免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法

摘要

本发明提供一种免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法：以副溶血性弧菌为模板，克隆Vp种特异性toxR

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是革兰氏阴性的嗜盐弧菌，广泛分布于港口、海水沿岸、海河交界处等，主要通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎及旅行者急性腹泻、伤口感染和败血症。近几年来，食用海产品的人群在不断扩增，越来越多的人开始追求一些海鲜刺身。国家食源性疾病监测网数据显示我国微生物性食物中毒的病原分布发生显著变化，特别是在沿海省份，副溶血性弧菌引起的食物中毒发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已高居微生物食物性中毒首位。副溶血性弧菌同时也能感染鱼、虾、蟹类以及甲壳类等多种水产动物，对养殖业造成不利。目前，美国和欧盟对进口水产品都强制性要求进行副溶血性弧菌的检测，检测结果为阴性方可通关。

副溶血性弧菌致病性机理较复杂，其致病因子有溶血性毒素、尿素酶、粘附因子和侵袭力。副溶血性弧菌的跨膜转录调控蛋白toxR参与调控主要毒力基因和外膜蛋白的表达，由toxR基因编码，是弧菌科种间鉴定的良好分子靶标，toxR基因可在种的水平上检测副溶血性弧菌。

副溶血性弧菌滋生速度快，尤其在每年的5月-8月，更容易引发大面积的细菌性食物中毒事件，Vp的快速检测技术显得尤为重要。目前，我国副溶血性弧菌的传统检测手段以微生物培养法为主，全程大概需要5-8天，操作繁琐耗时，已不能够满足人们对食品安全检测的快速简便的要求。所以，迫切需要研发出灵敏度更高、特异性更强、快速简便的检测手段，来监控食源性致病菌，以保障人们的食品安全。

技术的不断进步推动检测方法的发展，目前已经有越来越多的方法用于快速检测副溶血性弧菌，如PCR技术、酶联免疫吸附法(enzyme-labeled immunosorbent assay，ELISA)、实时定量荧光PCR法(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)以及环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。

PCR技术通过特异性扩增可在短时间内放大检测目标，具有灵敏度高的特点，但是PCR检测操作过程的要求高且易出现假阳性。ELISA法利用抗原-抗体的特异性结合检测致病菌，对设备的要求较低，但灵敏度相对而言较低，在食品安全微生物检验中应用并不广泛。FQ-PCR能定性检测和定量分析靶分子，但在试剂和仪器费用方面价格不菲。此外，以上的检测方法均需要操作人员具有熟练的操作技巧和一定的专业水准，因此，昂贵的仪器设备、较高的检测费用和严格的技术要求限制了这些技术的现场快速检测和基层普及应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是2000年日本学者Notomi等建立的核酸等温扩增技术，是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，使LAMP反应具有极高的扩增特异性，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件(约65℃)保温约60min，即可完成目的基因扩增反应，从而克服了PCR反应需要反复的热变性获得单链模板的缺点，避免反复升降温的耗时过程，具有简单、快速、特异性强、敏感性高的特点，而且LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有利于在一些基层机构和现场检测的应用。

LAMP技术作为一个新兴的快速检测技术具有耗时短、费用低、高灵敏性、高特异性等特点，易于在一些基层机构推广，特别适用于现场的快速检测，有着极为广泛的应用前景。但是，在实际使用过程中，我们发现LAMP法检测副溶血性弧菌仍然存在一些不足。首先，和大多数检测方法类似，LAMP法首先要选择性增菌培养。通常这一步需要耗时一天，既不利于样品的现场检测，也有可能引入新的污染。其次，尽管副溶血性弧菌的LAMP法检测快速灵敏简便，但待检样品在增菌培养过程中或者在抽提DNA时可能受到Vp污染，或者待检样品中存在与靶标DNA序列同源性很高的污染物，从而导致假阳性。

