用于诱导免疫反应的糖疫苗组合物及其治疗癌症的用途

摘要

本发明涵盖包含Globo H?KLH缀合物和/或治疗性抗体的治疗性组合物以及产生和使用治疗性组合物治疗增生性疾病如癌症的方法。治疗性缀合物包含与载体连接的抗原。特别地，治疗性缀合物包含Globo H部分和KLH部分和/或任选通过接头连接的衍生化KLH部分亚单位。部分地构思治疗性组合物充当癌症疫苗用于加强身体借助免疫系统天然地保护自身免于遭受损细胞或异常细胞如癌细胞所致危险的能力。有效免疫反应是减少疾病严重程度，包括但不限于预防疾病、延迟疾病发作、降低症状严重程度、减少发病率和延迟死亡的免疫反应。

说明书

技术领域

本发明总体上涵盖用于癌症免疫疗法的组合物和方法并且尤其涵盖能够激发抗癌症免疫反应的免疫原性糖缀合物。

发明背景

合成糖缀合物激发抗体的用途首先由Goebel和Avery在1929年展示。(Goebel,W.F.和Avery,O.T.,J.Exp.Med.,1929,50,521；Avery,O.T.和Goebel,W.F.,J.Exp.Med.,1929,50,533)。糖通过重氮苯糖苷与载体蛋白连接。用合成性抗原免疫兔生成多克隆抗体。其他研究者(Allen,P.Z.和Goldstein,I.J.,Biochemistry,1967,6,3029；Rude,E.和Delius,M.M.,Carbohydr.Res.,1968,8,219；Himmelspach,K.等人,Eur.J.Immunol.,1971,1,106；Fielder,R.J.等人,J.Immunol.,1970,105,265)开发了用于糖与蛋白质载体缀合的相似技术。

糖缀合物可以用于从接种生成以特异性靶向肿瘤细胞上的已知靶物质的主动免疫治疗药中。对糖抗原的反应正常不涉及利用将辅助体内排斥肿瘤的T细胞。尽管认为不太可能因采用缀合物接种而导致完全排斥肿瘤，但这类治疗将强化免疫监视并且可能减少新肿瘤集落的复现。(Dennis,J.,Oxford Glycosystems Glyconews Second,1992；Lloyd,K.O.,引自Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines,1993,New York Academyof Sciences,50-58)。Toyokuni和Singhal已经描述了一种合成性糖缀合物(oyokuni,T.等人,J.Am.Chem.Soc.,1994,116,395)，其刺激可度量IgG滴度，该结果有意义，因为IgG反应通常与召集辅助T细胞相关。

糖抗原Globo H(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)在1984年首先由Hakomori等人从乳腺癌MCF-7细胞作为神经酰胺连接的糖脂分离并鉴定。(Bremer EG等人,(1984)J Biol Chem 259:14773-14777)。采用抗Globo H单克隆抗体的其他研究显示Globo H在许多其他癌症上存在，包括前列腺癌、胃癌、胰癌腺、肺癌、卵巢癌和结肠癌，并且仅在正常分泌组织中免疫系统容易不可及的管腔表面上少量表达。(Ragupathi G等人,(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128(1997)。此外，已经确立乳腺癌患者的血清含有高水平的抗Globo H抗体。(Gilewski T等人,(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275；Huang C-Y等人,(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20；Wang C-C等人,(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666)。与Globo H阴性肿瘤患者相比，Globo H阳性肿瘤患者显示较短的存活期。(Chang,Y-J等人,(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304)。这些研究使得Globo H(一种六糖表位)成为有吸引力的肿瘤标记和用于开发癌症疫苗的可行靶。

显示与免疫佐剂组合的合成性Globo H疫苗在前列腺癌患者和转移性乳腺癌患者中均主要诱导IgM并且较低程度地诱导IgG抗体。在I期临床试验中，该疫苗还显示最小毒性，伴以接种部位的一过性局部皮肤反应。(Gilewski T等人,(2001)Proc Natl Acad SciUSA 98:3270-3275；Ragupathi G等人,(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128；Slovin SF等人,(1997)Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715)。已经在某些这类患者中观察到的轻微流感样症状可能与QS-21的副作用相关。已经报道一种五价疫苗产生抗Globo H血清，同时在ELISA测定中IgG滴度比IgM更高，所述五价疫苗含有5种与马来酰亚胺修饰的载体蛋白KLH缀合的前列腺癌及乳腺癌相关糖抗原-Globo-H、GM2、STn、TF和Tn。(Zhu J.等人,(2009)J.Am.Chem.Soc.131(26):9298-9303)。

已知KLH含有装配形成十聚物(10-mer)粒子、二十聚物(20-mer)粒子和更大粒子的糖基化多肽亚基。这些多聚体结构已经用超速离心技术表征，所述超速离心技术对于解离的亚单位产生11-19S的沉降系数并且对于二十聚物多聚体产生92-107S的沉降系数。进一步已知，多种因素可能影响软体动物(molluscam)血蓝蛋白(包括KLH)的大小分布。这些因素包括离子强度、pH、温度、pO₂和某些二价阳离子、尤其钙和镁离子的可用性。本发明人已经开发了有效性增加的组合物，所述组合物主要由连接至多个Globo>

尽管已经开发疫苗以激发针对Globo H的抗体反应，但是它们的抗癌效果不令人满意，原因在于Globo H的抗原性低。需要能够激发靶向Globo H的高水平免疫反应的新疫苗。

发明简述

本发明总体上涵盖包含Globo H的治疗性和/或预防性组合物，以及免疫治疗药、疫苗、剂型、试剂盒及其制造和治疗方法。

在一个实施方案中，本发明涵盖包含Globo H部分的分离的治疗性缀合物，所述Globo H部分与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)部分亚单位连接。在某些实施方案中，连接是共价键。

在另一个实施方案中，本发明涵盖包含Globo H部分的分离的治疗性缀合物，所述Globo H部分与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接，其中KLH是衍生化KLH。如本文所用，当指称Globo-H和KLH时，术语“共价连接的”意为：Globo-H直接与KLH共价连接，或Globo-H与(如本文中所述的)衍生化KLH共价连接，或Globo-H通过(如本文中所述的)接头基团与KLH共价连接，或Globo-H通过接头基团和衍生化KLH与KLH共价连接。

在某些示意性的实施方案中，本发明的衍生化KLH具有以下结构：

在另一个实施方案中，本发明涵盖包含Globo H部分的分离的治疗性缀合物，所述Globo H部分通过接头分子与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接。

在一个优选实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚单位的赖氨酸残基结合。

在一个实施方案中，每个KLH部分亚单位总计确切地或大致地存在145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160个赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可用于结合或实际上直接或间接地结合Globo>

在另一个实施方案中，本发明涵盖包含Globo H部分的分离的治疗性缀合物，所述Globo H部分通过4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)接头基团与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接。本发明的MMCCH接头具有以下结构：

在另一个说明性实施方案中，本发明涵盖具有以下总体结构的分离的治疗性缀合物：

其中n是从约1至约160的整数。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约160个Globo H部分。本领域普通技术人员会认识到这些结构作为盐酸亚胺盐显示，但还可以作为亚胺形式存在或共存。因此，本发明涵盖亚胺及其盐，包括盐酸亚胺盐。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约125个Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约100个Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约75个Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约50个Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约25个Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1个至约10个Globo>

在某些实施方案中，Globo H部分在碱性氨基酸残基上与KLH部分共价缀合。在某些实施方案中，碱性氨基酸残基是精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其组合。

在另一个实施方案中，Globo H部分与单体KLH部分亚基上的赖氨酸缀合位点结合。

在另一个实施方案中，每个单体KLH部分亚单位上确切地或大致地存在60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110个可用于结合至或实际结合至Globo H部分的赖氨酸缀合位点。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚单位上存在62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100个这类赖氨酸缀合位点。

在含有部分亚单位(例如，KLH1和KLH2或其变体)的混合物的某些治疗性组合物实施方案中，如跨不同亚基类型共同所计数的可用赖氨酸(对于两种亚单位而言)总数可以是或确切或大致是290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310个。在这类实施方案中，跨不同亚单位(例如，KLH1和KLH2或其变体)总计存在或可以确切地或大致地存在130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158，159或160个赖氨酸缀合位点在一起。在其他这类实施方案中，存在136、137、141、140、143、147或155个赖氨酸缀合位点。

在另一个说明性实施方案中，本发明涵盖具有以下总体结构的分离的治疗性缀合物：

其中n独立地是从约1至约3000的整数，并且m独立地是从约1至约20的整数。在某些实施方案中，当m大于1时，KLH部分可以聚集以形成多聚体结构。在某些实施方案中，聚集作用是共价键。在某些其他实施方案中，聚集作用不是共价键(例如，聚集作用由H键相互作用或疏水相互作用形成)。在某些实施方案中，单体KLH部分(即，其中m＝1)可以包括从约1个至约160个Globo H部分。在某些实施方案中，二聚体KLH部分(即，其中m＝2)可以包括从约1个至约300个Globo H部分。在某些实施方案中，三聚体KLH部分(即，其中m＝3)可以包括从约1个至约450个Globo H部分。在某些实施方案中，四聚体KLH部分(即，其中m＝4)可以包括从约1个至约600个Globo H部分。在某些实施方案中，五聚体KLH部分(即，其中m＝5)可以包括从约1个至约750个Globo>

在另一个说明性实施方案中，本发明涵盖具有以下总体结构的分离的治疗性缀合物：

其中n独立地是从约1至约150的整数，并且m独立地是从约1至约20的整数。

在另一个实施方案中，本发明涵盖具有以下总体结构的分离的治疗性缀合物：

其中n独立地是从约1至约160的整数，并且其中m独立地是从约1至约20的整数。在某些实施方案中，m是从约1至约5的整数。在某些实施方案中，m是从约1至约3的整数。在某些实施方案中，m是1。在某些实施方案中，m是2。在某些实施方案中，m是3。在某些实施方案中，m是4。在某些实施方案中，m是5。在某些实施方案中，m是6。在某些实施方案中，m是7。在某些实施方案中，m是8。在某些实施方案中，m是9。在某些实施方案中，m是10。在某些实施方案中，m是11。在某些实施方案中，m是12。在某些实施方案中，m是13。在某些实施方案中，m是14。在某些实施方案中，m是15。在某些实施方案中，m是16。在某些实施方案中，m是17。在某些实施方案中，m是18。在某些实施方案中，m是19。在某些实施方案中，m是20。在某些实施方案中，对于以上实施方案的任一个，当m是1至20时，每个n分别是1、2、3、4、5，6、7、8、9、10，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、或160。

在某些实施方案中，存在多于一个与每个单体KLH部分连接的Globo H部分。在某些示意性的实施方案中，多于一个与每个单体KLH部分连接的Globo H部分经接头连接。在其他示意性的实施方案中，多于一个与每个KLH部分连接的Globo H部分经接头连接并与衍生化KLH部分连接。

