植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置及使用方法

摘要

本发明涉及一种植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置及使用方法，其特征在于，该测定装置包括显微镜、激发光源、斩波器、CCD图像采集装置和计算机；待测叶片放置在所述显微镜上，所述激发光源发出的光通过所述斩波器进入所述显微镜照射所述待测叶片的横截面，所述待测叶片横截面的叶绿素体吸收光产生叶绿素荧光，所述叶绿素荧光经所述显微镜出射并经所述CCD图像采集装置采集，所述CCD图像采集装置将采集的叶绿素荧光图像发送到所述计算机。本发明操作简单、测定可靠，对于植物生理、植物学、生态学等研究领域具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明是关于一种植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置及使用方法，涉 及植物叶片叶绿素荧光测定领域。

背景技术

光是限制绿色植物生存和生长的主要环境因素之一。不同光质和光量导致植物在 形态和生理等方面产生相应的变化。这种变化能使植物最大程度地维持光合速率，从 而适应变化的环境。在叶片水平和叶肉组织水平上，针对植物响应与适应不同光环境 及变化光的特性，植物生理生态学者已经做了大量的研究，并取得非常系统的研究成 果。植物叶绿素荧光是无损伤探测植物光合作用效率的有利工具，基本原理如图1所 示，其中，Fm为暗中最大荧光，Fm’为光下最大荧光，Ft为可变荧光，F0为暗中基 础荧光，FR为远红光，Actiniclighton为活化光开，捕光色素蛋白复合体(LHC) 受光激发后，LHC将其能量传递到光系统二或光系统一，其间所吸收的光能有所损失， 所吸收的光能大约3％～9％被重新发射出来，其波长较长称为叶绿素荧光。常温下叶绿 素荧光主要来自光系统二，当对暗适应叶片照光时，叶绿素荧光迅速上升，随后有一 系列慢的波动，逐渐下降到稳态，这称为“KautskyEffect”，是Kautsky和Hirsch 于1931年首先报道的。荧光发射与原初光化学活动、热耗散过程是互相竞争的一种关 系。因此，荧光产量变化反映了光合作用系统光化学效率和热耗散能力的变化。

根据叶绿素荧光的基本原理，诞生了脉冲调制式荧光仪(PAM101-102-103)，成为 光合作用研究的强大工具。随着快速荧光诱导动力学(OJIP)研究的深入，连续式植 物效能分析荧光仪(PEA)应用也越来越广泛，成为光合作用原初反应研究快捷有力的 工具。但是这两类仪器都是点式传感器，只能探测叶片表面的最大光化学量子效率异 质性的变化，无法深入到叶片内部(如表1所示)。这是因为PAM仅收集叶上表面 (adaxialside)或下表面(abaxialside)的荧光，由于其测量光光强很低(20～ 30μmolm^-2s^-1)无法达到叶片内部较深的组织。而PEA尽管测量光强非常高(3,000 μmolm^-2s^-1)也仅能反映叶片整体水平的最大光化学量子效率。

用于光合作用研究的叶绿素荧光影像仪是上个世纪80年代后期发展起来的设备， 其中测定叶片表面叶绿素荧光的商品化仪器已有很多，均采用叶绿素荧光的基本原理， 将整片叶表面或叶表面某一部位的叶绿素荧光用摄像的方式拍摄下来，通过特定的软 件进行分析，得到叶片水平的叶绿素荧光分布，例如调制叶绿素荧光成像系统 (IMAGING-PAM-MAXI)。但是，该类仪器只能获得叶面水平方向的光合能力异质性，由 于分辨率的原因而无法获得叶片内部叶绿素荧光影像。

表1目前常见进行叶绿素荧光Fv/Fm测定的荧光仪性能对比

表中数字标记的具体含义为：1PAM2100，MicroscopicPAM,DualPAM,Microfiber PAM均采用调制锁相放大模式；2光强档位在4～7之间；3对于测量光脉冲宽度测定 采用高灵敏度PIN光电二极管；4调制频率为1.6KHz；5测量光光强可调，最高档时 与饱和光光强相同；6空间分辩率低，得不到厚度1mm以下叶片的叶横截面荧光影像。