发明内容

本发明基于细菌往往为单拷贝基因组，如果以DNA进行检测，现场获取的Vp可能太少不足以检出DNA，但是，细菌基因的表达产物，如蛋白质，是多拷贝的，可以是几个、几十个或者几百上千个拷贝，提出通过免疫磁珠技术捕获特异蛋白分子再进行放大后检测，从而避免增菌培养的环节，缩短检测时间，便于现场操作；其次通过人工合成的靶标DNA进行检测以降低LAMP法检出的假阳性率。

本发明提出的抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌主要思路是：首先制备副溶血性弧菌特有的靶标蛋白抗原：跨膜转录调控蛋白toxR；针对toxR制备抗体；将免疫磁珠的表面包被上特异性抗体，制备抗体偶联的磁珠从而捕获待检样品中副溶血性弧菌的靶标蛋白；制备抗体-人工合成的靶标DNA偶联物，将该抗体-人工合成的靶标DNA偶联物附着上去；优化LAMP反应体系进行特异扩增以达到放大靶标的作用，缩短检测时间，提高检测的特异性(如图1所示)。

本发明免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)的方法，具体包括以下步骤：

S1：以副溶血性弧菌为模板，克隆Vp种特异性toxR_28-534基因，原核表达并纯化跨膜转录调控蛋白toxR_28-534；

S2：通过免疫大白兔制备针对toxR_28-534蛋白的多克隆抗体；

S3：将制备的toxR_28-534蛋白多克隆抗体与氨基磁珠微球偶联，制备抗体偶联的磁珠；

S4：利用生物信息学方法人工合成生物素标记的靶标DNA和LAMP法检测所需的引物序列，将制备的多克隆抗体与生物素偶联，然后利用链霉亲和素偶联生物素化的抗体和生物素标记的靶标DNA，制备抗体-DNA偶联物；

S5：取待测液，与抗体偶联的磁珠混合，待靶标抗原充分结合后使用磁力架分离磁珠-菌体，分离的磁珠重悬后与抗体-DNA偶联物混合，使充分结合，然后以得到的磁珠-菌体-抗体-DNA偶联物为模板，使用LAMP法扩增检测待测液中副溶血性弧菌。

所述步骤S1中副溶血性弧菌为副溶血性弧菌标准菌株ATCC 17802。

所述步骤S1中Vp种特异性toxR基因为去除信号肽序列和跨膜区部分的ToxR基因片段ToxR_28-534，其碱基序列如SEQ>

所述步骤S1中原核表达的表达载体为pET-28a(+)。

所述步骤S3中多克隆抗体与氨基磁珠微球偶联时按1∶2.5(V/V)的比例混合。

所述步骤S4中靶标DNA为弓形虫基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

所述步骤S4中LAMP法检测所需的引物序列具体如下：F3如SEQ ID NO：7所示，B3如SEQ ID NO：8所示，FIP如SEQ ID NO：9所示，BIP如SEQ ID NO：10所示。

所述步骤S4中多克隆抗体与生物素按100∶1的体积比混合，生物素化的抗体、链霉亲和素、生物素标记的靶标DNA按1∶1∶1的摩尔比混合。

所述步骤S5中待测液与抗体偶联磁珠的混合配比为5∶1(V/V)。

所述步骤S5中重悬磁珠与抗体-DNA偶联物混合的混合配比为7.5∶1(V/V)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和显著效果：

(1)本发明利用抗体-DNA偶联物的LAMP法建立了一种副溶血性弧菌的检测方法，操作上更为快捷简便，检测成本更低，特异性、灵敏度更高，为副溶血性弧菌的快速、准确检测提供了新的发展方向；

(2)通过免疫磁珠捕获法检测副溶血性弧菌的研究，结果显示免疫磁珠对副溶血性弧菌具有一定特异捕获与富集作用，具有快速、特异、高效、操作简单的特点，可应用于实验室的日常检测工作，并具有一定的特异性和灵敏度，具有广泛的实际意义；

