一种白酒生产过程中固体样品的黄曲霉毒素的检测方法

摘要

本发明公开了一种白酒生产过程中固体样品的黄曲霉毒素的检测方法，属于食品检测技术领域。本发明分别通过对于白酒酒糟进行相关前处理后联合UPLC?MS/MS检测仪对白酒酒糟中黄曲霉毒素的存在进行检测。本发明提供了一种新型的白酒品质安全指标检测技术，操作简单方便，能够迅速对白酒酒糟中可能存在的微量黄曲霉毒毒进行及时的监测，从而对白酒品质安全进行有效的控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白酒生产过程中固体样品的黄曲霉毒素的检测方法，属于食品检 测技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素属于真菌毒素，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为“第一类致癌 物”。其极易污染粮食作物，肉类以及奶制品等，危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作 用,严重时,可导致肝癌甚至死亡。

粮食作物是白酒工业的主要生产原料，很有可能将黄曲霉毒素以及产毒微生物带 入白酒中，威胁白酒生产的安全。现在食品行业出现的安全问题不断，而关于黄曲霉毒素对 白酒生产影响的报道几乎没有。因此，验证黄曲霉毒素在白酒生产中的安全性研究是非常 必要的。同时随着白酒市场的不断壮大，其副产物丢糟也越来越多的用于饲料加工行业，所 以对丢糟中黄曲霉毒素的检测也显得十分重要。

目前对于黄曲霉毒素的检测对象主要是玉米，稻谷，大豆，奶制品，食用油，调味品 等；发酵酒类如葡萄酒，啤酒也有相关文献报道；检测方法主要集中于薄层色谱法，高效液 相色谱法，酶联免疫法，液质联用法等。由于白酒生产过程涉及多种原料，多种微生物，以及 多种代谢产物的生成，所以白酒生产过程中的固体样品，如大曲、酒醅、酒糟等，与谷物类等 粮食样品相比，是极其复杂的，检测过程中存在多种不明干扰物质。

然而，国内对于白酒的研究仍较少，有学者采用ELISA法检测大曲，酒醅丢糟，黄 水，基酒，成品酒中的黄曲霉毒素B1含量；ELISA检测法易出现假阳性，检测结果偏大，且不 能同时检测多种毒素的存在，对于其实验结果仍需要精确地定性定量验证。也有学者采用 高效液相色谱法检测高粱、大曲、酒醅、黄水，成品酒中黄曲霉毒素B1含量，然而这种方法存 在检测时间长、灵敏性不足等问题，而且能够同时检测到的黄曲霉毒素的种类少。

因此，开发一种快速、准确、灵敏度高、同同时检测多种黄曲霉毒素的针对白酒发 酵过程中的固体样品的检测方法，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本方法提供一种基于UPLC-MS/MS的同时检测白酒生产过程中 固体样品的4种黄曲霉毒素的检测方法，可以快速简便地实现白酒生产过程中的固体样品， 比如酒糟中黄曲霉毒素的检测。本发明的方法操作简便，耗时短，可适用于大批量样品同时 检测。本发明方法实现了对黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的同时检测，且回收率高、稳 定性较好。

