阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法

摘要

本发明公开了一种阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法，属于生物荧光标记领域。将不同血清白蛋白浓度荧光试剂分次加入到该荧光试剂中，每次滴加后均测量DP‑TPPNa的荧光强度；根据测量结果获得最优浓度和DP‑TPPNa对血清白蛋白的检测范围；将不同质量比的血清白蛋白与纤维蛋白原分次滴加到该荧光试剂中，每次滴加后均测量DP‑TPPNa的荧光强度，根据测量结果绘制DP‑TPPNa荧光强度变化率随血清白蛋白浓度的变化曲线，再根据该变化曲线选取标准曲线；将血浆样本加入到荧光试剂中，测量DP‑TPPNa的荧光强度，带入标准曲线的线性方程，计算得到血清白蛋白和纤维蛋白原的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法， 具体涉及一种阶梯式点亮型定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法， 属于生物荧光标记领域。

背景技术

血清白蛋白作为一种人血浆内主要的蛋白质，占血浆蛋白质总量的50％。 对于一个正常人来说，每天10-15克的血清白蛋白在肝脏内被合成，其中40％ 的血清白蛋白通过血液与间质的交换作用被释放到血管中。血清白蛋白含有一 条具有585个氨基酸残基的多肽链、一个色氨酸残基、一个半胱氨巯基自由基， 在血浆中的半衰期为15-19天。它的二级结构由三个结构域组成，每个结构域含 有两个子域。三个二维结构域组成了一个心形，微小的pH值变化显示出中心结 构的灵活性。由于具有键合脂多糖、其它细菌的产物(磷脂壁酸、肽多糖)、活 性氧、一氧化氮、其它活性氮及前列腺素等的能力，血清白蛋白在血液中主要 功能是调节血液渗透压、转运内源生理代谢产物(如胆红素、脂肪酸)及外源 配体(如华法林、布洛芬)，以增强它们在血液中的溶解度，将它们运送到特定 的组织或器官，并销毁掉具有毒性的一部分配体。

纤维蛋白原作为血浆内一种主要的止血成分，在白细胞介素IL-6和IL-1β 的刺激下产生于肝脏内的一种促炎性蛋白质，属于功能性自我平衡分子。它经 常扮演着急性时相蛋白的角色，其含量的增加反映了伤口的愈合、炎症、感染。 另外，纤维蛋白原与癌症转移和术后复发密切相关，它通过凝血酶转变为不溶 的纤维网状结构，并结合血小板的聚集进行初始的和继发性的止血。因此，纤 维蛋白原的含量与临床病理因素息息相关，反映了化学治疗，并能预测胃癌、 结肠癌、肝癌、宫颈癌、食道癌的术后复发。

血清白蛋白和纤维蛋白原共存于血浆中，对于维持血液渗透压和动力学过 程，并反映各种生理疾病有着极其重要的临床意义，两者缺一不可。目前，血 清白蛋白已作为一种指标来评估各种疾病。例如最常见的Child-Pugh分级标准 用来量化评估肝脏的损害程度，而血清白蛋白含量作为五项评估指标中极其重 要的一项，含量越高表示损害越严重，严重时会导致肝腹水。但是现有检测手 段检出血清白蛋白的含量可能受样本溶血、脂血、胆红素及血液中其它组分的 干扰而不太精准，严重影响到对疾病的判断。此时需要对血液进行繁琐的预先 分离提纯，才能得到更高纯度的血清白蛋白，然而分离过程所产生的损失会影 响到血清白蛋白准确含量的确定。因此，研发一种新型的、简单快速、免分离 提纯的精确定量检测血清白蛋白的方法成为目前临床医学的迫切需要。