(3)抗体-DNA偶联物的LAMP法检测副溶血性弧菌，所需时间远少于国标法，而且结果与国标法阳性率无显著差异，并且稳定、可靠，大大缩短了检测时间，节省了人力、物力；

(4)本方法具有廉价、特异性强、敏感性高等优点，对样品的检测结果说明，抗体-DNA偶联物的LAMP体系检测样品中污染副溶血性弧菌具有良好的应用价值。

附图说明

图1所示的是本发明抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的示意图。

图2所示的是本发明实施例1中ToxR_28-534基因片段的PCR产物凝胶电泳图，其中M:DNA标准分子量marker(DL>28-534PCR产物。

图3所示的是本发明实施例1中重组质粒pET-28a-ToxR的PCR鉴定图，其中M：DNA标准分子量marker(DL 2000)；1-5：pET-28a-ToxR阳性克隆。

图4所示的是本发明实施例1中重组质粒pET-28a-ToxR的双酶切鉴定图，其中M：DNA标准分子量marker(DL 2000)；1：pET-28a-ToxR双酶切片段；2：λ-EcoT14I digest DNA marker。

图5所示的是本发明实施例1中ToxR_28-534的SDS-PAGE电泳图，其中M：Fermentas蛋白Marker；1：重组菌未诱导表达；2：重组菌诱导表达全菌；3：重组菌诱导表达上清液；4：纯化的重组蛋白ToxR_28-534。

图6所示的是本发明实施例2中ToxR_28-534蛋白多抗的Westblotting鉴定图，其中M:Fermentas蛋白预染Marker；1:2ug>28-534；2:阴性对照。

图7所示的是本发明实施例5中副溶血性弧菌LAMP电泳检测结果图，其中M:DL2000，1:10⁸CFU/ml>7CFU/ml>6CFU/ml>5CFU/ml>4CFU/ml>3CFU/ml>

图8所示的是本发明实施例5中副溶血性弧菌LAMP检测显色结果，其中1:10⁸CFU/ml>7CFU/ml>6CFU/ml>5CFU/ml>4CFU/ml>3CFU/ml>

图9所示的是本发明实施例6中特异性实验的LAMP电泳检测结果图，其中1-5分别为VP、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌菌株。

图10所示的是本发明实施例6中特异性实验的LAMP检测显色结果，其中1-5分别为VP、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌菌株。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：副溶血性弧菌特有靶标蛋白toxR的获得

1.菌种的培养

从斜面上挑取一环副溶血性弧菌标准菌株ATCC 17802(购自广东环凯微生物科技有限公司)接种于液体培养基(3％氯化钠碱性蛋白胨水)中，37℃培养16h。再取10μl转接新鲜的3％氯化钠碱性蛋白胨水培养液，37℃培养16h。

2.引物设计

ToxR蛋白是副溶血性弧菌的跨膜转录激活蛋白，根据去除ToxR蛋白信号肽序列和跨膜区部分的基因片段ToxR_28-534(碱基序列如SEQ>GGATCCATGCTTGCTCAAAGGTTTACC-3'，下游引物序列(SEQ>CTCGAGCCATGGATTCACAGCAGAAG-3'，划线部分分别为BamH>

3.ToxR基因片段扩增

收集副溶血性弧菌培养上清，基因组提取试剂盒(购自杭州宝赛生物科技有限公司)提取副溶血性弧菌DNA。以副溶血性弧菌DNA为模板，用ToxR基因特异性引物、2×Super pfu mix高保真PCR扩增酶(购自杭州宝赛生物科技有限公司)进行PCR扩增，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，68℃延伸30sec，32个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化的ToxR_28-534基因PCR产物。扩增后电泳检测结果如图2所示。