在另一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少1。在另一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少10。在另一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分的比率是至少25。在另一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少50。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少100。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少150。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少500。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少750。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少1000。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少1500。在又一个实施方案中，Globo H部分对KLH部分亚单位的比率是至少2000。

在多种实施方案中，本发明涵盖单个KLH单体至多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)KLH亚单位，各自具有连接的多个Globo H部分。在某些实施方案中，Globo H部分对KLH部分的比率是相同的。在其他实施方案中，Globo H部分对KLH部分的比率是不同的。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含至少两个KLH部分的组合物。例如，衍生化KLH部分处于二聚体的形式。在另一个实施方案中，至少两个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少两个KLH部分是不同的。在又一个实施方案中，至少两个KLH部分具有相同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。在又一个实施方案中，至少两个KLH部分具有不同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含至少三个KLH部分(例如，三聚体形式的衍生化KLH部分)的治疗性组合物。在某些实施方案中，至少三个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少三个KLH部分不是相同的。在又一个实施方案中，至少三个KLH部分具有相同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。在又一个实施方案中，至少三个KLH部分具有不同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含至少四个KLH部分(例如，四聚体形式的衍生化KLH部分)的治疗性组合物。在某些实施方案中，至少四个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少四个KLH部分不是相同的。在又一个实施方案中，至少四个KLH部分具有相同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。在又一个实施方案中，至少四个KLH部分具有不同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含至少五个KLH部分(例如，五聚体形式的衍生化KLH部分)的治疗性组合物。在某些实施方案中，至少五个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少五个KLH部分不是相同的。在又一个实施方案中，至少五个KLH部分具有相同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。在又一个实施方案中，至少五个KLH部分具有不同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含至少六个KLH部分(例如，六聚物形式的衍生化KLH部分)的治疗性组合物。在某些实施方案中，至少六个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少六个KLH部分不是相同的。在又一个实施方案中，至少六个KLH部分具有相同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。在又一个实施方案中，至少六个KLH部分具有不同的Globo H部分对KLH部分亚单位比率。

在一个实施方案中，Globo H部分包含(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)。在又一个实施方案中，KLH部分亚单位是KLH-1或KLH-2部分或其组合。如本文所用，术语“KLH”指KLH-1、KLH-2和/或其组合。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少99％相同。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少95％相同。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少90％相同。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少80％相同。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少70％相同。

在另一个实施方案中，KLH部分亚单位与相应的天然存在的KLH部分亚单位至少60％相同。

在另一个实施方案中，Globo H部分通过接头与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接。在又一个实施方案中，Globo H部分通过4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)键与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接。在另一个其他实施方案中，Globo H部分与衍生化的匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接并且由4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)键连接。

在另一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有基于KLH单体的至少或大约150的表位比率，所述KLH单体具有约350KDa至约400KDa的分子量。在另一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约100的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约75的表位比率。在仍然又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约50的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约25的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约15的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约5的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或大约1的表位比率。

本发明的另一个实施方案涵盖一种包含KLH部分亚单位的药物组合物，其中每个KLH部分亚单位包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少两个KLH部分亚单位的二聚体，其中每个KLH部分亚单位包含与KLH部分亚单位共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少三个KLH部分亚单位的三聚体，其中每个KLH部分亚单位包含与KLH部分亚单位共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少四个KLH部分亚单位，其中每个KLH部分亚单位包含与KLH部分亚单位共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含KLH部分亚单位(例如，单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等)的混合物，其中每个KLH部分亚单位包含与KLH部分亚单位共价连接的多个Globo>

本发明的另一个方面涉及一种包含KLH部分的单体、二聚体、三聚体、四聚体或五聚体或其组合的药物组合物，其中每个KLH包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚单位共价连接的一个或多个Globo>

在本发明的一个实施方案中，该组合物中治疗性缀合物的表位比率范围从约1至3000。在又一个实施方案中，该组合物中治疗性缀合物的表位比率范围从约75至2000。在又一个实施方案中，该组合物中治疗性缀合物的表位比率范围从约100至1000。在又一个实施方案中，该组合物中治疗性缀合物的平均表位比率范围从约150至500。

在另一个实施方案中，组合物中约1％至99％的治疗性缀合物是KLH单体。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物是KLH二聚体。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物是KLH三聚体。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物是KLH四聚体。在又一个实施方案中，组合物中约1％至99％的治疗性缀合物是KLH五聚物。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含6个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含7个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含8个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含9个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含10个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含11个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含12个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含13个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含14个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含15个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含16个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含17个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含18个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含19个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约0％至99％的治疗性缀合物包含20个KLH亚单位。在又一个实施方案中，组合物中约1％至99％的治疗性缀合物是单体、二聚体、三聚体、四聚体或其组合。在又一个实施方案中，组合物中约99％的治疗性缀合物是单体、二聚体、三聚体、四聚体或其组合。

在另一个实施方案中，药物组合物包含佐剂，所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂、Toll样受体分子、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛、双链RNA、病毒DNA、非甲基化CpG岛、左旋咪唑、卡介菌(bacillus calmette-guerin)、异丙肌苷、Zadaxin、PD-1拮抗剂、PD-1抗体、CTLA拮抗剂、CTLA抗体、白介素、细胞因子、GM-CSF、基于铝盐的糖脂、磷酸铝、明矾、氢氧化铝、脂质体、TLR2激动剂、脂肽、纳米粒子、单磷酸酯类脂A、OPT-821皂素、QS-21皂素、水包油纳米乳液、和细菌样粒子。

在另一个实施方案中，药物组合物包含选自IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF和TGF-β的细胞因子。在又一个实施方案中，药物组合物包含趋化因子。

在又一个实施方案中，治疗药作为药物组合物施用。

在又一个实施方案中，药物组合物包含单克隆抗体、化疗药、激素治疗药、类视黄醇受体调节物、细胞毒/细胞抑制药物、抗肿瘤药、抗增殖剂、抗mTOR药物、抗Her2药物、抗EGFR药物、异戊烯基-蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲类、血管生成抑制剂、贝伐珠单抗、细胞增殖和存活信号传导途径抑制剂、凋亡诱导剂、干扰细胞周期检查点的药物、干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药物、整联蛋白阻断剂、NSAID、PPAR激动剂、内在多药耐药(MDR)抑制剂、镇吐药、可用于治疗贫血的药物、可用于治疗中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药物、二膦酸盐类、芳香酶抑制剂、诱导肿瘤细胞终末分化的药物、γ-分泌酶抑制剂、癌症疫苗(例如、主动免疫疗治疗药)、单克隆抗体治疗药(例如，被动免治疗药)及其任意组合。

在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物还可以包含PD-1/PD-L1抑制剂(细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫治疗药)、CTLA-4免疫治疗药、CDK4/6抑制剂(靶向治疗药)、PI3K抑制剂(靶向治疗药)、mTOR抑制剂(靶向治疗药)、AKT抑制剂(靶向治疗药)、泛Her抑制剂(靶向治疗药)。也可以修饰这些抑制剂以产生相应的单克隆抗体。这类抗体可以包含于本发明的治疗性组合物中。

在另一个实施方案中，药物组合物包含可药用载体。在又一个实施方案中，药物组合物是癌症疫苗。在又一个实施方案中，将药物组合物配制用于皮下施用。在又一个实施方案中，将药物组合物配制用于肌内施用。在又一个实施方案中，将药物组合物配制用于动脉内施用。在又一个实施方案中，将药物组合物配制用于静脉内施用。

本发明的另一个实施方案涵盖一种治疗有需要的患者中癌症的方法，所述方法包括施用有效量的包含Globo H和KLH的治疗性组合物。在一个实施方案中，患者已经诊断患有或疑似患有癌症。在另一个实施方案中，癌症是上皮癌。在又一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在又一个实施方案中，药物组合物/治疗性组合物中Globo-H部分的治疗有效量可以是从约0.001μg/kg至约250mg/kg。在又一个实施方案中，药物组合物/治疗性组合物中Globo-H部分的治疗有效量包含每剂量约10μg/kg至约50μg/kg的一种治疗性缀合物。在又一个实施方案中，药物组合物/治疗性组合物中Globo-H部分的治疗有效量包含每剂量约0.10μg/kg至约0.75μg/kg的一种治疗性缀合物。

在又一个实施方案中，治疗性组合物中Globo-H-KLH复合物的治疗有效量可以是从约0.001μg/kg至约250mg/kg。在又一个实施方案中，治疗性组合物中Globo-H-KLH复合物的治疗有效量包含每剂量约10μg/kg至约50μg/kg的一种治疗性缀合物。在又一个实施方案中，治疗性组合物中Globo-H-KLH复合物的治疗有效量包含每剂量约0.60μg/kg至约4.50μg/kg的一种治疗性缀合物。

在又一个实施方案中，该方法能够延长无病情进展生存期超过对照安慰剂大约或至少1周。在又一个实施方案中，该方法能够延长无病情进展生存期超过对照安慰剂大约或至少2周。在又一个实施方案中，该方法能够延长无病情进展生存期超过对照安慰剂大约或至少1个月。在又一个实施方案中，该方法能够延长无病情进展生存期超过对照安慰剂大约或至少3个月。在又一个实施方案中，该方法能够延长无病情进展生存期超过对照安慰剂大约或至少6个月。在又一个实施方案中，该方法能够延长总生存期超过对照安慰剂大约或至少12个月。

附图简述

可以通过参考附图在结合下述详细描述一起考虑时更完整地理解本发明。附图中所示的实施方案仅意在例示本发明并且不应当解释为将本发明限于所示的实施方案。

图1A显示Globo H以及几种示例性Globo H类似物的化学结构。Glc代表葡萄糖，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺并且Fuc代表岩藻糖。图1B显示通过MMCCH接头缀合的示例性Globo H-KLH亚单位。

图2A显示示例性Globo H-KLH亚单位缀合合成途径。图2B显示与Slovin等人,(1999),Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5和Gilewski等人,(2001),Proc Natl AcadSci USA 98:3270-5中公开的Globo H缀合物相比的本发明Globo H-KLH二聚体和三聚体。

图3显示天然KLH(8.3MDa)的多角度激光散射光谱测定法(MALS)的结果。

图4显示天然KLH(8.3MDa)的大小排阻层析的结果。

图5显示用本发明Globo H-KLH糖缀合物免疫的Lewis大鼠中B/CD3⁺T/CD4⁺T/CD8⁺T细胞群体的时序扩充。小图A-D分别代表B细胞、CD3T细胞、CD4T细胞，和CD8T细胞群体。数据作为所示组中细胞数的百分数呈递，所述细胞数的百分数对PBS组中细胞数的百分数归一化。将多重比较结果使用两因素ANOVA分析，随后进行Bonferroni事后检验。与PBS组相比，*，p<0.05；**，p<0.01并且***，p<0.001。