专利申请“一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用”(专利 申请号：201410389582.7)中报道过用一种荧光试剂DP-TPPNa成功定量检测血 清里血清白蛋白的方法。成果已证明DP-TPPNa对血清白蛋白的特异性与快速 响应性，而对其它多种蛋白质(如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、卵清白 蛋白、转铁蛋白等)以及氨基酸没有响应，同时血清里其它组分对白蛋白的检 测无明显干扰，能达到快速、定量检测的目的。但是这一检测的前提是针对血 清。而血清的获得需要血液通过一系列复杂的化学提纯，这在普通的医院、小 诊所或医疗器械匮乏的条件下是无法完成的，没法真正达到简单的、免除分离 提纯的检测目的。另外，血清与血浆的主要区别是血清不含有纤维蛋白原，而 纤维蛋白原作为止血蛋白在血浆中具有不可替代的作用，通过荧光试剂在血浆 中原位精确检测血清白蛋白含量的同时，研究血清白蛋白与纤维蛋白原的相互 作用是目前文献没有报道过的。(Arroyo,V.；Garcia-Martinez,R.；Salvatella,X.J. Hepatol.,2014,61,396-407.Arques,S.；Ambrosi,P.J.Car.Fail.,2011,17,451-458. Ha,C.E.；Bhagavan,N.V.Biochim.Biophys.Acta,2013,1830,5486-5493.Shao,Z. X.；Zhao,Y.；Feng,L.M.；Feng,G.F.；Zhang,J.W.；Zhang,J.Dis.Markers,2015, 468596.Matsuda,S.；Takeuchi,H.；Fukuda,K.；Nakamura,R.；Takahashi,T.；Wada, N.；Kawakubo,H.；Saikawa,Y.；Omori,T.；Kitagawa,Y.Dis.Esophagus,2013,27, 654-661.)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白 及纤维蛋白原的方法，所述方法简单易操作，可以定量检测血浆样本中血清白 蛋白和纤维蛋白原的浓度。

本发明的目的由以下技术方案实现：

一种阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法，所述方法具 体步骤如下：

步骤一：检测DP-TPPNa对血清白蛋白的响应情况，具体如下：

(1)将DP-TPPNa溶解于磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1×10^-3～1×10^-6mol/L 的溶液a；

(2)将血清白蛋白溶液稀释于磷酸盐缓冲液中，得到不同血清白蛋白浓度 的溶液b；其中，溶液b的浓度取值范围为5～40mg/mL；

(3)检测溶液a中DP-TPPNa的初始荧光强度I₀；

(4)取60μL浓度为C₁的溶液b，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均测 量溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_i；

其中，溶液b每次滴加的体积优选为1～6μL；

(5)仅变化溶液b的浓度C₁，重复步骤(4)；其中，C₁的取值范围为5～40 mg/mL；

(6)根据步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)的测试结果绘制在不同浓度溶 液b的情况下，溶液a中DP-TPPNa的荧光强度变化率(I_i-I₀)/I₀随溶液b体积的 变化曲线；在所述变化曲线中选取线性关系最好的曲线，记为曲线Ⅰ，将曲线 Ⅰ对应的溶液b的浓度设为最优浓度C；并根据曲线Ⅰ计算得到DP-TPPNa对血 清白蛋白的检测范围为2.02-110μg/mL；

其中，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；

步骤二：检测DP-TPPNa对血清白蛋白与纤维蛋白原的响应情况，具体如 下：

(1)将血清白蛋白溶液稀释于磷酸盐缓冲液中，得到浓度为C的溶液c； 向溶液c中加入不同质量的纤维蛋白原，得到血清白蛋白与纤维蛋白原质量比 为10.5～21:1的溶液d；

(2)取60μL血清白蛋白与纤维蛋白原质量比为x的溶液d，分次滴加到 溶液a中，每次滴加后均测量溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_k；

其中，每次滴加溶液d的量优选为1～6μL；

(3)仅变化x的值，重复步骤(2)；其中，x的取值为10.5～21:1；

(4)根据步骤(2)和步骤(3)中测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化 率(I_k-I₀)/I₀随溶液d中血清白蛋白浓度的变化曲线，记为曲线Ⅱ；