4.重组质粒的构建

将胶回收的ToxR_28-534基因片段与表达载体pET-28a(+)(Novagen)分别用BamH>

构建的重组表达载体pET-28a-ToxR经PCR及BamH I和XholI双酶切鉴定。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳结果可见长约507bp左右的扩增条带,其大小与预期相符(图3)。双酶切结果表明与预期大小的核酸片段相一致，证明重组表达载体构建成功(图4)。阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果显示与预期的序列同源性为99％。

5.重组蛋白的表达与鉴定

将鉴定过的pET-28a-ToxR质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(杭州宝赛生物科技有限公司赠予)，挑取单菌落置3mL含Kan 50μg/mL的LB液体培养基中，37℃160r/min振荡过夜培养。活化后按1％(V/V)接种量转接10mL含Kan 50μg/mL的LB培养基，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.8时，加入0.5mM>

6.蛋白纯化

将菌株接种到5ml LB培养基中于37℃过夜活化后转接到含1L LB液体的培养基中，待OD至0.8左右加入终浓度为0.5mM IPTG于37℃过夜诱导；于4℃离心收集诱导的菌体，菌体用100ml 10mM pH7.4的PBS悬浮，超声波破碎后，于12000rpm离心15min，收集上清。4℃条件下将40ml粗蛋白样本与10ml NTA-Ni结合4h，其间不断搅拌，结合4h后分别用100ml含0mM，50mM咪唑盐洗脱杂蛋白，用溶于10mM PBS(pH7.4)的500mM咪唑盐缓冲液将目的蛋白从NTA-Ni上洗脱下来，蛋白样品用10mM pH7.4的不含氯化钠的PB缓冲液透析3次，PEG8000浓缩至适当浓度，纯化产物通过SDS-PAGE电泳检测。

表达出来的目标蛋白ToxR_28-534约为29KDa，与预期蛋白分子量一致，如图5所示。

实施例2：ToxR多克隆抗体制备

1.选取新西兰大白兔3只(购于浙江大学动物中心)，通过免疫大白兔制备针对toxR_28-534蛋白的多克隆抗体。第一次免疫用注射器吸取1ml弗氏完全佐剂(CFA)乳化200μg/ml纯化ToxR_28-534蛋白1ml，采用皮下多点免疫法免疫。第一次免疫2周后，抗原用量同上加不完全佐剂(IFA)进行第二次免疫。免疫2周后，抗原用量同上加不完全佐剂进行第三次免疫。三次免疫1周后取血，收集血清，检测抗体效价，记录数值。

2.ToxR多克隆抗体效价测定

ToxR_28-534多克隆抗体效价测定采用间接ELISA法。用包被液稀释纯化的重组蛋白ToxR_28-534抗原至终质量浓度10μg/ml，包被酶联板(IWAKI，Japan)，每孔100μl，4℃包被过夜，洗涤，拍干。次日加入封闭液(3％BSA)封闭酶联板，每孔250μl，37℃孵育2h，洗涤，拍干。用PBS将兔血清从1：100起倍比稀释成不同浓度，直至稀释至1:204800，每孔加入100μl，37℃孵育1h，洗涤，拍干。每孔加入1：10000稀释羊抗兔-HRP抗体100μl，37℃孵育1h，洗涤，拍干。每孔加邻苯二胺(O-phenydiamino，OPD)和H₂O₂底物溶液100μl，常温避光显色20min，加入2mol/L>2SO₄>450值。每个样本为3个平行孔，同时设阴性对照。