测量光脉冲宽度在OJIP的位置：OJIP的时间进程为O30usJ2msI30msP1s。 研究叶片内部光合能力的异质性，是光合作用生化模型、光抑制机理、光保护机理等 重要光合生理生态热点问题的重要前提。对叶片内部垂直梯度的光吸收、光合效率及 碳同化进行非损伤测定，研究不同光环境及变化光条件下植物的响应与适应特性，对 深刻理解植物对光的响应与适应的生理生态学机制具有非常重要的意义。然而，此类 非损伤测定需要采用一些巧妙精细的研究技术和设备。国际上一些知名研究者自行研 制了专门用于植物叶片内部垂直梯度光合能力测定的叶绿素荧光影像仪，但到目前为 止没有相关的商品化仪器。一些著名实验室利用自制的相关仪器开展研究可以用来测 定叶片内部垂直梯度的光吸收。但是，研究者仅仅采用叶绿素荧光技术的一个应用原 理，即在一定情况下荧光产量与光吸收量成正比，而并未采用目前已成体系的叶绿素 荧光原理的其它原理。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种植物叶片横截面最大光化学量子效率测 定装置及使用方法，能够准确测定不同植物叶片横截面的最大光化学量子效率，得到 叶片内部不同叶肉组织光合能力差异。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种植物叶片横截面最大光化学量 子效率测定装置，其特征在于，该测定装置包括一显微镜、一激发光源、一斩波器、 一CCD图像采集装置和一计算机；待测叶片放置在所述显微镜上，所述激发光源发出 的光通过所述斩波器进入所述显微镜照射所述待测叶片的横截面，所述待测叶片横截 面的叶绿素体吸收光产生叶绿素荧光，所述叶绿素荧光经所述显微镜出射并经所述 CCD图像采集装置采集，所述CCD图像采集装置将采集的叶绿素荧光图像发送到所述 计算机。

优选地，所述显微镜采用倒置荧光显微镜，所述倒置荧光显微镜包括载物台、物 镜、和二向分色镜，所述载物台用于放置所述待测叶片，所述激发光源发出的光通过 所述斩波器进入所述二向分色镜，经所述二向分色镜发射的光经所述物镜照射所述叶 片的横截面，所述叶绿素荧光经所述物镜收集并经所述二向分色镜发射到所述CCD图 像采集装置。

优选地，所述斩波器包括一机械泵和一圆盘，所述机械泵的输出端连接所述圆盘， 所述圆盘边缘设置两个通光缺口。

优选地，所述激发光源采用波长为450nm±50nm的蓝光激光，光强不小于 5000μmolm^-2s^-1。

优选地，还包括一用于为所述激发光源和斩波器提供稳定电源的恒流源。

一种植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置的使用方法，其特征在于包括 以下内容：

1)采集待测叶片，采用湿纱布完全包裹进行暗适应；

2)打开计算机、显微镜和CCD图像采集装置；

3)将暗适应后的待测叶片切成设定大小，并将叶片夹设放置在显微镜载物台上， 待测叶片横截面朝向显微镜的物镜，同时采用湿纱布盖住叶片；

4)打开激发光源和斩波器产生调制光，转动显微镜进行调焦使叶绿素荧光图像清 晰且位于视野中央；

5)基础荧光Fo测定：在斩波器开启的情况下，设置CCD图像采集装置参数，打 开视频拍摄选项，设置记录时间，开始影像记录，记录完成后导出rgb图像序列并保 存，此为Fo影像序列；