图6显示来自用本发明糖缀合物(Globo H-KLH)免疫的Lewis大鼠的血液中(A)IgM抗体和(B)IgG抗体滴度倒数的时序变化。

图7显示小鼠中响应于本发明糖缀合物(Globo H-KLH)的IgM抗体滴度。

图8显示在第0、第5和第10日用PBS、仅佐剂或Globo H-KLH+佐剂免疫的C57BL/6小鼠的免疫原性。在第14日采集血清用于ELISA分析以确定抗Globo H IgG和IgM产生量。

图9显示补体依赖细胞毒性，其中将Globo H(+)或Globo H(-)TOV21G细胞铺种在96孔板中。抗Globo H血清或对照血清按稀释度1:50或1:100添加。随后向平板添加/不添加补体。通过LDH测定法测定补体依赖细胞毒性(CDC)。

图10显示铺种在96孔板中的Globo H(+)或Globo H(-)TOV21G细胞的细胞毒性。抗Globo H血清或对照血清按稀释度1:50或1:100添加。使用从外周血单核细胞(PBMC)分离并用抗CD3抗体活化的人NK细胞作为效应子细胞。对于补体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)反应，按ET比率4:1、2:1或1:1添加或不添加效应子细胞。对无小鼠血清对照归一化每种细胞在不同ET比率下的细胞毒性。

图11显示照射的NOD-SCID小鼠，所述小鼠在第0日用1x10⁶个Globo>

图12显示在Globo H KLH免疫的C57BL/6小鼠上的LLC1(一种肺癌上皮癌细胞系)肿瘤生长，所述小鼠在第0、5和11日用PBS、仅佐剂或Globo H-KLH/佐剂皮下接种。在第16日将1x10⁵个LLC1细胞皮下注入每只小鼠。治疗药随后在第29日和第34日皮下施用。在第16、21、25、29、32、34、37日监测肿瘤尺寸。

图13显示肽鉴定的表格汇总。

图14显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品1(1^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图15显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品2(1^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图16显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品3(1^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图17显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品4(1^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图18显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品1(2^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图19显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品2(2^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图20显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品3(2^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图21显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品4(1^stLC-MS/MS)的Globo-H缀合肽的鉴定细节。

图22显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品1(1^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图23显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品2(1^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图24显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品3(1^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图25显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品4(1^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图26显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品1(2^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图27显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品2(2^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图28显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品3(2^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图29显示KLH1(a)和KLH2(b)的样品4(1^stLC-MS/MS)的MMCCH缀合肽的鉴定细节。

图30显示对于KLH1(a)和KLH2(b)的(1^stLC-MS/MS)和KLH1(c)和KLH2(d)的(2^ndLC-MS/MS)而言Globo-H缀合的赖氨酸鉴定的总结。

图31显示对于KLH1(a)和KLH2(b)的(1^stLC-MS/MS)和KLH1(c)和KLH2(d)的(2^ndLC-MS/MS)而言MMCCH缀合的赖氨酸鉴定的总结。

图32显示在第一轮(a)和第二轮(b)LC-MS/MS中Globo-H缀合分析的总结。

图33(a)显示化学式：C(56)H(91)N(5)O(33)S(1)，单一同位素MW加和：1393.5317Da。图33(b)显示化学式：1.C(18)H(28)N(4)O(4)S(1)，单一同位素MW加和：396.1831Da；2.化学式：C(24)H(38)N(4)O(9)S(1)，单一同位素MW加和：558.2360Da；3.化学式：C(30)H(48)N(4)O(14)S(1)，单一同位素MW加和：720.2888Da；4.化学式：C(36)H(58)N(4)O(19)S(1)，单一同位素MW加和：882.3416Da；5.化学式：C(44)H(71)N(5)O(24)S(1)，单一同位素MW加和：1085.4210Da。

图34(a)显示MMCCH衍生物的化学结构。化学式：C(16)H(24)N(4)O(3)S(1)，单一同位素MW加和：352.1569Da。图34(b)显示脱酰胺的MMCCH衍生物，其化学式为：C(16)H(22)N(2)O(4)S(1)，单一同位素MW加和：338.1300Da。

发明详述

除非另外说明，否则本发明的实施将使用处于本领域技术人员能力范围内的分子生物学、微生物学和免疫学常规技术。这类技术在文献中充分解释。参见，例如，MolecularCloning A Laboratory Manual,第2版，Sambrook,Fritsch和Maniatis编著(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning,第I和第II卷(D.N.Glover编著,1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；专著Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编著,1987,Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology,第154和第155卷(Wu等人编著),ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编著,Academic Press,London,1987)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lanes(Cold Spring HarborLaboratory Press,1988)；和Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著,1986)。

在权利要求书和/或本说明书中与术语“包含”联合使用时，词“一个(a)”或“一种(an)”的用途可以意指“一个(one)”，但是它还符合以下意思：“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。

在本申请通篇范围内，术语“约”用来表示，某个值例如包括测量装置、正在用来测定该值的方法或研究受试者之间存在的变异的内在误差变异。一般，根据情况，该术语意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％变异性。

如本文所用，术语“烷基”指除非另外声明否则含有1-20个碳原子(例如，C₁-C₈或C₁-C₄)的直链或支链单价烃，所述单价烃可以是取代或未取代的。烷基的例子包括但不限于甲基，乙基，正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

虽然本公开内容支持仅指替代物和“和/或”的定义，但是除非明确指示仅指替代物或替代物是互斥的，否则术语“或”在权利要求书中的用途用来意指“和/或”。

如本说明书和权利要求书中所用，词“包含”(以及包含的任何形式，如“包含了”及“包含着”)、“具有”(以及具有的任何形式，如“具有了”及“具备”)、“包括”(以及包括的任何形式，如“包括了”及“包括”)或“含有”(以及含有的任何形式，如“含有”及“含有”)是包含性的或开放式的并且不排除额外的、未提到的药物或方法步骤。构思了本说明书中讨论的任何实施方案可以相对于本发明的任何方法或组合物而实施，并且反之亦然。另外，本发明的组合物可以用来实现本发明的方法。

“治疗”或“治疗”在本文中称作向受试者施用治疗性组合物，目的在于治愈、缓和、缓解、纠正、防止或改善某病症、该病症的症状、继发于该病症的疾病状态或倾向于该病症的素质。

“有效量”是治疗性组合物的量，所述量能够产生医学上合乎需要的结果，如本文在所治疗的受试者中描述。医学上合乎需要的结果可以是客观的(即，通过一些试验或标志物可度量)或主观的(即，受试者给出有效果的指示或感到有效果)。

如本文提到的“用治疗性组合物治疗可处理的疾病”意指可以通过施用本文公开的治疗性组合物治疗的任何过程、病状、病症、病痛和/或疾病。

“增殖性病症”是这样的病症，其中产生过多某种类型的细胞，导致健康变坏。增殖性病症可以是良性或恶性的。增殖性病症可以包括例如癌症。

可以通过本文公开的治疗性组合物治疗的“癌症”是细胞异常生长。癌细胞已经丧失正常控制机制并且因此能够连续地扩充，侵入毗邻组织，迁移至身体的远端部分并促进细胞从中提取养分的新血管的生长。如本文所用，癌症可以是恶性或良性的。癌症可以从身体内部的任何组织形成。随着细胞生长及增殖，它们形成组织团块，称作肿瘤。术语肿瘤指异常的生长或团块。肿瘤可以是癌性(恶性)的或非癌性(良性)的。癌性肿瘤可以侵入临近组织并扩散遍及身体各处(转移)。然而，良性肿瘤通常不侵入临近组织并且不扩散遍及身体各处。癌症可以划分成血液癌和血液形成性组织的癌(白血病和淋巴瘤)和“实体”瘤。“实体”瘤可以是癌或肉瘤。

可以通过本发明治疗性组合物治疗的癌症包括按部位分类的那些、包括口腔和咽(唇、舌、唾液腺、口底、齿龈和其他口部位、鼻咽、扁桃体、口咽、下咽、其他口/咽部位)的癌症；消化系统(食道；胃；小肠；结肠和直肠；肛门、肛管和肛门直肠部；肝；肝内胆管；胆囊；其他胆部位；胰；腹膜后腔；腹膜、网膜和肠系膜；其他消化道部位)的癌症；呼吸系统(鼻腔、中耳和鼻窦；喉；肺和支气管；胸膜；气管、纵隔和其他呼吸道部位)的癌症；间皮瘤的癌症；骨及关节的癌和软组织(包括心脏)的癌症；皮肤癌，包括黑素瘤和其他非上皮性皮肤癌；卡波西肉瘤和乳腺癌；雌性生殖器系统(子宫颈；子宫体；子宫、卵巢；阴道；外阴；和其他雌性生殖器部位)的癌症；雄性生殖器系统(前列腺；睾丸；阴茎；和其他雄性生殖器部位)的癌症；泌尿系统(尿膀胱；肾和肾盂；输尿管；和其他泌尿系统部位)的癌症；眼和眼眶的癌症；脑和神经系统(脑；和其他神经系统部位)的癌症；内分泌系统(甲状腺和其他内分泌部位，包括胸腺)的癌症；淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤和白血病(淋巴细胞白血病；髓样白血病；单核细胞性白血病；和其他白血病)。

按组织学类型分类的可能是本发明治疗性组合物的合适靶的其他癌症包括但不限于恶性肿瘤；癌(NOS，未特指)；未分化的癌(未特指)；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌(未特指)；乳头状癌(未特指)；鳞状细胞癌(未特指)；淋巴上皮癌；基底细胞癌(未特指)；毛母质癌；移行细胞癌(未特指)；乳头状移行细胞癌；腺癌(未特指)；胃泌素恶性；胆管癌；肝细胞癌(未特指)；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺癌在中的腺瘤息肉；腺癌，家族性息肉杆菌；实体癌(未特指)；类癌瘤恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌(未特指)；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌(未特指)；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌(未特指)；乳头状和滤泡性腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；内膜样癌；皮肤附肢癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌(未特指)；乳头状囊腺癌(未特指)；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌(未特指)；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌(未特指)；小叶状癌；炎性癌；乳腺Paget病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性卵泡膜瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤(未特指)；无黑素性黑素瘤；表面扩散的黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤(未特指)；纤维肉瘤(未特指)；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤(未特指)；平滑肌肉瘤(未特指)；横纹肌肉瘤(未特指)；胚胎横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤(未特指)；恶性混合瘤(未特指)；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤(未特指)；恶性间叶瘤；恶性Brenner瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤(未特指)；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌(未特指)；恶性畸胎瘤(未特指)；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；中肾瘤恶性；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤(未特指)；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤(未特指)；恶性成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨的巨细胞瘤；Ewing肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；胶质瘤恶性；室管膜瘤(未特指)；星形细胞瘤(未特指)；原浆性星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤(未特指)；少突胶质细胞瘤(未特指)；成间胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤(未特指)；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤(未特指)；视网膜母细胞瘤(未特指)；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性粒细胞瘤；恶性淋巴瘤(未特指)；霍奇金病(未特指)；霍奇金病；副肉芽肿(未特指)；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤(未特指)；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病(未特指)；淋巴样白血病(未特指)；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病(未特指)；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸粒细胞性白血病；单核性白血病(未特指)；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和多毛细胞白血病。