计算OD₄₅₀检测结果，P/N值≥2.1所对应的最小稀释倍数就是这个抗体的抗体滴度，所以ToxR_28-534抗体的效价为1:51200(表1)。

表1>28-534抗体效价测定

3.ToxR_28-534多克隆抗体Western印迹分析

采用BCA蛋白定量试剂盒(天根生物公司)测定各蛋白样品浓度。先将纯化的重组ToxR_28-534蛋白从12％SDS-PAGE胶上转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，封闭液(PBST+5％脱脂牛奶)封闭过夜；随后与ToxR_28-534多抗(1:500稀释)室温反应2h，洗脱液PBST洗膜3次；加入使用PBST稀释的HRP标记的鼠抗兔二抗(1:3000稀释，SIGMA)，室温反应1.5h，洗脱液洗膜3次；最后PVDF膜置于含有DAB的显色液中显色至条带清晰，将膜放入蒸馏水中终止显色反应(图6)。

实施例3：抗体偶联磁珠的制备

1.抗体前处理

利用饱和硫酸铵法沉淀6ml免疫血清，溶解于0.01M pH 7.4 PBS中，过夜透析，中间换液5次。A₂₈₀初步定量蛋白浓度，用0.01M>

2.氨基磁珠微球偶联多抗

取200μl 5％的1.5μm氨基磁性微球(厦门鑫海东方生物科技有限公司)，加入1ml纯水，振荡混匀，磁力架分离微球，去除上清。重复洗涤一次。将洗涤好的微球，用交联缓冲液(10mM PBS，pH 7.4)稀释至1ml，加入20μl交联剂(25％戊二醛水溶液)，室温摇动活化1h。磁力架分离活化好的微球，去上清；用标记缓冲液(15mM PB，pH 7.4)洗涤2次，重悬于1ml标记缓冲液中；摇匀后加入80μl 1mg/ml的ToxR_28-534蛋白抗体，室温摇动交联2h。交联后加入50μl20％BSA，摇动封闭0.5h。磁力架分离微球并去除上清，标记缓冲液洗涤2次，加入200μl>

实施例4：抗体-DNA偶联物的制备

1.多抗和生物素偶联

取1ml 1mg/ml>28-534多抗，加入10μlN-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS，SIGMA)储存液，室温摇动孵育1h。pH>

2.生物素化多抗-链霉亲和素-生物素标记DNA复合物偶联

根据已有文献报道，选取能稳定进行LAMP扩增的529bp弓形虫基因片段做为靶标DNA，引物序列：F(SEQ ID NO：5)：5’-CTGCAGGGAGGAAGACGAAA-3’；R(SEQID NO：6)：5’-CTGCAGACACAGTGCATCTG-3’，其中5’端标记生物素，由上海吉瑞公司合成。按照1∶1∶1的分子摩尔比，先将生物素化多抗和DNA混匀后再与链霉亲和素混匀，反应过夜。复合物4℃保存备用。

实施例5：抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法检测副溶血性弧菌

1.培养过夜的VP菌液，从10⁸CFU/ml用生理盐水10倍稀释至约10³CFU/ml备用。取磁珠抗体偶联物200ul，加入10⁸-10³CFU/ml>

2.取抗体-链霉亲和素-DNA偶联物40ul，加入到300ul磁珠-菌体中，室温摇动结合1h，1ml 0.01M PBS洗涤3次，100ul 0.01M PBS重新悬浮磁珠-菌体-抗体-链霉亲和素-DNA偶联物。

3.取磁珠-菌体-抗体-链霉亲和素-DNA偶联物1ul，作为模板。Lamp引物序列如下：

F3：ACGAGAGTCGGAGAGGGA(SEQ ID NO：7)；

B3：TGGATTCCTCTCCTACGCCT(SEQ ID NO：8)；

FIP：GGATCGCATTCCGGTGTCTCTTAAGATGTTTCCGGCTTGGC(SEQ ID NO：9)；

BIP：GACGACGCTTTCCTCGTGGTCAAGTCTCCGACTCTGTCT(SEQ ID NO：10)。

扩增体系如下：10×Thermopol buffer 2μl；10mM dNTP 4μl；2.5μM F3/B3引物各1μl；20μM FIP/BIP引物各1μl；5M Betine 2μl；25mM MgCl₂>