6)最大荧光Fm测定：关闭斩波器，更改CCD曝光时间，再次记录荧光影像，记 录完成后导出rgb图像序列并保存，此为Fm影像序列；

7)处理获得叶片横截面的Fv/Fm荧光图像，具体步骤是：将rgb彩色图转换为灰 度图，对Fo和Fm图像序列的每个像素点求平均，采用矩阵运算方式对图像每个像素 点进行Fv/Fm求值，将计算结果导出Excel表保存，最后输出Fo、Fm和Fv/Fm的荧光 假彩色图像，其中，Fv为Fm与Fo的差值。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、由于本发明以高分辨率倒置 显微镜为基础，利用常规叶绿素荧光影像技术对叶片横截面进行叶绿素荧光图像拍摄， 即可得到叶片内部光合作用能力差异的信息，这对于深刻理解植物对光的响应与适应 的生理生态学机制无疑具有非常重要的意义。2、本发明利用斩波器产生脉冲测量光， 同时保证测量光与饱和光光强一致，可以测得稳定可靠的Fo与Fm，从而可以得到除 光吸收差异之外的其他叶绿素荧光参数。3、本发明测量光与饱和光均从物镜通过，直 接照射待测叶片，保证了光的均匀性，使得叶绿素荧光影像和荧光参数测定更加准确。 本发明操作简单、测定可靠，对于植物生理、植物学、生态学等研究领域具有广泛的 应用前景。

附图说明

图1为叶绿素荧光测定原理示意图；

图2为本发明测定装置结构示意图；

图3为本发明的斩波器结构示意图；

图4为本发明测定装置设置的调制光对叶绿素荧光Fv/Fm测定值的影响示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更 好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图2所示，本发明提供的植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置，包括 激发光源1、斩波器2、显微镜3、CCD图像采集装置4和计算机5；

新鲜待测叶片6采用载玻片和长尾夹夹设固定放置在显微镜3的载物台上，叶片 横截面(叶片平放在桌面上，用刀片切成1cm*1cm大小，切面即为横截面)朝向显微 镜3的物镜；激发光源1发出的光通过斩波器2进入显微镜3的二向分色镜31，经二 向分色镜31反射的光经显微镜3的物镜32照射叶片横截面，叶片横截面中的叶绿体 吸收光产生叶绿素荧光，叶绿素荧光经显微镜3的物镜32收集并经二向分色镜31透 射通过CCD图像采集装置4采集，CCD图像采集装置4将采集的叶绿素荧光图像发送 到计算机5进行荧光影像处理得到叶片横截面最大光化学量子效率。

在一个优选的实施例中，为避免荧光污染，激发光源1可以采用蓝光激光，波长 为450nm±50nm，光强不小于5000μmolm^-2s^-1，到达显微镜3的物镜32后光强不小 于1000μmolm^-2s^-1。

在一个优选的实施例中，如图3所示，为了保证基础荧光Fo测定的稳定性和准确 性，斩波器2包括一机械泵21和一圆盘22，机械泵21可以选择高速马达，空载转速 22000转/min，马达的输出端固定连接圆盘22，圆盘22边缘对称设置两个通光缺口 221，本发明实施例中圆盘22的直径为5cm，两个通光缺口221的宽度为2.6mm，从而 可以得到测量光脉宽为160us，周期为3.3ms。根据OJIP曲线可知，在此脉冲宽度情 况下，以1000μmolm^-2s^-1的光强照射叶片产生的荧光值也接近O点，因此认为可以 得到稳定的Fo，脉冲测量光与饱和光光强一致。当激发光源1产生5000μmolm^-2以 上的光强，到达显微镜3的物镜32后光强不小于1000μmolm^-2s^-1，斩波器2停止时 光从通光缺口221进入显微镜3的物镜，此时为饱和光；斩波器2高速旋转时产生脉 冲测量光，到达显微镜3的物镜32端光强降低至60μmolm^-2s^-1，保证既能得到稳定 的Fo，又能使CCD端采集装置4采集到清晰的荧光影像。

在一个优选的实施例中，为保证长工作距离和分辨率，显微镜3可以采用倒置荧 光显微镜。

在一个优选的实施例中，CCD图像采集装置4可以采用高灵敏度黑白CCD，分辨率 不小于1392×1040pixel，拍摄速度不小于30fps/s，CCD图像采集装置4前方还设 置一短波截止滤波片7，短波截止滤波片7只允许680nm以上的叶绿素荧光通过，同 时阻止入射光进入CCD图像采集装置4。