如本文定义的“上皮癌”指从皮肤、中空内脏、和其他器官的上皮或相关组织形成的癌。上皮癌包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、皮肤癌、肾癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肠癌、胰腺癌和膀胱癌。

如本文所用的“患者”或“受试者”指诊断为或疑似患有或形成增生性疾病如癌症的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、羊、啮齿类和可能受益形成增生性疾病如癌症的其他哺乳动物。

如本文所用，“基本上纯化的”或“基本上分离的”指处于下述状态的分子(例如化合物)，在所述状态下，所述分子与其天然状态下通常与之结合的基本上全部其他分子分离。优选地，基本上纯化的分子是制品中存在的优势种类。特别地，基本上纯化的分子可以不含大于60％、优选地不含75％、更优选地不含90％和最优选地不含95％在天然混合物中存在的其他分子(不包括溶剂)。术语“基本上纯化的”或“基本上分离的”不意在包括以其天然状态存在的分子或物质。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”或“基本上分离的”包括将一种KLH部分从另一个KLH部分中纯化(例如，将KLH二聚体部分与KLH三聚体部分基本上纯化或基本上分离)。在另一个实施方案中，术语“基本上纯化的”或“基本上分离的”不包括将一种KLH部分从另一种KLH部分中纯化(例如，在基本上纯化或基本上分离的组合物中包含KLH二聚体和KLH三聚体)，但是杂质基本上移除。

“施用”在本文中作为向患者提供本发明的治疗性组合物提及。以举例方式并且不作限制，组合物施用，例如，注射，可以通过静脉内(i.v.)内注射、皮下(s.c.)注射、真皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、或肌内(i.m.)注射进行。可以使用一种或多种这类途径。肠胃外施用可以例如通过快速浓注或通过随时间推移逐步灌流进行。可选地或同时，施用可以通口服途径进行。额外地，施用也可以是通过手术置入丸粒或安置医疗装置进行。

“有需要的患者”在本文中称作诊断为或疑似患有增殖性病症的患者。在一个实施方案中，该患者患有或可能形成癌症。

如本文所用，术语“抗原”定义为能够在蛋白质载体和/或佐剂帮助下或没有其帮助下激发免疫反应的任何物质。优选地，本发明组合物的抗原包括糖并且更优选地包括聚糖-抗原并且最优选地包括Globo>

如本文所用，术语“免疫原性”指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反应的能力。

如本文所用，术语“免疫疗法”指基于以下构思的一系列治疗策略：调节免疫系统以实现预防目的和/或治疗目的。

如本文所用，术语“表位”定义为抗原分子中接触抗体或T细胞受体的抗原结合位点的部分。

本发明的“治疗性组合物”优选地包含“治疗性缀合物”和/或“治疗性抗体”。治疗性缀合物包含至少一种与载体连接的抗原。优选地，治疗性缀合物的连接是共价的。在治疗性缀合物的一个实施方案中，抗原是聚糖如Globo H部分，并且载体是KLH部分和/或KLH部分亚单位。因而，术语“治疗性缀合物”涵盖与一个或多个Globo H部分连接的一个或多个KLH部分亚单位。在一个实施方案中，术语“治疗性缀合物”涵盖与大约或至少1、10、10²或10³个Globo>

在一个实施方案中，治疗性缀合物是：Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-乙基肼-1-羰基-环己基-4-(甲基-N-马来酰亚胺)-3-(硫代丁基亚胺基)-匙孔血蓝蛋白(KLH)，也称作OPT-822。

“治疗性抗体”定义为特异性结合本发明的治疗性缀合物并优选地结合治疗性缀合物的Globo H部分的部分的抗体(如下文进一步定义)。

如本文所用，术语“疫苗”指一种含有治疗性缀合物的治疗性组合物，所述治疗性缀合物用来赋予免疫力对抗与抗原相关的疾病。癌症疫苗设计成加强身体借助免疫系统天然地保护自身免遭受损细胞或异常细胞如癌细胞所致危险的能力。保护性免疫反应是减少疾病严重程度，包括但不限于预防疾病、延迟疾病发作、降低症状严重程度、减少发病率和延迟死亡的免疫反应。优选地，疫苗能够激活体液免疫反应(例如刺激B淋巴细胞产生抗体)和细胞免疫反应(例如由T淋巴细胞和/或其他细胞，如NK细胞和巨噬细胞介导的免疫反应)。已经开发了测定免疫反应的标准测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、细胞增殖测定法、CTL测定法和ADCC/CDC测定法。

如本文所用，术语“聚糖”指多糖或寡糖。聚糖本文中用来还在指糖缀合物(如糖蛋白、糖脂、糖肽、糖蛋白质组、肽聚糖、脂多糖或蛋白聚糖)的糖部分。聚糖通常完全由单糖之间的O-糖苷键组成。例如，纤维素是由β-1,4连接的D-葡萄糖组成的糖(或更具体地葡聚糖)，并且壳多糖是由β-1,4连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是直链或分枝的。可以找到与蛋白质连接的聚糖，如在糖蛋白和蛋白聚糖中。它们通常存在于细胞的外表面上。O联和N联聚糖是真核生物中非常常见的，但是也可以在原核生物中存在，不过更不常见。N联聚糖与序列段中天冬酰胺的R-基团氮(N)连接存在。序列段是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。优选的聚糖是Globo>

Globo H是一种六糖，其是在多种类型的癌症、尤其乳腺癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌上高度表达的抗原性糖家族成员。在示意性实施方案中，某些患者在时间零处显示无抗Globo H抗体水平，并且在用本发明的治疗性组合物免疫后检测到高滴度。在其他的示意性实施方案中，某些患者在时间零处显示抗Globo H抗体水平，并且在用本发明的治疗性组合物免疫后检测到高滴度。在某些实施方案中，抗Globo H抗体作为糖脂在癌细胞表面上表达并且可能作为糖蛋白表达。在其他实施方案中，乳腺癌患者的血清含有高水平针对Globo H表位的抗体。在某些实施方案中，这个表位还由免疫组织化学研究中的单克隆抗体Mbr1、VK9和抗SSEA-3靶向。虽然某些正常组织也与Mbr1反应，包括正常乳腺、胰、小肠和前列腺组织，但是这些组织中的抗原优势局限于免疫系统进入受限制的分泌边缘处。

“Globo H部分”定义为作为Globo H或其片段或类似物的聚糖(即，含有糖部分的分子)。Globo H是含有六糖表位(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)并任选地含有非糖部分的聚糖。其片段是含有该六糖表位片段及(如适用)非糖部分的聚糖。这些寡糖可以通过例行方法制备。(参见Huang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:15-20(2006))。如果需要，它们可以与非糖部分连接。美国专利申请系列12/485546涉及一种向非人类哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、羊或马)施用上述免疫组合物并从哺乳动物分离与Globo H或其片段结合的抗体，产生对Globo H或其片段特异的抗体的方法。

Globo H的类似物可以使用聚糖微阵列生成并且包括在Wang等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2008August 19；105(33):11661–11666中公开并在图1中显示的那些。

Globo H类似物优选地结合抗体VK-9、Mbr1和抗SSEA-3。优选地，Globo H类似物以特定解离常数(K_D,surf)结合。朗格缪尔等温线可以用于分析结合曲线以产生在表面上的解离常数(K_D,surf)。在温育期间的平衡条件下，重复点的平均荧光(F_obs)可以由下式描述：

F_obs＝F_max[P]/(K_D，surf+[P]）

其中F_max是最大荧光强度，表面上活性糖的量的量值，[P]是总抗体浓度，并且K_D,surf是表面糖和抗体的平衡解离常数。如Wang等人中所述，在一些实施方案中，相对于Wang等人中描述的VK-9、Mbr1和抗SSEA-3抗体、Globo>D,surf)至少大约或确切地是0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或1.6nM。

“匙孔血蓝蛋白”(KLH)是一种大型多亚基载氧的金属蛋白存在于Megathuracrenulata的血淋巴中。KLH是由分子量约350,000至约390,000亚单位以分子量约400kDA(例如，KLH单体)至约8000kDA的聚集物(例如，KLH二十聚体)组成的不均一糖基化蛋白。KLH亚单位的每个结构域含有一起结合单个氧分子的两个铜原子。当氧与血蓝蛋白结合时，该分子呈现醒目的透明乳光蓝色。在某些实施方案中，KLH蛋白质在人类中具有强烈的免疫原性，但仍安全。在某些实施方案中，KLH可以通过一系列步骤从Megathura crenulata的血淋巴纯化，所述步骤一般包括硫酸铵沉淀和透析，并且可以涉及柱层析纯化以获得最高纯度。在某些实施方案中，KLH纯化还可以包括移除内毒素，但是这个步骤可能不是必需的，因为内毒素可以在注射时充当产生抗体的佐剂。优选地，具有清澈乳光蓝色的高质量KLH制品是KLH溶解度的最佳指标。在某些实施方案中，KLH单体单位装配成总分子量约4,000kDa至8,000kDa的庞大多聚体(十聚物或二十聚体)。“匙孔血蓝蛋白部分”或“KLH部分”在本文中限定为KLH1(SEQ ID NO:1)和KLH2(SEQ ID NO:2)蛋白质或与其基本上相同的蛋白质或其混合物。在这种情况下，基本上相同意指每个KLH部分具有与天然野生型KLH的氨基序列至少、大致或确切100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％或75％相同的氨基序列。在某些实施方案中，本发明的KLH具有增强的免疫原活性，尤其增强的抗肿瘤活性。在某些实施方案中，本发明组合物中的KLH包含大约400,000分子量的完整未降解的亚单位。在其他实施方案中，本发明的KLH包含更高阶的KLH多聚体。

在某些实施方案中，更高阶的KLH多聚体具有大约8-10百万分子量，沉降系数为约92-107S。存在的更高阶KLH多聚体的量基于沉降-平衡和/或沉降-速度超速离心分析。在其他实施方案中，本发明的KLH展示出增强的免疫原活性，尤其增强的抗肿瘤活性。例如但不限于以下情况见到增强的免疫原活性，(a)当注射KLH(不存在佐剂情况下)时，(b)当使用KLH作为佐剂时，(c)当使用KLH作为半抗原或弱免疫原性抗原的载体免疫原时，和(d)当使用KLH作为抗肿瘤药时。本发明的KLH组合物对许多肿瘤显示出增强的抗肿瘤活性，所述肿瘤包括但不限于膀胱、乳腺、卵巢肿瘤等。在某些实施方案中，两个KLH部分可以借助KLH单体之间的共价键形成二聚体。不受理论限制，认为KLH部分之间的共价键是借助于二硫键。在某些实施方案中，两个或更多个KLH部分可以借助KLH单体、二聚体、三聚体等之间的共价键形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。不受理论限制，认为KLH部分之间的共价键是借助于二硫键。