步骤三：血清白蛋白与纤维蛋白原的定量计算，具体如下：

(1)当曲线Ⅱ中横坐标的取值为20～100μg/mL时，选取曲线Ⅰ作为标准 曲线；

此时，将血清白蛋白浓度未知的血浆样本加入溶液a中，得到待测溶液1； 检测待测溶液1的荧光强度I₁；将待测溶液1中DP-TPPNa的荧光强度变化率 (I₁-I₀)/I₀代入曲线Ⅰ的线性方程，即可计算出血浆样本中血清白蛋白的浓度；

其中，血浆样本的添加量为使待测溶液1中DP-TPPNa的荧光强度变化率 (I₁-I₀)/I₀落入曲线Ⅰ的检测范围内；

(2)将曲线Ⅱ中横坐标取值为120～200μg/mL时，以(I_k-I₀)/I₀为纵坐标，以 纤维蛋白原与血清白蛋白的质量比x为横坐标作图，得到不同血清白蛋白浓度 下(I_k-I₀)/I₀随x变化曲线，并将所述变化曲线作为标准曲线，记为曲线Ⅲ；

此时，将步骤(1)中已测出血清白蛋白浓度的血浆样本加入到溶液a中， 得到待测溶液2；检测待测溶液2中DP-TPPNa的荧光强度I₂；

将待测溶液2中DP-TPPNa的荧光强度变化率(I₂-I₀)/I₀代入曲线Ⅲ的线性方 程，计算得到所述血浆样本中血清白蛋白与纤维蛋白原的质量比x，从而结合步 骤(1)的测试结果即可计算出所述血浆样本中纤维蛋白原的浓度；

其中，血浆样本的添加量为使待测溶液2中血清白蛋白浓度落入140～200 μg/mL的范围内；

其中，所述DP-TPPNa的结构式如下：

有益效果

(1)本发明所述方法采用荧光试剂对人血浆中血清白蛋白进行原位定量检 测，对血清白蛋白具有很强的特异性响应，具有实时“点亮”效果；

(2)本发明所述方法采用荧光试剂对单一的人血浆中纤维蛋白原没有特异 性响应，但是当血清白蛋白与纤维蛋白原处于适当的比例的情况下，两者对荧 光试剂的荧光增加是具有明显的协同效应的，并通过此协同效应定量检测纤维 蛋白原，达到同时精确检测血浆中两种主要蛋白含量的目的。

(3)本发明所述方法采用荧光试剂对血浆中其它主要组成成分(如：γ- 球蛋白、葡萄糖、胆固醇、尿素)无明显响应，因此对血清白蛋白及纤维蛋白 原的检测可以免除血浆的分离提纯过程，直接原位检测，血浆只需将血液通过 简单的物理离心即可得到，操作简单方便。

(4)本发明所述方法采用荧光试剂对血浆中的血清白蛋白在10～30mg/mL 浓度范围内时，荧光强度增加倍数与被加入的血浆体积在0～30μL范围内呈现 非常好的线性关系，可作为标准工作曲线用于待测血浆中的血清白蛋白。为此 可以在1～30μL范围内确定血清白蛋白的准确含量，在30～60μL范围内确定纤 维蛋白原的含量。

附图说明

图1为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随加入血浆体积的变化曲线；

图2为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随溶液b体积的变化曲线；

图3为实施例1中溶液b的浓度为10mg/mL时，DP-TPPNa荧光强度变化 率随溶液b体积的变化曲线；

图4为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随纤维蛋白原溶液加入体积 的变化曲线；

图5为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随溶液d中血清白蛋白浓度 的变化曲线；

图6为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随纤维蛋白原与血清白蛋白 的质量比x的变化曲线；

图7为实施例1中DP-TPPNa荧光强度变化率随溶液e中血清白蛋白浓度 的变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。

以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。

表1

表2

以下实施例中所述PBS的pH＝7.4；所述荧光强度的检测均检测3～5次，然 后取平均值；所述血清白蛋白溶液为人血清白蛋白溶液，血清白蛋白溶液中血 清白蛋白含量为50mg/mL；所述纤维蛋白原为人纤维蛋白原。

