突变株△15A，发现突变株在以淀粉为唯一碳源进行发酵培养时，胞外蛋白分泌量很少，这样获得了的低胞外蛋白表达背景。然后，我们从草酸青霉中筛选了三个组成型强启动子，为了检验表达系统的可行性，我们成功地用它们表达了三个原本表达量极低的木质纤维素酶，它们分别为β-葡萄糖苷酶BGL4，木聚糖酶Xyn10B和内切葡萄糖苷酶Cel12A，当以淀粉为唯一碳源进行培养时，释放到胞外的主要蛋白酶条带和酶活均为对应的目的蛋白、而当以麦麸纤维素为碳源进行发酵培养时，胞外可分泌出包含目的蛋白在内的纤维素酶重组酶系，其中过表达BGL4和Cel12A使得滤纸酶活FPA的比酶活上升，而过表达Xyn10B使得FPA的酶活略有上升，但FPA的比酶活基本无变化。因此，草酸青霉组成型蛋白表达系统很适合筛选那些不表达或者低表达的木质纤维素酶，通过改变培养基中的碳源，能够方便地得到较纯的酶液（淀粉上），或者方便地检测到包含过表达了的目的蛋白在内的纤维素重组酶系（纤维素上）。
　　3.运用G蛋白信号转导通路提高低背景蛋白表达系统的表达量
　　为了进一步提高淀粉培养条件下的蛋白表达量，本研究通过重新对之前构建的低背景表达系统进行优化。首先，由于检测到淀粉培养条件下，淀粉能对淀粉酶起诱导作用，所以选择了主要淀粉酶Amy15A的启动子作为蛋白表达的启动子并进一步进行改造。首先，从G蛋白的持续性激活株出发，利用基因工程手段在其中过表达淀粉酶的转录激活因子AmyR的同时将另一淀粉酶Amy13A敲除掉，通过转录水平的检测发现，当用Amy13A的启动子过表达AmyR时，AmyR的表达量最高，同时也使得Amy15A的表达量最高，胞外SDS-PAGE显示淀粉酶Amy15A的条带明显增强而淀粉酶Amy13A几乎消失，通过蛋白含量测定发现，AmyR过表达株的胞外蛋白量(主要是Amy15A)是野生株114-2的3倍。然后，我们将过表达株中的Amy15A进行敲除从而获得低蛋白背景的表达宿主A11△。另外，我们将淀粉酶Amy15A的启动子以及trpC的终止子构建成表达质粒。为了验证此表达系统，我们将来源于草酸青霉的纤维二糖水解酶CBHI以及里氏木霉的内切葡萄糖苷酶EGI连接上表达质粒并成功转化宿主，结果显示，这两个蛋白均得到高效率的表达，与野生菌株和未改造的激活株为表达宿主相比，表达量有显著提高。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 真菌糖苷水解酶的组成

1．1．1 真菌木质纤维素酶

1．1．2 真菌半纤维素酶

1．1．3 真菌淀粉酶

1．2 丝状真菌纤维素酶和淀粉酶合成调控研究进展

1．2．1 碳源的诱导作用

1．2．2 纤维素酶和淀粉酶转录水平的调控

1．2．3 转录后水平的调控

1．2．4 糖转运蛋白的调控作用

1．2．5 Ras信号途径对纤维素酶的表达调控作用

1．2．6 丝状真菌中G蛋白信号途径的功能及其对产酶的调控作用

1．3 蛋白表达系统概述

1．3．1 原核表达系统

1．3．2 真核表达系统

1．4 本研究的立题依据和研究内容

第二章 草酸青霉纤维素酶信号转导相关基因的预测及功能研究

2．1 实验材料与方法

2．1．1 菌株、质粒及培养条件

2．1．2 常用储备液

2．1．3 常用试剂与实验仪器

2．1．4 PCR引物

2．1．5 实验具体操作方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 草酸青霉中纤维素酶信号转导相关基因的筛选

2．2．2 草酸青霉纤维素酶信号转导相关基因的敲除

2．2．3 纤维素酶信号转导相关基因缺失株的表型分析

2．2．4 纤维素酶信号转导相关基因缺失株的产酶分析

本章小结

第三章 草酸青霉G蛋白-cAMP信号转导通路对糖苷水解酶的表达调控研究

3．1 实验材料与方法

3．1．1 菌株、质粒及培养条件

3．1．2 常用储备液

3．1．3 常用试剂与实验仪器

3．1．4 PCR引物

3．1．5 实验具体操作方法

3．2 结果和讨论

3．2．1 草酸青霉PGA3的鉴定与分析

3．2．2 G蛋白PGA3对草酸青霉的形态发生和生长的影响

3．2．3 草酸青霉PGA3对胞内淀粉酶、纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶的表达调控

3．2．4 PGA3通过调节转录因子的表达从而调节淀粉酶和纤维素酶的表达

3．2．5 PGA3通过调节胞内cAMP的水平来发挥调控作用

3．2．6 PGA3介导的G蛋白-cAMP信号通路对淀粉酶和纤维素酶的表达调控模式

本章小结

第四章 草酸青霉低背景筛酶系统的构建和应用研究

4．1 实验材料与方法

4．1．1 菌株、质粒及培养条件

4．1．2 常用储备液

4．1．3 常用试剂与实验仪器

4．1．4 PCR引物

4．1．5 实验具体操作方法

4．2 结果和讨论

4．2．1 草酸青霉中干净的蛋白表达背景的获得

4．2．2 草酸青霉组成型强启动子的筛选

4．2．3 在△15A中高效表达低丰度的木质纤维素酶

4．2．4 β-葡萄糖苷酶以及木聚糖酶的放大培养

4．2．5 含过表达木质纤维素酶的重组纤维素酶系性质

4．2．6 强启动子在草酸青霉中peni-1中的应用

本章小结

第五章 运用G蛋白信号转导通路原理提高重组蛋白在低背景表达系统中的表达量

5．1 实验材料与方法

5．1．1 菌株、质粒及培养条件

5．1．2 常用储备液

5．1．3 常用试剂与实验仪器

5．1．4 PCR引物

5．1．5 实验具体操作方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 过表达淀粉酶转录激活因子AmyR构建高效表达宿主

5．2．2 过表达株Pamy15A启动子效率的分析

5．2．3 激活菌株中过表达AmyR以提高胞外淀粉酶Amy15A分泌量

5．2．4 敲除淀粉酶Amy15A获得较干净的蛋白表达背景

5．2．5 纤维二糖水解酶CBHI以及内切葡聚糖酶EGI在A11△中的重组表达

本章小结

论文创新性结果总结与展望

参考文献

攻读学位期间已(待)发表的学术论文

致谢