存在多种将KLH部分与抗原连接的方法，包括直接缀合和用双官能接头基团如4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)缀合。此类连接技术在美国专利号6,544,952中公开。在一些实施方案中，为了制备本发明的治疗性缀合物，例如，将Globo H烯丙基糖苷通过臭氧分解作用转化成醛并且将醛基团与交联剂MMCCH上的NH基团连接，产生Globo H-MMCCH；载体蛋白KLH经受硫羟化以产生KLH-SH；并且硫羟化KLH上的硫氢基随后与MMCCH上的马来酰亚胺基连接，产生Globo H-KLH缀合物。

在一个实施方案中，借助化学合成制备Globo H烯丙基糖苷。还使用硫羟化试剂2-亚氨基硫杂环戊烷和cGMP级KLH和4-(4-N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)接头。在一些实施方案中实施以下步骤：1)将Globo H烯丙基糖苷转化成Globo H-醛；2)将Globo H-醛与MMCCH偶联成Globo H-MMCCH；3)KLH的化学硫羟化；4)Globo H-MMCCH与硫羟化的KLH缀合；和5)纯化Globo H-KLH缀合物(OPT-822)。参见例如图2a。

在某些实施方案中，在Globo H部分蛋白质与KLH部分缀合期间，KLH部分蛋白质在某些实施方案中与完整分子相比显示分子量降低，这优选地归因于Globo H部分亚单位解离。在其他实施方案中，本文所公开的缀合方法产生先前未报道的KLH亚单位解离。在不希望受任何具体理论约束的同时，构思了本发明的Globo H部分-KLH部分亚单位缀合物的高糖基化水平导致氢键在Globo H部分之间形成。因而，在某些实施方案中，KLH部分亚单位之间的范德瓦尔斯力和疏水相互作用由Globo H氢键替换并且这种导致KLH部分亚单位分离。在缀合之后，Globo H部分-KLH部分缀合物的KLH部分亚单位优选地聚集以形成新的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体或其任意组合。所产生的治疗性Globo H部分-KLH部分缀合物具有出乎意料的巨大表位比率，导致出乎意料优越的免疫原属性。在某些实施方案中，Globo H部分与KLH1和KLH2上的赖氨酸缀合。在其他实施方案中，Globo H部分不与KLH1和KLH2上的赖氨酸缀合。在某些实施方案中，在肽图分析中发现Globo H-缀合的赖氨酸位点保守，提示Globo H-KLH组合物在其结构方面独特。

在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包含一个或多个KLH部分亚单位，其中至少一种这种亚单位至少、大约或确切地缀合至1、10、10²或10³倍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个或更多个Globo>

使用质谱分析，发明人发现Globo H部分缀合至KLH的赖氨酸残基。在某些实施方案中，因此优选Globo H部分与赖氨酸缀合。

在一个实施方案中，每个KLH部分亚单位总计确切地或大致地存在145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚单位确切地或大致地存在150个或156个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚单位上确切地或大致地存在60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110个可用于结合至或实际结合至Globo H部分的赖氨酸缀合位点。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚单位上存在62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100个这类赖氨酸缀合位点。赖氨酸缀合位点是KLH部分中的这些赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可用于结合或实际结合至Globo H部分和/或抵达Globo H部分的接头如例如MMCCH接头。

在含有部分亚单位(例如，KLH1和KLH2或其变体)的混合物的某些治疗性实施方案中，如跨不同亚基类型共同所计数的可用赖氨酸(对于两种亚单位而言)总数可以是或确切或大致是290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310个。在这类实施方案中，跨不同亚单位(例如，KLH1和KLH2或其变体)总计存在或可以确切地或大致存地在130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158，159或160个赖氨酸缀合位点在一起。在其他这类实施方案中，存在136、137、141、140、143、147或155个赖氨酸缀合位点。

在一个最优选的实施方案中，KLH1/KLH2中的总共306个赖氨酸残基当中存在136、137、140、141、143、147或155个赖氨酸缀合位点。

在某些实施方案中，本发明的治疗性组合物含有KLH部分亚单位-Globo H部分缀合物的混合物，其中这类缀合物仍是单体或形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体或其任意组合。在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包含分离的KLH部分亚单位-Globo H部分缀合物单体、二聚体、三聚体或四聚体或其组合。在又一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包括仅KLH部分亚单位-Globo H部分缀合物二聚体和三聚体。

在另一个实施方案中，治疗性组合物含有至少两个KLH部分亚单位，其中两个KLH-部分亚单位各自与不同的聚糖连接。与KLH部分亚单位可连接的其他肿瘤相关聚糖抗原可以包括但是不限于GM2、GD2、GD3、岩藻糖基、GM1、sTn、唾液酰-Lewis^x、Lewis^x、唾液酰Lewis^a、Lewis^a、sTn、TF、聚唾液酸、Lewis^y、黏蛋白、T抗原等。在一些实施方案中，治疗性组合物中仅、至少或大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的KLH部分亚单位与Globo>

如本文所用，涉及本文所公开的治疗性缀合物的“表位比率”例如指治疗性缀合物中抗原表位相对于载体分子的关系。优选地，它指Globo H部分相对于KLH部分的关系。最优选地，治疗性缀合物的表位比率使用以下式计算＝(实际Globo H部分重量/Globo H部分分子量)/(实际KLH部分重量/KLH部分分子量)。表位比例是容易地由本领域技术人员可确定的。优选地，例如通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)测定Globo H的重量。

优选地，本发明治疗性缀合物的表位比率大约、至少或确切地是：1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975或3000。

在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包含具有一系列表位比率的治疗性缀合物的混合物。在一个实施方案中，治疗性缀合物在治疗性组合物中的范围、均值或中位数表位比例是约10至约3200、约800至约2500、约1000至约2000、约1250至约1750或约1400至约1600。在另一个实施方案中，治疗性缀合物在治疗性组合物中的范围、均值或中位数表位比例是约10至约150、约40至约125、约50至约100、约62至约87或约70至约80。在另一个实施方案中，治疗性缀合物在治疗性组合物中的范围、均值或中位数表位比例是约20至约300、约80至约250、约100至约200、约125至约175或约140至约160。在另一个实施方案中，治疗性缀合物在治疗性组合物中的范围、均值或中位数表位比例是约30至约450、约120至约375、约150至约300、约185至约260或约210至约240。在某些药物组合物中，至少或大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的治疗性缀合物作为单体存在，或作为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或其组合存在。

针对治疗性缀合物的抗体

在某些示意性的实施方案中，本发明还涵盖分离的治疗性抗体，所述分离的治疗性抗体以高亲和力特异性结合本文公开的治疗性缀合物，以及它们在治疗和/或诊断增生性疾病中的用途。

如本文所用，术语“抗体”和“抗体”(免疫球蛋白)涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段、显示所需生物活性的抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)、胞内抗体以及前述任一者的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG>

抗体对本文所述的疗法中待使用的表位(例如，治疗性缀合物的Globo H部分)的“亲和力”是本领域中充分理解的术语并且意指抗体与表位结合的程度或强度。亲和力可以按本领域已知的许多方式测量和/或表述，包括但不限于平衡解离常数(KD或Kd)、表观平衡解离常数(KD’或Kd’)和IC₅₀(竞争测定法中实现50％抑制作用所需要的量)。可以理解，出于本发明的目的，亲和力是与表位结合的给定抗体群体的平均亲和力。本文中以mg>

如本文所用，术语“特异性结合”指结合对子(例如，抗体和抗原)之间的相互作用。在各种情况下，特异性结合可以由至少或大约10-6摩尔/升、大约10-7摩尔/升或约10-8摩尔/升或更小的亲和力常数体现。

生物学测定法

在一个实施方案中，当施用至患者时，含有本发明治疗性缀合物的治疗性组合物能够诱导比相同实验中施用之前的相同抗Globo H抗体滴度(即，处理前基线滴度)至少或大致高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、或5000倍的抗Globo H抗体滴度。在某些实施方案中，抗GloboH抗体是IgM抗体。在另一个实施方案中，抗Globo H抗体是IgG抗体。

本发明的治疗性组合物能够在受试者中诱导体液反应和细胞反应。在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物诱导Globo H部分特异性IgG抗体和IgM抗体的产生和B细胞和T细胞(例如CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞)的扩充。一般，这些免疫反应在施用后按时间顺序发生。在一个具体例子中，在施用后，B细胞的产生在约第3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或60日出现，随后在约第10、20、30、60或90日产生IgG抗体和IgM抗体并且随后在约第24、30、40、50、60、90、120、150或180日产生T细胞。本发明的疫苗组合物潜在地提供可能防止少量癌细胞生长的长期免疫保护作用，因而理想用于最小残留病情，从而实现疾病稳定和存活改善。

“抗体依赖的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后造成靶细胞的裂解。在一个实施方案中，这类细胞是人细胞。尽管不希望受限于任何特定作用机制，介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，表达FcγRIII，而单核细胞表达FCγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估某分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那种。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型(如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),95:652-656(1998)公开中的那种动物模型)中评估本发明治疗性缀合物的ADCC活性。

“补体依赖细胞毒性”或“CDC”指启动补体激活并在补体存在下溶解靶的分子。补体激活途径始于补体系统的第一组分(C1q)与复合于同族抗原的分子(例如，抗体)的结合。为评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santaro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。

在另一个实施方案中，当施用至患者时，含有本发明治疗性缀合物的治疗性组合物能够在患者/受试者中诱导抗Globo H免疫血清的产生，所述免疫血清与Globo H阳性癌细胞系(例如，MCF-7细胞特异性结合)。

组合

治疗性组合物可以包括其他抗癌症/抗增殖性药物以及佐剂和其他免疫调节分子如细胞因子或趋化因子。这些药物均可以在试剂盒中一起在独立容器或单个容器中递送。所述药物可以在施用时或在施用前的至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24分钟、小时或天合并。

佐剂是调节其他药物之效果的药理学或免疫学物质。它们可以是增强针对给定抗原的免疫反应的无机或有机化学物、大分子或完整癌细胞或其部分。佐剂包括弗氏完全和弗氏不完全佐剂、Toll样受体分子和其拟似物、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛、双链RNA、非甲基化CpG岛、左旋咪唑、卡介菌(bacillus calmette-guerin)、奥曲肽、异丙肌苷和Zadaxin、由细菌和病毒经典释放的多种形式的DNA和RNA、PD-1拮抗剂和CTLA拮抗剂。在一个实施方案中，佐剂是皂素佐剂。

在某些实施方案中，皂素佐剂是OPT-821皂素，其是基本上纯的。在其他实施方案中，OPT-821皂素是其生物活性片段。佐剂还可以涵盖不纯形式的OPT-821皂素。与本文所述的疫苗一起施用或与其他基本上纯的皂素或非皂素佐剂混合时，纯化的OPT-821皂素显示出增强的佐剂效果。