实施例6：特异性对比实验

使用本发明抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法检测VP、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌菌株，各菌株均用10⁸CFU/ml菌浓度，结果如图9、10所示。从该对比实验可以看出，副溶血性弧菌出现Lamp特征性条带，Lamp反应产物加入SYBR>

实施例7：实际样品检测效果

在杭州超市及农贸市场收集海水产品80份，分别釆用国标法和本发明抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法进行检测，统计阳性符合率。国标法检测方法参考GB/4789.7-2013，经过样品制备，增菌，分离，纯培养，初步生化鉴定以及确定鉴定。

收集海水产品80份，通过抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法检测，并与国标法进行比较。其中抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法检测副溶血性弧菌阳性为27份，国标法检测25份阳性，无统计学差异，因此其检测结果一致、可信，但大大缩短了检测时间。

国标法检测出阳性样品为25份，阳性率为31.25％；抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法检测出阳性样品27份，阳性率为33.75％。国标法和抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法无显著差异。

表2 实际样品抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法与国标检测结果

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

序列表：

SEQ ID NO：1：

ATGCTTGCTCAAAGGTTTACCTTTGATCCAAATAGTAATTCGCTCGCTGACCAACAAAGCGGCAACGAAGTTGTACGATTAGGAAGCAACGAAAGCCGTATACTCCTGATGTTGGCGGAGAGACCAAACGAAGTTTTAACCCGTAACGAGCTTCACGAGTTTGTTTGGCGTGAGCAAGGTTTTGAGGTGGATGACTCAAGCCTGACTCAAGCGATTTCTACTCTGCGTAAGATGTTGAAGGATTCAACCAAATCTCCAGAGTTTGTTAAAACCGTTCCAAAACGAGGCTATCAACTCATTTGTACTGTTGAACGCCTAAGCCCACTTTCTTCAGACTCAAGCTCAATTGAAGTTGAAGAGCCAGCTTCTGATAACAATGACGCCTCTGCTAATGAGGTAGAAACGATCGTAGAGCCGTCTTTGGCGACGCCTTCTGACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCAGTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCTGTGAATCCATGG

SEQ ID NO：2：

CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTGTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTGTTTTTCTGATTTTTGTTTTTTTTGACTCCGGCCCAGCTGCGTCTGTCGGGATGAGACCGCGGAGCCGAAGTGCGTTTTCTTTTTTTGACTTTTTTTTGTTTTTTCACAGGCAAGCTCGCCTGGGCTTGGTGCCACAGAAGGGACAGAAGTCGAAGGGGACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCCAGCCGTCTTGGAGGAGAGAAATCCGGACTGTAGATGAAGGCGAGGGTGAGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGCGACGAGAGTCGGAGAGGGAGAAGATGTTTCCGGCTTGGCTGCTTTTCCTGGAGGGTGGAAAAAGAGACACCGGAATGCGATCCAGACGAGACGACGCTTTCCTCGTGGTGATGGCGGAGAGAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCGAGGGAGACAGAGTCGGAGACTTGGACGAAGGGAGGAGGAGGCGTAGGAGAGGAATCCAGATGCACTGTGTCTGCAG

SEQ ID NO：3：

CGCGGATCCATGCTTGCTCAAAGGTTTACC

SEQ ID NO：4：

CCGCTCGAGCCATGGATTCACAGCAGAAG

SEQ ID NO：5：

CTGCAGGGAGGAAGACGAAA

SEQ ID NO：6：

CTGCAGACACAGTGCATCTG

SEQ ID NO：7：

ACGAGAGTCGGAGAGGGA

SEQ ID NO：8：

TGGATTCCTCTCCTACGCCT

SEQ ID NO：9：

GGATCGCATTCCGGTGTCTCTTAAGATGTTTCCGGCTTGGCSEQ ID NO：10：

GACGACGCTTTCCTCGTGGTCAAGTCTCCGACTCTGTCT