实施例1

一种阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法，所述方法具 体步骤如下：

步骤一：检测DP-TPPNa对血浆的荧光响应情况，具体如下：

(1)将19.35μg的DP-TPPNa溶解于3mLPBS中，得到DP-TPPNa的浓 度为1×10^-5mol/L的溶液a；

(2)将正常人血样本以3000rpm的转速离心15分钟，取上层黄色液体得 到血浆；

(3)采用荧光分光光度计检测DP-TPPNa溶液的初始荧光强度I₀；

(4)取36μL血浆分次滴加到溶液a中，并测出每次滴加血浆后混合均匀 后溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_j；其中每次血浆的加入量为3μL；

(5)根据步骤(3)和(4)中测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化率(I_j-I₀)/I₀ 随加入血浆体积的变化曲线，如图1所示，可知，DP-TPPNa荧光强度随加入血 浆体积的增加而增加。

步骤二：检测DP-TPPNa对血清白蛋白的响应情况，具体如下：

(1)将血清白蛋白溶液稀释于PBS中，分别得到浓度为5mg/mL、10 mg/mL、20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL的溶液b；

(2)取60μL浓度为5mg/mL的溶液b，分次滴加到溶液a中，每次滴加 后均测量溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_i；

其中，溶液b每次滴加的体积为6μL；

(3)分别将溶液b的浓度变化为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL和40 mg/mL，重复步骤(2)；

(4)根据步骤测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化率(I_i-I₀)/I₀随溶液b体 积V_HSA的变化曲线，如图2所示，可知，当溶液b的浓度为10mg/mL时的线 性关系最好，对应曲线记为曲线Ⅰ；且曲线Ⅰ如图3所示，可知当溶液b加入 体积为3-33μL，即溶液b中血清白蛋白的浓度为10～110μg/mL时，DP-TPPNa 荧光强度变化率(I_i-I₀)/I₀与溶液b的加入体积存在一定的线性关系，线性方程为： (I_i-I₀)/I₀＝0.2338×V_HSA+0.74708，R²＝0.9942。根据此线性关系可以计算DP-TPPNa 对血清白蛋白的检测范围为：2.02-110μg/mL，最低检出限为：2.02μg/mL。当 溶液b的加入体积为45μL，即溶液b中血清白蛋白的浓度为150μg/mL时， DP-TPPNa荧光强度不再随溶液b的加入体积的变化而变化。其中，i表示1-20 的正整数，R表示线性相关度。

步骤三：检测DP-TPPNa对纤维蛋白原的响应情况，具体为：

(1)将纤维蛋白原溶解于PBS中，得到浓度为10mg/mL的人纤维蛋白原 溶液；

(2)取60μL浓度为5mg/mL的人纤维蛋白原溶液，分次滴加到溶液a中， 每次滴加后均测量溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_m；

(3)根据测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化率(I_m-I₀)/I₀随人纤维蛋白 原溶液加入体积的变化曲线，如图4所示，可知，DP-TPPNa对纤维蛋白原没有 特异性响应。

步骤四：检测DP-TPPNa对血浆中除血清白蛋白和纤维蛋白原以外的其它 主要组分的响应情况，具体如下：

(1)将血清白蛋白溶液稀释PBS中，得到浓度为10mg/mL的溶液c；向 溶液c中加入不同质量的纤维蛋白原，得到纤维蛋白原与血清白蛋白的质量比 分别为1:10.5、1:14、1:18和1:21的溶液d；

(2)取60μL血清白蛋白与纤维蛋白原质量比为1:10.5的溶液d，分次滴 加到溶液a中，每次滴加后均测量溶液a中DP-TPPNa的荧光强度I_k；

其中，每次滴加溶液d的量为6μL；

(3)将血清白蛋白与纤维蛋白原质量比分别变化为1:14、1:18和1:21，重 复步骤(2)；

(4)根据步骤(2)和步骤(3)中测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化 率(I_k-I₀)/I₀随溶液d中血清白蛋白浓度的变化曲线，记为曲线Ⅱ，如图5所示；