本发明的检测方法，包括以下步骤：

(1)预处理：称取烘干后的固体样品，过筛；

(2)提取：加入一定比例水和溶剂A，震荡混匀，得到混合液；

(3)盐析：混合液中加入盐析剂，震荡混匀离心；

(4)净化：取步骤(3)中离心后的上层清液加入净化剂，震荡离心；

(5)浓缩：取步骤(4)中离心后的上层清液，氮气吹干复溶后过0.22μm膜；

(6)进样分析：将步骤(5)中过膜后的溶液样品进行UPLC-MS/MS检测。

在本发明的一种实施方式中，所述固体样品是白酒酒糟，或者白酒生产过程中的 其他固体样品，如大曲、酒醅。

具体的，所述步骤(1)中过筛为过20目筛。

优选的，所述步骤(2)中溶剂A为乙腈。

优选的，所述步骤(2)中，按照5g烘干后的固体样品添加10ml水和15ml乙腈。

优选的，所述步骤(3)中盐析剂，是按照每5g烘干后的固体样品添加1gNaCl和4g MgSO₄。

具体的，所述步骤(3)中震荡方式为手动上下震荡，震荡时间为1min。

优选的，所述步骤(4)中净化剂，是按照每5g烘干后的固体样品添加150mgPSA和 900mgMgSO₄。

具体的，所述步骤(4)中，震荡方式为涡旋振荡，震荡时间为30s。

具体的，所述步骤(3)和(4)中离心步骤，离心参数为4000rpm转速5min。

具体的，所述步骤(5)中，氮气吹干复溶步骤中，复溶液为流动相(流动相A与流动 相B按体积比1:1混合)，体积为0.5mL。

具体的，所述步骤(5)中UPLC-MS/MS检测所用的溶液样品量为5μL。

优选的，所述步骤(6)中UPLC-MS/MS中色谱条件为采用C18柱，流动相为A和B，A为 甲酸水，B为甲醇，采用梯度洗脱。

优选的，所述流动相A和B，A流动相浓度为0.01％(体积分数)，流速为0.500ml/ min。

在本发明的一种实施方式中，所述色谱条件具体是：以ACQUITYUPLCBEHC18为 色谱柱；以0.01％甲酸水为流动相A相，以100％甲醇为流动相B相，流速为0.5ml/min；洗脱 方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：0min，5％流动相B；7min，60％流动相B；9min，100％流动 相B；11.00min，100％流动相B；11.10min，5％流动相B；14.00min，5％流动相B。

优选的，所述步骤(6)中UPLC-MS/MS的质谱条件如下：离子源为电喷雾离子化源 (ESI)；喷雾电压为3000V(+)；离子源温度为150℃，去溶剂温度为300℃。

其中AFB1：母离子为313.10；定性离子为240.90，碰撞能量为35V；定量离子为 268.70，碰撞能量为32V；AFB2：母离子为315.10；定性离子为258.90，碰撞能量为35V；定量 离子为286.90，碰撞能量为25V；AFG1：母离子为329.10,；定性离子为242.80，碰撞能量为 25V；定量离子为310.90，碰撞能量为20V；AFG2：母离子为331.10；定性离子为244.90，碰撞 能量为35V；定量离子为313.00，碰撞能量为24V。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括用黄曲霉毒素标准品绘制标准曲 线，由此计算酒糟样品中黄曲霉毒素的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括：

(1)提取：5g干酒糟粉末(湿酒糟烘干过20目筛)中加入10g低温水混匀，15mL乙腈 涡旋摇匀30s对黄曲霉毒毒进行提取；

(2)盐析：混合液中加入1gNaCl和4gMgSO₄震荡1min，4000rpm转速5min；减少混 合提取液中的水含量同时饱和水溶液促使混合液分层为乙腈层和水层；

(3)净化：取经步骤(2)盐析后的上清液，加入纯化剂(150mgPSA，900mgMgSO₄)涡 旋摇匀30s，4000rpm转速5min；

(4)浓缩：取步骤(3)净化后的上清液，氮气吹干后复溶至1ml甲醇：0.1％甲酸水 (1:1)溶液中，经0.2μm膜过滤后取5μL进样UPLC-MS/MS定量检测。

本发明的有益效果：

(1)本发明方法为首次应用于白酒酒糟中黄曲霉毒素的检测与分析。该方法灵敏 度高，操作便捷。前处理简单易操作耗时短，通过采用液质联用法检测时间(14min)比已有 的高效液相色谱法检测时间(30min)更短；AFB1的检出限为0.09μg/kg，远低于已有白酒样 品检测的检出限；能同时检测多种黄曲霉毒素，包括：AFB1，AFB2，AFG1，AFG2。

(2)可应用于酒糟及白酒生产体系中其他固体样品中黄曲霉毒素的检测。本发明 方法通过UPLC-MS/MS对白酒酒糟样品进行进样分析，检测白酒酒糟中黄曲霉毒素的含量， 分析速度快，同时减少了假阳性，提高了测定的准确性，实用性强。该方法对白酒酒糟中黄 曲霉毒素含量的检测具有重要的指导意义，对于白酒生产体系的及时安全监测具有指导作 用。推进了白酒生产中食品安全工作落实。

附图说明

图1为本发明的色谱条件下4种黄曲霉毒素的分离效果图。

具体实施方式

实验材料：

三重四级杆质谱仪(waters)，ACOUITYUltraPerformanceLC液相色谱仪(美国 Waters公司)，超纯水机(美国Millipore公司)，黄曲霉毒素标准品(Sigma公司)，乙腈，甲 醇，甲酸均为色谱纯，PSA(上海安谱科学仪器有限公司)。

实施例1：酒糟中黄曲霉毒素的定性与定量检测

按以下方法进行检测：

(1)提取：5g干酒糟粉末(湿酒糟烘干过20目筛)中加入10g低温水混匀，15mL乙腈 涡旋摇匀30s对黄曲霉毒毒进行提取；

(2)盐析：混合液中加入1gNaCl和4gMgSO₄震荡1min，4000rpm转速5min；减少混 合提取液中的水含量同时饱和水溶液促使混合液分层为乙腈层和水层；