OPT-821皂素是例如美国专利号5057540和美国专利号6524584中所述，通过高压液相色谱(HPLC)、低压液态硅胶层析和亲水互作色谱(HILIC)以高纯度从提取皂树(Quillaja saponaria Molina)提取的天然存在的糖苷，所述专利的内容通过参考的方式完整并入。高压液相色谱分析显示OPT-821是结构上相关的异构化合物的混合物。已经鉴定并且在本文公开了OPT-821皂素的纯化的不同异构化合物。

在某些实施方案中，OPT-821皂素包含如下的至少一种分离的式I化合物：

其中

R¹是β-D-芹菜糖或β-D-木糖；和

R²和R³独立地是H、烷基

(化合物1989的脂酰基部分)，或

(化合物1857的脂酰基部分)。

OPT-821皂素还可以包含分离的式I化合物，其中

(i)R¹是β-D-芹菜糖，R²是上述1989化合物的脂酰基部分，并且R³是H(1989化合物V1A)；

(ii)R1是β-D-芹菜糖，R²是H，并且R³是上述1989化合物的脂酰基部分(1989化合物V1B)；

(iii)R¹是β-D-木糖，R²是上述1989化合物的脂酰基部分，并且R³是H(1989化合物V2A)；或

(iv)R¹是β-D-木糖，R²是H，并且R³是上述1989化合物的脂酰基部分(1989化合物V2B)。总体上，1989化合物V1A、1989化合物V1B、1989化合物V2A和1989化合物V2B称作“1989化合物混合物”。

表1总结了1989化合物的官能团和1857化合物混合物中每种1857化合物的摩尔％。

表1

OPT-821皂素可以包含分离的式I化合物，其中

(i)R¹是β-D-芹菜糖，R²是上述1857化合物的脂酰基部分，并且R³是H(1857化合物V1A)；

(ii)R¹是β-D-芹菜糖，R²是H，并且R³是上述1857化合物的脂酰基部分(1857化合物V1B)；

(iii)R¹是β-D-木糖，R²是上述1857化合物的脂酰基部分，并且R³是H(1857化合物V2A)；或

(iv)R¹是β-D-木糖，R²是H，并且R³是上述1857化合物的脂酰基部分(1857化合物V2B)。总体上，1857化合物V1A、1857化合物V1B、1857化合物V2A和1857化合物V2B称作“1857化合物混合物”。

表2总结了1857化合物的官能团和1857化合物混合物中每种1857化合物的摩尔％。HPLC

表2

OPT-821皂素包含以下一种或多种化合物：

(i)1857化合物V1A；(ii)1857化合物V1B；

(ii)1857化合物V2A；

(iii)1857化合物V2B；

(iv)1989化合物V1A；

(v)1989化合物V1B；

(vi)1989化合物V2A；或

(vii)1989化合物V2B。

OPT-821皂素中1857化合物混合物和1989化合物混合物的百分数可以如下：

(i)约1摩尔％至约15摩尔％的包含1857化合物混合物的OPT-821；和

(ii)约85摩尔％至约99摩尔％的包含1989化合物混合物的OPT-821。

全部摩尔％可以按0.1％增量变动(例如约87％至约90％、约90.5％至约97％、约3.5％至约11％、约10％至约14％)。

1989化合物混合物可以包含约60-70摩尔％的1989化合物V1A；约1-5摩尔％的1989化合物V1B；约30-40摩尔％的1989化合物V2A；和约0.1-3摩尔％的1989化合物V2B。全部摩尔％可以按0.1增量变动(例如65％、2.5％、35.6％)。

1857化合物混合物可以包含约60-70摩尔％的1857化合物V1A；约1-5摩尔％的1857化合物V1B；约30-40摩尔％的1857化合物V2A；和约0.1-3摩尔％的1857化合物V2B。全部摩尔％可以按0.1增量变动(例如65％、2.5％、35.6％)。

在另一个实施方案中，基本上纯的OPT-821从皂树(Quillaja saponaria)粗提物纯化，其中在反相-HPLC的对称性C18柱上分析时，所述OPT-821以占据层析图全部峰(不包括溶剂峰)的总面积90％或更大的单个优势峰为特征，所述对称性C18柱具有5μm粒度，孔，4.6mm IDx25cm L，其中洗脱程序包含在11分钟内流动相A:B 95％:5％至75％:25％，所述流动相A是含0.1％三氟乙酸的蒸馏水并且流动相B是流速1ml/分钟的含0.1％三氟乙酸的乙腈。

在一个实施方案中，药物组合物包含式(I)的化合物

其中，

R¹是β-D-芹菜糖或β-D-木糖；和

R²和R³独立地是H、烷基或

(化合物1857的脂酰基部分)。

和可药用载体。

疫苗可以包含糖抗原或其免疫原性片段和OPT-821皂素。在又一个实施方案中，疫苗包含糖抗原或其免疫原性片段；载体蛋白和OPT-821皂素。在另一个实施方案中，疫苗包含选自Globo H、KLH和OPT-821皂素的糖抗原。载体蛋白的非限制性例子包括KLH。

如本文所用，术语“细胞因子”指众多分泌型小蛋白的任一种，所述分泌型小蛋白通过影响免疫细胞分化过程调节免疫反应的强度和持续时间，所述免疫细胞分化过程通常涉及前体细胞藉此变成不同特化细胞类型的基因表达变化。细胞因子已经基于它们的假定功能、分泌细胞或作用靶，各自命名为淋巴因子、白介素和趋化因子。例如，一些常见的白介素包括但不限于IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF和TGF-β。

如本文所用，术语“趋化因子”指在感染部位释放的提供于淋巴细胞动员和活化手段的多种小型趋化性细胞因子的任一种。趋化因子吸引白细胞至感染部位。趋化因子具有允许将其划分成四个组的保守半胱氨酸残基。这些组，连同代表性趋化因子，是C-C趋化因子(RANTES、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β)、C-X-C趋化因子(IL-8)、C趋化因子(淋巴细胞趋化因子)和CXXXC趋化因子(分形素)。

本发明的治疗性组合物还可以包含PD-1/PD-L1抑制剂(细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫治疗药)、CTLA-4免疫治疗药、CDK4/6抑制剂(靶向治疗药)、PI3K抑制剂(靶向治疗药)、mTOR抑制剂(靶向治疗药)、AKT抑制剂(靶向治疗药)、泛Her抑制剂(靶向治疗药)。也可以修饰这些抑制剂以产生相应的单克隆抗体。这类抗体可以包含于本发明的治疗性组合物中。

治疗性组合物可以包括其他抗癌药/抗增殖药或化疗药。在一些实施方案中，这类药物的例子存在于V.T.Devita和S.Hellman(编者)的Cancer Principles and Practiceof Oncology,第6版(2001年2月15日),Lippincott Williams & Wilkins Publishers中。这类抗癌药包括但不限于以下：激素治疗药(例如，选择性雌激素受体调节物、雄激素受体调节物)、单克隆抗体治疗药、化疗药、类视黄醇受体调节物、细胞毒/细胞抑制药物、抗肿瘤药、抗增殖药、异戊烯基-蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲类、血管生成抑制剂(例如，贝伐珠单抗)、细胞增殖和存活信号传导途径抑制剂、凋亡诱导剂、干扰细胞周期检查点的药物、干扰受体酪氨酸激酶的药物(RTK)、雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)抑制剂、人表皮生长因子受体2(HER2)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、整联蛋白阻断剂、NSAID、PPAR激动剂、内在多药耐药(MDR)抑制剂、镇吐药、可用于治疗贫血的药物、可用于治疗中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药物、二膦酸盐类、芳香酶抑制剂、诱导肿瘤细胞终末分化的药物、γ-分泌酶抑制剂、癌症疫苗及其任意组合。

本发明的制剂

治疗性组合物(本文也称作药物组合物)通常包含可药用载体。如本文所用，语言“可药用载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可以并入组合物中。将药物组合物配制以与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外施用，例如，静脉内，皮内、皮下、肌内、动脉内、口服(例如，吸入)、透皮(局部用)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液剂或混悬剂可以包含以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；络合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱，如氢氯酸或氢氧化钠调节。可以将肠胃外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液剂(其为水溶性)或用于现场制备无菌注射溶液剂或分散剂的分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在全部情况下，组合物应当是无菌的并且应当保持流动至存在容易可注射性(easy syringability)的程度。它应当在制造和储存条件下稳定并且应当针对微生物(如细菌和真菌)的污染作用受到保护。载体可以是溶剂或分散介质，其例如包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和合适的其混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现阻止微生物的作用。在许多情况下，将优选在组成上包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的吸收延长。

可以通过将活性化合物以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在合适的溶剂中并入，根据需要，随后过滤除菌，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液剂的无菌粉末情况下，制备方法包括从其先前无菌过滤的溶液产生有效成分的粉末外加任何额外所需成分的真空干燥法和冷冻干燥法。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗性施用的目的，活性化合物可以随赋形剂一起掺入并且以片剂、药锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊剂)形式提供。也可以使用流体载体制备口服组合物用作漱口剂。可以包含药物相容的粘合剂或辅助材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、药锭剂等可以含有以下成分或具有相似性质的化合物的任一种：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterote；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味矫味剂。

对于通过吸入施用，这些化合物可以按气溶胶喷雾剂的形式从含有合适推进剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或分配器或雾化器递送。

全身性施用也可以是经粘膜或经皮施用。对于透粘膜或经皮施用，制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于透粘膜施用，包括去垢剂、胆盐和夫西地酸衍生物。透黏膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂，如本领域公知。还可以将化合物以栓剂(例如，用常规的栓剂基料如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂形式配制用于直肠递送。

根据实施方案，将活性化合物随将会保护化合物避免从身体快速消除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法将是本领域技术人员显而易见的。这些材料也可以是商业获得的。脂质体悬液(包含以针对细胞特异抗原单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。这些悬液可以根据本领域技术人员已知(例如，如美国专利号4,522,811中所述)的方法制备，所述专利通过引用的方式并入本文。

有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗效果。

剂型

可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定这类治疗组合物的毒性和治疗功效，例如，确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且它可以表述为LD₅₀/ED₅₀比。优选显示高治疗指数的治疗性组合物。尽管可以使用显示出毒性副作用的化合物，但是应当谨慎设计导引这类化合物至患病位置部位的递送系统，以最小化对未感染细胞的可能损伤并因而减少副作用。

从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制用于人类中的剂量范围时使用。这类化合物的剂量优选地位于毒性低或无毒性情况下包括ED₅₀的一系列循环浓度范围内。该剂量可以根据所用的剂型和所用的施用途径在这个范围内部变动。对于用于本公开方法中的任何化合物，可以从细胞培养测定法初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制某剂量以实现包括IC₅₀(即，实现症状的半数最大抑制作用的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中所确定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱测量。