在一个优选的实施中，还包括一恒流源8，用于为激发光源1和斩波器2提供稳 定的电源。

在一个优选的实施例中，为了减少叶片因受切后产生生理活性变化，每个待测样 叶片的测定时间在2分钟以内。

下面通过具体实施例详细说明本发明的植物叶片横截面最大光化学量子效率测定 装置的使用方法，包括以下步骤：

1、采集新鲜待测叶片6，擦干净表面浮尘，采用湿纱布完全包裹进行暗适应；

2、打开显微镜3、CCD图像采集装置4和计算机5；

3、将暗适应20min的待测叶片6采用锋利的双面刀片切成1cm*1cm大小，放在 两片载玻片中间，然后采用长尾夹夹住放在显微镜3的载物台，使得叶片横截面朝向 物镜32，同时采用湿纱布盖住整个载玻片；

4、打开激发光源1和斩波器2，产生调制光，转动显微镜3调焦螺旋使叶绿素荧 光影像清晰且位于视野中央；

5、基础荧光Fo测定：在斩波器2开启的情况下，设置CCD图像采集装置4参数， CCD曝光时间为400ms，增益4.8X，打开视频拍摄选项，设置记录时间为2s，开始影 像记录，记录完成后导出rgb图像序列并保存，此为Fo影像序列；

6、最大荧光Fm测定：更改CCD曝光时间为60ms，打开荧光影像记录按钮的同时 关闭斩波器2，产生饱和光，记录荧光影像2s，然后导出rgb图像序列并保存，此为 Fm影像序列；

7、采用Matlab软件进行处理获得叶片横截面的Fv/Fm荧光图像，Fv为Fm与Fo 的差值，具体步骤是：将rgb彩色图转换为灰度图，对Fo和Fm图像序列的每个像素 点求平均，采用矩阵运算方式对图像每个像素点进行Fv/Fm求值，将计算结果导出 Excel表保存，最后进行假彩色运算，输出Fo、Fm和Fv/Fm的荧光假彩色图像。

下面对通过采用本发明的植物叶片横截面最大光化学量子效率测定装置得到的叶 片横截面最大光化学量子效率的正确性进行验证，具体验证过程为：

1、采集新鲜菠菜叶片3片，依次编号，放在湿纱布中暗适应20min；

2、打开显微镜3、CCD图形采集装置4和计算机5，打开激发光源1和斩波器2， 产生调制测量光；

3、取出菠菜叶片1夹设在两载玻片之间后放置在显微镜3的载物台上，用湿纱布 遮盖，调制测量光照射1min后使用pam101/102/103测定Fv/Fm；

4、然后将菠菜叶片1放在湿纱布中暗适应20min，夹设在两片载波片后放置在载 物台上，湿纱布遮盖，在调制光下照射3min后使用pam101/102/103测定Fv/Fm；

5、继续将菠菜叶片1放入湿纱布中暗适应20min夹设在两片载波片后放置在载物 台上，湿纱布遮盖，在调制测量光下照射5min后使用pam101/102/103测定Fv/Fm；

6、再次将菠菜叶片1放入湿纱布中暗适应20min，夹设在两片载波片后放置在载 物台上，湿纱布遮盖，在调制光下照射10min后使用pam101/102/103测定Fv/Fm；

7、重复步骤3～6依次测定暗适应好的菠菜叶片2和3；

8、根据以上测定结果如图4所示，在10分钟内Fv/Fm平均下降了2.33％±0.22， 自制调制光对叶绿素荧光Fv/Fm的影响是平稳的，不同时间下降程度没有显著差别 (n＝12,F＝0.383,p＝0.768)，证明利用本发明进行叶片横截面最大光化学量子效率是可 靠的。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都 是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应 排除在本发明的保护范围之外。