(3)净化：取经步骤(2)盐析后的上清液，加入纯化剂(150mgPSA，900mgMgSO₄)涡 旋摇匀30s，4000rpm转速5min；

(4)浓缩：取步骤(3)净化后的上清液，氮气吹干后复溶至1ml甲醇：0.1％甲酸水 (1:1)溶液中，经0.2μm膜过滤后去5μL进样UPLC-MS/MS定量检测。

其中UPLC-MS/MS的色谱条件：ACQUITYUPLCBEHC18；以0.01％甲酸为流动相A 相，以100％甲醇为流动相B相，流速为0.5mL/min；按表1的梯度洗脱方式进行洗脱，洗脱程 序如下：0min，5％流动相B；7min，60％流动相B；9min，100％流动相B；11.00min，100％流动 相B；11.10min，5％流动相B；14.00min，5％流动相B。在该色谱条件下，4种黄曲霉毒素能够 得到完全分离且峰形较佳(如图1所示)。

表1流动相梯度

其中UPLC-MS/MS的质谱条件为：离子源为电喷雾离子化源(ESI)；喷雾电压为 3000V(+)；离子源温度为150℃，去溶剂温度为300℃。

其中AFB1：母离子为313.10；定性离子为240.90，碰撞能量为35V；定量离子为 268.70，碰撞能量为32V；AFB2：母离子为315.10；定性离子为258.90，碰撞能量为35V；定量 离子为286.90，碰撞能量为25V；AFG1：母离子为329.10,；定性离子为242.80，碰撞能量为 25V；定量离子为310.90，碰撞能量为20V；AFG2：母离子为331.10；定性离子为244.90，碰撞 能量为35V；定量离子为313.00，碰撞能量为24V。

经以上步骤，通过与黄曲霉毒素标准品的出峰时间对比，即实现了对样品中的黄 曲霉毒素的定性检测。另外，通过使用已知量的黄曲霉毒素标准品绘制标准曲线，将目标峰 面积代入标准曲线中，即可获得进样样品中的相应的黄曲霉毒素的含量，进而获知白酒生 产过程中的固体样品中的黄曲霉毒素的含量，即实现黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的 定量检测。除了酒糟样品外，对大曲、酒醅样品也可以采用本发明方法进行检测。

实施例2：本发明的定量检测方法有效性研究

准确称取5g干酒糟末，分别加入不同体积标准品混合溶液，按照实施例1的方法进 行检测，制作相应标准曲线，具体浓度见表2至表5。

表2AFB1标准曲线浓度

表3AFB2标准曲线浓度

表4AFG1标准曲线浓度

表5AFG2标准曲线浓度

精密吸取上述系列溶液标准溶液各5ul，进样分析，记录各待测组分色谱峰面积， 以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归分析，结果(见表6)表明，各成分线 性关系良好。

表6黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2回归方程和相关系数

同时，本发明方法的检出限、定量限、回收率、稳定性数据如表7至表10所示。除了 酒糟样品外，采用本发明方法对大曲、酒醅样品进行检测，标准曲线线性相关性也很好，检 出限、定量限、回收率和稳定性也与酒糟样品差不多。

表7黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2检出限参数值

表8黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2定量限参数值

表9黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2回收率实验参数值

表10黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2稳定性(RSD)参数值

实施例3：检测条件对检测结果的影响

本发明还比较了不同处理方法对检测效果的影响。

(1)样品状态的影响：用湿酒糟代替干碎酒糟作为样品，其他步骤与实施例1一致。 结果显示，最终检测到的黄曲霉毒素的含量比实施例1降低了约35％，检测的稳定性和回收 率收到严重影响，根本无法实现对黄曲霉毒素的有效检测。

(2)提取溶剂的影响：用甲醇代替乙腈作为提取溶剂，其他步骤与实施例1一致。结 果显示，最终检测到的黄曲霉毒素的含量比实施例1降低了约22％，检测的稳定性和回收率 收到严重影响。此外，发明人还发现，当提取溶剂中不加水直接使用乙腈，最终检测到的黄 曲霉毒素的含量比使用乙腈和水的组合降低了约60％，说明使用乙腈和水组合作为提取溶 剂能够显著提高检测的准确性。

(3)净化的影响：省略实施例1步骤(3)中的净化处理，结果发现最终检测到的黄曲 霉毒素的含量比实施例1降低了约43％，检测的稳定性和回收率收到严重影响。这也说明本 发明的净化处理方法能够显著提高检测的准确性。

(4)液相方法的影响：采用液相梯度洗脱程序：0min，5％流动相B；0.10min，5％流 动相B；6min，60％流动相B；9min，100％流动相B；10min，100％流动相B；10.10min，5％流动 相B；11min，5％流动相B；图谱中呈现的峰形不能将四种类型的黄曲霉毒素完全分离。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。