在一些实施方案中，治疗性组合物的治疗有效量(即，有效剂量)可以是约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg，或0.1μg/kg至1g/kg或大约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225或250克或微克/千克患者体重，或将显而易见并且由技术人员在无需过多实验的情况下理解的其他范围。技术人员将理解，某些因素可能影响为有效治疗受试者所要求的剂量和时程，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的总体健康或年龄和存在的其他疾病。

在其他实施方案中，治疗性组合物中的Globo-H部分的治疗有效量(即，有效剂量)可以是约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg或0.1μg/kg至1g/kg或大约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225或250克或微克/千克患者体重，或将显而易见并且由技术人员在无需过多实验的情况下理解的其他范围。技术人员将理解，某些因素可能影响为有效治疗受试者所要求的剂量和时程，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的总体健康或年龄和存在的其他疾病。

在某些实施方案中，本文公开的治疗性组合物含有至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体或与之结合，因而每种至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体在单次给药时按以下大约、至少或更大的浓度存在：各自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99倍于每剂量10^-9、10^-8、10^-7、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1摩尔。优选地，治疗性缀合物在单次给药时按约1-100、2-60、3-50、4-40、5-30、6-20、7-15、8-10、2-18、3-16、4-14、5-12、6-10或7-8μM之间的浓度存在。

在一些实施方案中，本文公开的治疗性组合物含有至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体或与之结合，因而每种至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体在单次给药时按以下大约、至少或更大的浓度存在：各自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99倍于10^-3、10^-2、10^-1或10微克。在某些实施方案中，每剂量包含大约或至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150微克或更高的一种治疗性缀合物或治疗性抗体。

在某些实施方案中，本文公开的治疗性组合物以每日、每周或每月大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次或更多次的剂量经大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天、周、月或年或更长时间的时间段施用。

试剂盒

根据另一个方面，一个或多个组分试剂盒可以由本领域技术人员构思，所述组分试剂盒将实施本文中公开的至少一种方法，该组分试剂盒包含一种或多种治疗性缀合物、抗癌药/抗增生药、佐剂、细胞因子和/或趋化因子。根据上文提到的至少一种方法，治疗性组合物单独或组合地包含有效量的在本文公开的治疗性组合物。前述药物可以在试剂盒中存在于单个容器中或不同容器中。

试剂盒可能还包含生物学事件的鉴定物或由技术人员在阅读本公开时可辨认的其他化合物。试剂盒还可以包含至少一种组合物，所述组合物包含有效量的在本文公开的治疗性组合物。试剂盒的治疗性组合物将实施根据本领域技术人员可辨认的程序在本文中公开的至少一种方法。

公开内容还包括利用本文公开的治疗性组合物治疗增生性疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法涉及治疗癌症，例如，乳腺癌。所述方法通常涉及向有需要的患者以有效治疗增殖性病症的量提供本文公开的治疗性组合物。

在一些实施方案中，将本发明的治疗性组合物以下述方法施用至有需求的受试者(例如，患有癌症如乳腺癌的受试者)，所述方法平均延长无病情进展生存期或总生存期超过对照安慰剂(例如磷酸盐缓冲盐水安慰剂)大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、周、月或年。

在一些实施方案中，在不可接受毒性或疾病进展不存在的情况下在第0-2、第6、第14和第26周皮下给予治疗性组合物。

在一些实施方案中，将本发明的治疗性组合物以下述方法施用至有需求的受试者(例如，患有癌症如乳腺癌的受试者)，其中相对于对照安慰剂例如磷酸盐缓冲盐水安慰剂，所述方法平均在患者中经1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、周、月或年的时间缩减肿瘤体体积大约或至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、74％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

在一些实施方案中，肿瘤体积可以精确测量按至少一种尺度(将记录测量平面中的最长直径)，其中CT扫描的最小尺寸是10mm(CT扫描切片厚度推荐在2.5mm和5mm之间)。

合成本发明组合物的方法

本发明治疗性组合物的Globo H六糖部分作为烯丙基糖苷化学合成并且随后制备用于与KLH缀合。

在一个示意性实施方案中，Globo H的化学合成涉及以下一般步骤：

将KLH用水质缓冲液中的2-亚氨基硫杂环戊烷处理。随后通过Sephadex G-15柱大小排阻柱，将硫羟化KLH与未反应的2-亚氨基硫杂环戊烷分离。硫羟化KLH储存在惰性气体(氮或氩)气氛下并立即用于与Globo HMMCCH缀合。

实施例

实施例1：制备本发明的糖缀合物(Globo H-KLH)

通过臭氧分解作用，将Globo H烯丙基糖苷(市售)转化成一种醛。Globo H醛与M₂C₂H(接头)和NaCNBH₃反应以产生Globo>

实施例2：糖缀合物中Globo H对KLH的重量比分析

通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)证实如上文制备的糖缀合物中Globo H对KLH的重量比。表3中显示结果。

表3：糖缀合物中Globo H与KLH的重量比

实施例3：糖缀合物中Globo H对KLH的表位比率分析

KLH二十聚体(天然聚集的形式)的分子量是大约7.5MDa至8.6MDa，如文献如Micron 30(1999)597-623中所述。通过大小排阻层析和多角度激光散射光谱测定法(MALS)证实天然KLH，其具有约8.6MDa的分子量(参见图3和图4)。通过大小排阻层析分析本发明的糖缀合物(第5号样品，Globo H对KLH的重量比是0.17:1)。结果显示，与天然聚集的KLH二十聚体相比，本发明的糖缀合物显示分子量减少。参见图4。随后如表4中那样计算分子比率。

表4：计算Globo H对KLH的分子比率

*上述分子比率基于如下的公式计算：

**KLH的分子量取决于单体、二聚体或二十聚体的形式

鉴于上文，得出结论：在本发明的糖缀合物中，KLH单体亚单位在缀合至Globo H后形成单体、二聚体和/或三聚体。

实施例4：疫苗组合物的制备和在大鼠中免疫

将如实施例1中制备的糖缀合物(Globo H-KLH)的不同样品储存在4℃，并且在层流柜下与皂素佐剂混合。将所得到的疫苗组合物置于冰上并且转运至动物设施以后续免疫。

三组Lewis大鼠用如表5中所示的多种疫苗组合物免疫。

表5：免疫大鼠的分组

*GH：KLH＝0.17：1(w/w)

GH：Globo H

SC：皮下

PBS：磷酸盐缓冲盐水

大鼠在第0、第7、第14日和第21日免疫。在第0、第3、第10、第17、第24日和第31日采集外周血单核细胞(PBMC)和血浆。在第31日收获脾、淋巴结和腹膜洗液。

实施例5：用于大鼠中体液及细胞免疫反应诱导的测定法

实施例5.1通过流式细胞术分析免疫效应细胞亚群

从动物分离外周血单核细胞(PBMC并且随后使用针对不同细胞标志物的特异性抗体，通过流式细胞术鉴定PBMC中的各种免疫效应细胞亚群。在第0、第3、第10、第17、第24日和第31日从免疫大鼠分离的PBMC用不同荧光(FITC)-缀合物抗体染色并置于冰上30分钟。在温育后，将细胞用洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(UniRegion Biotech)中的1％牛血清白蛋白(Sigma)和0.1％NaN₃(Sigma))洗涤并以350g离心5分钟。将细胞重悬于洗涤缓冲液中以通过FACS>3+T细胞、CD4⁺T细胞和CD8+T细胞在第24日出现。参见图5(A)-(D)。

实施例5.2通过ELISA检验Globo H-特异性抗体

通过ELISA测定法确定来自免疫大鼠的血浆中Globo H-特异性抗体的产生。结果显示在免疫后，Globo H-特异性IgG的滴度在第10日开始上升并且在第17日达到峰值。观察到相似的Globo H-特异性IgM抗体产生样式。参见图5(A)-(B)。在用PBS或KLH仅外加佐剂处理的大鼠中不存在Globo H-特异性IgG抗体和IgM抗体反应(数据未显示)。

总之，在免疫大鼠中，B细胞的产生在第3日出现，随后产生针对Globo H的IgM抗体和IgG抗体，所述抗体在第10日出现，并且接着是在第24日出现的CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。本发明的糖缀合物(Globo>

实施例6：小鼠中的免疫和通过ELISA检验抗体

将糖缀合物(Globo H-KLH)的不同样品储存在4℃，并且在层流柜下与皂素佐剂混合。将所得到的疫苗组合物置于冰上并且转运至动物设施以后续免疫。

通过皮下注射，对大约8周龄的Balb/c小鼠给予糖对蛋白质(Globo H:KLH)不同比率的Globo H-KLH，每周一次持续4周(第0、第7、第14日和第21日)。免疫前或第0日及在每次接种(第10、第17和第24日)后3日，在无抗凝血药情况下通过眶后静脉或面静脉采集血液样品。随后将样品离心以分离血清和红细胞。采集血清并贮存在-20℃，所述血清随后通过ELISA分析。Mann-Whitneyt检验用于统计分析。

如图6中所示，已经显示与PBS对照组相比，与皂素佐剂组合的本发明糖缀合物(Globo H-KLH)在动物模型中显著地诱导Globo H-特异性IgM抗体反应。具体而言，重量比0.17:1(Globo H:KLH)的糖缀合物比重量比0.07:1(Globo H:KLH)的糖缀合物诱导更好的抗体滴度。

总之，已经显示与适宜佐剂组合的本发明糖缀合物(Globo H-KLH)在动物模型中诱导出乎意料优越的体液免疫反应和细胞免疫反应，尤其诱导在癌症免疫疗法中重要的B细胞和T细胞(包括CTL)扩充以及IgM和IgG反应。

实施例7：小鼠中伴有或没有佐剂的Globo H-KLH疫苗的免疫原性研究

已经研究与佐剂配对时本发明Globo H组合物在小鼠中激发免疫反应的能力。通过ELISA和FACS，将免疫疗法诱导的Globo-H特异性抗体的量定量。

各组6周龄雌性C57BL/6小鼠用Globo H-KLH和佐剂皮下免疫。Globo H-KLH剂量水平等同于Globo H-KLH中Globo-H的量(以μg计)。每一注射含有一系列剂量等同于Globo H-KLH中的0.6μg至5.0μg Globo-H和20μg佐剂。免疫第0、第8和第14日进行，并且在第0日(注射前)和第24日采集血清以由ELISA和FACS进行对比分析。通过ELISA测量血液学反应以确定针对Globo H神经酰胺的抗体的滴度并通过FACS确定针对Globo H阳性MCF-7细胞的细胞表面反应性。

在整个免疫期间，接种后不存在明显的行为、食欲，总体外观和梳理习性变化。第三次免疫后10天，采集血清以通过ELISA确定IgG和IgM抗Globo H抗体的滴度，使用≥8倍处理前值的滴度作为阳性反应的标准。如图2中所示，在用单一Globo H、Globo H KLH缀合物或单一佐剂处理的小鼠中不存在反应。与之相反，14/15用Globo H-KLH+佐剂处理的小鼠以明显的IgG抗Globo H滴度作出反应，所述滴度在0.6至5μg的Globo H-KLH剂量不呈剂量依赖性。每种剂量的平均IgG滴度相比处理前值增加13至17.5倍。关于IgM抗Globo H，在用佐剂+Globo H-KLH免疫后，15只小鼠中有一只显示滴度增长8倍。但是，5/15具有≥4倍免疫前血清的IgM滴度并且总计6/15具有≥2倍的滴度。每种剂量的平均IgM滴度相比处理前值增加2.5倍。