步骤五：血清白蛋白与纤维蛋白原的定量计算，具体如下：

(1)当曲线Ⅱ中横坐标的取值为20～100μg/mL时，无论血清白蛋白与纤 维蛋白原以何质量比混合，当体积较少血清白蛋白和纤维蛋白原混合液被加入 到固定浓度的溶液a中时，因纤维蛋白原含量较少，DP-TPPNa荧光强度变化率 与血清白蛋白浓度存在一定的线性关系，且与曲线Ⅰ的线性基本重合；这说明 在恒定血清白蛋白浓度的条件下，当加入血清白蛋白和纤维蛋白原混合液体积 较少时，DP-TPPNa荧光强度的增加只是由血清白蛋白占主导因素，原因是 DP-TPPNa分子进入血清白蛋白疏水空腔导致旋转受限而促进了荧光的增强(聚 集诱导发光作用)，而纤维蛋白原并未通过与血清白蛋白的相互作用而对荧光的 增强有明显的促进作用，此时可忽略纤维蛋白原的影响，选取曲线Ⅰ作为标准 曲线；

将血清白蛋白浓度未知的血浆样本加入溶液a中，得到待测溶液1；检测待 测溶液1的荧光强度I₁；将待测溶液1中DP-TPPNa的荧光强度变化率(I₁-I₀)/I₀代入曲线Ⅰ的线性方程，计算出血浆样本中血清白蛋白的浓度为30.711g/L；

其中，血浆样本的添加量为使待测溶液1中DP-TPPNa的荧光强度变化率 (I₁-I₀)/I₀落入曲线Ⅰ的检测范围内；

(2)将曲线Ⅱ中横坐标取值为120～200μg/mL时，以(I_k-I₀)/I₀为纵坐标，以 纤维蛋白原与血清白蛋白的质量比x为横坐标作图，得到不同血清白蛋白浓度 下(I_k-I₀)/I₀随x变化曲线，并将所述变化曲线作为标准曲线，记为曲线Ⅲ；

此时，将步骤(1)中已测出血清白蛋白浓度的血浆样本加入到溶液a中， 得到待测溶液2；检测待测溶液2中DP-TPPNa的荧光强度I₂；

将待测溶液2中DP-TPPNa的荧光强度变化率(I₂-I₀)/I₀代入曲线Ⅲ的线性方 程，计算得到所述血浆样本中血清白蛋白与纤维蛋白原的质量比x，从而结合步 骤(1)的测试结果即可计算出所述血浆样本中纤维蛋白原的浓度为2.239g/L；

其中，血浆样本的添加量为使待测溶液2中血清白蛋白浓度落入140～200 μg/mL的范围内；

步骤六：血清白蛋白与纤维蛋白原的定量计算结果的验证，具体如下：

(1)将纤维蛋白原、γ-球蛋白、胆固醇、葡萄糖和尿素加入到溶液b中，， 混合均匀，得到溶液e；

其中，溶液e中纤维蛋白原与血清白蛋白质量比分别为1:10.5，1:14，1:1， 1:21；血清白蛋白与γ-球蛋白、胆固醇、葡萄糖、尿素的质量比分别为 400:300:4:6.7:1和400:300:4:13.3:1；

(2)取60μL溶液e，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均测量溶液a中 DP-TPPNa的荧光强度I_p；

(3)根据步骤(2)的测试结果绘制DP-TPPNa荧光强度变化率(I_p-I₀)/I₀随 加入的溶液e中血清白蛋白浓度的变化曲线，如图6所示，可知，加入γ-球蛋 白、胆固醇、葡萄糖、尿素后的曲线与未加入这些组分前的曲线基本重合，说 明这些组分对血清白蛋白与纤维蛋白原的协同作用无明显干扰，进而表明步骤 五中的计算结果真实可靠。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任 何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。