在1:25血清稀释度，通过FACS分析测定免疫血清与表达Globo H的乳腺癌细胞MCF-7系结合的能力。这个测定法中高于处理前值30％的处理后值(即≥1.3倍增加)视为阳性。如图3中所示，来自全部佐剂+Globo H-KLH处理组的免疫血清均含有与MCF-7细胞反应的IgM抗体，所述反应高于处理前基线5-6倍。另外，来自3/5用0.6μg或2μg Globo H-KLH+佐剂处理的小鼠和来自2/5用5μg Globo H-KLH+佐剂处理的小鼠的免疫血清显示可以与MCF-7细胞结合的IgG抗体。平均结合能力超过处理前基线增加1.3至2.0倍。

已经显示用Globo H-KLH和佐剂接种在雌性C57BL/6小鼠中激发IgG抗Globo H反应和IgM抗Globo H反应。免疫血清具有结合表达Globo H的乳腺癌MCF-7细胞的能力。

实施例8：KLH上Globo-H缀合位点的LC-MS/MS分析

使用多酶消化和LC-MS/MS在四份KLH样品中鉴定Globo H缀合位点。将这四份Globo H-缀合物KLH样品首先用4种不同酶消化并且随后通过LC-MS/MS和Mascot数据库检索分析。鉴定到两种类型的衍生物：Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)和MMCCH衍生物(单独的MMCCH)。考虑Globo H衍生物及其中性丢失形式用于Globo H缀合位点鉴定。考虑MMCCH形成和其脱酰胺形式用于MMCCH缀合位点鉴定。仅考虑具有高质量MS/MS谱和高Mascot评分的那些肽。对于Globo H缀合分析，从OPT-822-13001-DP(样品1)的两次重复LC-MS/MS分析观察到31个和28个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13002-DP(样品2)的两次重复LC-MS/MS分析观察到19个和21个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13003-DP(样品3)的两次重复LC-MS/MS分析观察到10个和11个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13004-DS(样品4)的两次重复LC-MS/MS分析观察到18个和19个缀合的赖氨酸。对于MMCCH缀合分析，从OPT-822-13001-DP(样品1)的两次重复LC-MS/MS分析找到155个和141个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13002-DP(样品2)的两次重复LC-MS/MS分析找到143个和137个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13003-DP(样品3)的两次重复LC-MS/MS分析找到147个和143个缀合的赖氨酸；从OPT-822-13004-DS(样品4)的两次重复LC-MS/MS分析找到140个和136个缀合的赖氨酸。

实施例8材料和方法：

这个章节中的缩写如下：K＝赖氨酸；LC-MS/MS＝液相色谱-串联质谱法；DTT＝二硫苏糖醇；IAM＝碘乙酰胺；ACN＝乙腈；FA＝甲酸；Glu-C＝蛋白内切酶Glu-C；ABC＝碳酸氢铵；RT＝室温；MW＝分子量。

首先处理4份KLH样品，样品1-4，以将缓冲液过100kDa截值Amicon Ultra离心滤器交换成50mM碳酸氢铵缓冲溶液并用6M脲变性。样品随后在37℃用10mM DTT还原1小时，使用50mM IAM在室温暗处烷基化30分钟并在室温用50mM DTT猝灭5分钟。将所产生的蛋白质稀释直至脲浓度是1M并如下章节中所述用不同酶进行溶液中消化。

采用不同酶的溶液中消化用以下消化条件进行：(1)在37℃胰蛋白酶消化24小时(蛋白质:酶＝40:1)；(2)在37℃Glu-C消化24小时(蛋白质:酶25:1)；(3)在室温胰凝乳蛋白酶消化24小时(蛋白质:酶＝25:1)；(4)在37℃嗜热菌蛋白酶消化24小时(蛋白质:酶＝25:1)。

通过添加甲酸终止消化反应并且全部4份消化的样品均进行LC-MS/MS分析。

用Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)偶联于Ultimate 3000RSLC系统(Dionex)分析样品。使用C18柱(Acclaim PepMap RSLC，75μmx150mm，2μm，)连同下文显示的梯度，进行LC分离：

时间(分钟)A％B％流量(μl/分钟)09910.2559910.253599100.256765350.257715850.25829910.25909910.25

流动相A：5％CAN/0.1％FA

流动相B：95％ACN/0.1％FA

源内CID设定在45eV。用m/z 350-2000的范围进行完整MS扫描，并且来自MS扫描的强度最大的10种离子片段化用于MS/MS谱。原始数据由Proteome Discoverer 1.4处理成峰列表用于Mascot数据库检索。

用Mascot 2.4.1版和Thermo Proteome Discoverer 1.4版针对KLH1和KLH2[KLH1，EMBL登录号CAG28307.1；KLH2，EMBL登录号CAG28308.1]进行数据库检索。所用参数如下：酶：根据消化方法为胰蛋白酶、Glu-C、胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶；固定的修饰：脲甲基(C)。

MMCCH衍生物的可变修饰(单独的MMCCH)：脱酰胺(NQ)、氧化(M)、dK_MMCCH-1(K)，dK_MMCCH-2(K)。

Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)的可变修饰：脱酰胺(NQ)，氧化(M)，Globo_H_MMCCH(K)，dK_MMCCH_NL997(K)，dK_MMCCH_NL835(K)，dK_MMCCH_NL673(K)，dK_MMCCH_NL511(K)，dK_MMCCH_NL308(K)，脱酰胺(NQ)，氧化(M)，肽质量公差：±10ppm；片段质量公差：±0.05Da；最大错过切割：5；仪器类型：ESI-TRAP；离子截值评分：13。

检索参数中的“dK_MMCCH-1”表示MW增加352.1569Da的MMCCH-缀合的赖氨酸。

检索参数中的“dK_MMCCH-2”表示MW增加338.1300Da的MMCCH-缀合的赖氨酸的脱酰胺形式。

检索参数中的“Globo_H_MMCCH(K)”表示MW增加1393.5317Da的Globo H-缀合的赖氨酸。

检索参数中的“dK_MMCCH_NL997”表示MW增加396.1831Da的Globo H-缀合的赖氨酸的中性丢失形式。

检索参数中的“dK_MMCCH_NL835”表示MW增加558.2360Da的Globo H-缀合的赖氨酸的中性丢失形式。

检索参数中的“dK_MMCCH_NL873”表示MW增加720.2888Da的Globo H-缀合的赖氨酸的中性丢失形式。

检索参数中的“dK_MMCCH_NL511”表示MW增加882.3416Da的Globo H-缀合的赖氨酸的中性丢失形式。

检索参数中的“dK_MMCCH_NL308”表示MW增加1085.4210Da的Globo H-缀合的赖氨酸的中性丢失形式。

“MW增加”表示与完整的赖氨酸残基相比分子量增加。

实施例8：结果

基于LC-MS/MS的技术是鉴定蛋白质和表征氨基酸修饰的工具。可以通过MS/MS谱提供的片段离子的归属获得关于肽序列和修饰位点的详细信息。Mascot是搜索引擎并且其基于概率的评分算法已经充分接受。在这项研究中采用Mascot评分作为蛋白质测序和Globo H或MMCCH缀合位点鉴定的可信度参比。为了充分分析样品1-4中Globo H或MMCCH缀合位点的分布，将这些样品用多种酶消化，随后进行LC-MS/MS分析。

图33A中显示Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)的预期化学结构，并且可以在这些结果当中观察到含有赖氨酸的肽上的相应MW增加1393.53Da。此外，不稳定的多糖倾向于在LC-MS分析中电喷雾电离期间借助中性丢失而脱落。因此，也可以对糖缀合物肽观察因中性丢失所致的396.18Da、558.24Da、720.29Da、882.34Da和1085.42Da的分子量增加，如图33B中所示。为了鉴定Globo H缀合位点，考虑全部衍生化形式。

此外，在这些Globo H缀合的KLH样品中还观察(单独的MMCCH)到MMCCH衍生物。图34A和图34B中显示MMCCH衍生物和其脱酰胺形式的预期化学结构，并且可以在这些结果当中观察到含有赖氨酸的肽上的相应MW分别增加352.16Da和338.13Da。为了鉴定MMCCH缀合位点，考虑两种衍生化形式。不清楚从Globo H衍生物至MMCCH的转化，但是假定它在样品处理期间发生。

使用前体离子的质量准确度±10ppm和片段离子的质量准确度±0.05Da作为鉴定蛋白质和解释波谱的标准。选择Globo H衍生物以及其中性丢失形式作为Globo H缀合位点鉴定的可变修饰，并且选择MMCCH衍生物以及其脱酰胺形式作为MMCCH缀合位点鉴定的可变修饰。对赞助商提供的KLH1和KLH2的序列进行数据库检索。报告中仅列出具有高质量MS/MS谱(离子评分≥13，p<0.05)的那些肽。

为了展示可重复结果，将LC-MS/MS分析进行2次，随后对Globo H缀合位点鉴定结果和MMCCH缀合位点鉴定结果进行独立Mascot数据库检索，如图17中所总结。

在Globo H缀合位点分析中，在样品1的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到31个和28个赖氨酸；在样品2的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到19个和21个赖氨酸；在样品3的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到10个和11个赖氨酸；在样品4的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到18个和19个赖氨酸。图14-21中列出鉴定细节。在MMCCH缀合位点分析中，在样品1的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到155个和141个赖氨酸；在样品2的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到143个和137个赖氨酸；在样品3的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到147个和143个赖氨酸；在样品4的第一LC-MS/MS和第二LC-MS/MS分别找到140个和136个赖氨酸。图22-29中列出鉴定细节。

图30中总结了来自多酶实验的Globo H缀合位点并且图31中总结了MMCCH缀合位点。图32中总结Globo H缀合的样品缀合位点分析总体结果。

实施例8结论：

Globo H衍生性缀合肽的质谱测量信号低于MMCCH缀合肽的那些信号，原因在于多个中性丢失形式和多糖的电离效率较低，这使得直接鉴定Globo H缀合作用更困难。这是为何对于MMCCH缀合分析而言，鉴定的肽的数目较高的原因。因此，MMCCH结果可以用来代表Globo H缀合作用。

缀合位点分析表明，对于样品1-4，KLH1/KLH2中的总共306个赖氨酸残基当中分别存在155、143、147和140个赖氨酸缀合位点。在重复分析中，分别鉴定到样品1-4的141、137、143和136个缀合位点。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语及任何首字母缩略词均具有如本发明领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何组合物、方法、试剂盒和手段可以用来实施本发明，但是本文中描述了优选的组合物、方法、试剂盒和手段。

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