一种利用东方链霉菌发酵生产万古霉素的种子培养基和培养方法

摘要

本发明涉及一种利用东方链霉菌发酵生产万古霉素的种子培养基和培养方法，该种子培养基中添加了复合变性淀粉、丝素粉和干酪素等物质，有利于提高种子培养质量和万古霉素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现万古霉素高效的生产。

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种东方链霉菌的种子培养基和培养方法。

背景技术

万古霉素是从东方链霉菌的发酵液中分离得到的具有抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素。后来由美国Lilly公司开发，于1958年获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。目前临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的首选药物，并因此被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。

目前，国内万古霉素的发酵生产采用三级发酵模式，存在的主要问题有以下几点：

1种子培养基和发酵培养基中加入了葡萄糖，存在葡萄糖效应。

2发酵单位低，一般在7000u/ml。二级种子培养结束，其菌体浓度偏低，不超过25%，影响了万古霉素发酵技术水平（发酵罐100m³以上规模），导致发酵单位低，一般在7000u/ml。

3发酵周期长，一般超过了160h。特别是一级种子和二级种子培养周期较长，超过了24h，导致能耗较高，影响了生产成本。

4国内外相关文献缺少针对万古霉素发酵生产工艺中的补料内容。

5万古霉素生产成本较高，降低了产品市场竞争力。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种克服葡萄糖效应，增强种子液的质量和稳定性，有效提高发酵单位，缩短发酵周期，降低生产成本的利用东方链霉菌发酵生产万古霉素的种子培养基。

本发明的另一目的是提供一种利用上述种子培养基生产万古霉素的培养方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种利用东方链霉菌发酵生产万古霉素的种子培养基，其特征在于包括一级种子培养基和二级种子培养基，其中

所述一级种子培养基的组成为：

复合变性淀粉8～12g/L、麦芽糊精13～17g/L、鱼粉7～11g/L、丝素粉4～8g/L、玉米浆10～14ml/L、生物氮素2～6g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、糖化酶0.01～0.05g/L；

所述二级种子培养基的组成为：

复合变性淀粉10～14g/L、麦芽糊精15～19g/L、鱼粉9～13g/L、丝素粉6～10g/L、干酪素3～7g/L、玉米浆14～18ml/L、生物氮素4～8g/L、硫酸铵0.6～1g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、糖化酶0.03～0.07g/L、聚醚改性硅0.05～0.09g/L。

所述复合变性淀粉为氧化交联淀粉或交联酯化淀粉。

一种利用上述种子培养基发酵生产万古霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤包括：

1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25～30℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉菌母瓶发酵液按照0.1～0.2L/m³的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度25～30%、pH值6.5～7.5、培养时间10～15h移种；

2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至25～30℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35～40%、pH值6.8～7.6、培养时间15～19h移种发酵。

所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～50mg/100ml、溶磷40～60ug/ml、总糖20～30mg/100ml、pH6～7。

所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min。

所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～80mg/100ml、溶磷60～70ug/ml、总糖40～50mg/100ml、pH6～7。

所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量50～70m3/h；搅拌转速60～80r/min；

罐温：

发酵0～5h：29～30℃；

发酵6～7h：34～35℃；

发酵8h～二级种子培养结束：29～30℃。

所述培养好的东方链霉菌母瓶发酵液质量要求为：pH7～8；菌体浓度15～20%；镜检无杂菌。

所述一级种子的移种比例为1:6-10，以体积比计。

本发明的技术优势：

1本发明确认了万古霉素一级种子培养基、二级种子培养基的碳源、氮源最佳配伍比例。

2种子培养基中使用了复合变性淀粉，降低了种子培养基中的粘度，提高了种子培养质量。

3种子培养基中加入了丝素粉和干酪素，保证了种子培养所需各种氨基酸的最低浓度，有利于提高万古霉素种子液质量。

4本发明对万古霉素种子培养的工艺进行了详细的阐述，确认了万古霉素最佳的种子培养工艺和控制参数。通过本发明发酵生产万古霉素，最终使得万古霉素发酵单位（发酵罐100m³以上规模）达到8000-9000u/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了14.3%以上。

5本发明适用于规模化发酵生产万古霉素，能够满足年产150吨万古霉素的生产需求。

6万古霉素二级种子培养过程中，采用升温的方法，有效地降低了万古霉素二级种子液的粘度，提高了溶氧水平，提高了菌种的浓度和质量。

具体实施方法

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例的菌种选用东方链霉菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：pH7～8；菌体浓度15～20%；镜检无杂菌。

下述实施例中发酵培养可以采用适用于东方链霉菌发酵生产万古霉素的培养基，或者采用如下组成的发酵培养基：

复合变性淀粉13～17g/L、麦芽糊精17～21g/L、牛肉粉11～15g/L、丝素粉8～12g/L、干酪素5～9g/L、玉米浆16～20ml/L、生物素5～9g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙2～6g/L、糖化酶0.05～0.09g/L、聚醚改性硅0.08～0.12g/L、硫酸镁0.04～0.08g/L、硫酸锌0.02～0.06g/L、磷酸二氢钾0.3～0.7g/L。

实施例1

一级种子培养：种子培养基有效体积1m³。

种子培养基：氧化交联淀粉8kg、麦芽糊精13kg、鱼粉7kg、丝素粉4kg、玉米浆10L、生物氮素2kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1kg、糖化酶0.01kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的的质量要求为：氨基氮41mg/100ml、溶磷40ug/ml、总糖20mg/100ml、pH6.1。然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量20m³/h；搅拌转速60r/min。至菌体浓度25%、pH值6.5、培养时间10h移种。

二级种子培养：二级种子培养基体积6m³。

氧化交联淀粉60kg、麦芽糊精90kg、鱼粉54kg、丝素粉36kg、干酪素18kg、玉米浆84L、生物氮素24kg、硫酸铵3.6kg、轻质碳酸钙6kgL、糖化酶0.18kg、聚醚改性硅0.3kg。

二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50mg/100ml、溶磷60ug/ml、总糖40mg/100ml、pH6.1。然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为1:6（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量50m³/h；搅拌转速60r/min；罐温：0～5h：29～30℃；6～7h：34～35℃；8h～二级种子培养结束：29～30℃；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间15h后停止二级种子培养。

发酵培养：发酵培养基有效体积100m³。

复合变性淀粉1300kg、麦芽糊精1700kg、牛肉粉1100kg、丝素粉800kg、干酪素500kg、玉米浆1600L、生物素500kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙200kg、糖化酶5kg、聚醚改性硅8kg、硫酸镁4kg、硫酸锌2kg、磷酸二氢钾30kg。

二级种子液的质量结果：菌体浓度35%、pH值7.5，移种量为12.5m³。

发酵过程中，发酵温度控制在29-31℃；空气流量300m³/h；搅拌转速100r/min；pH控制在6.5-7.5，菌体浓度25-45%。

发酵培养结束，万古霉素发酵单位8476u/以上，发酵周期控制在139h。

实施例2

一级种子培养：种子培养基有效体积1m³。

种子培养基：交联酯化淀粉9kg、麦芽糊精14kg、鱼粉8kg、丝素粉5kg、玉米浆11L、生物氮素3kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg、糖化酶0.02kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至26℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮43mg/100ml、溶磷45ug/ml、总糖22mg/100ml、pH6.3。然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉素母瓶发酵液按照0.12L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量25m³/h；搅拌转速65r/min。至菌体浓度26%、pH6.8、培养时间11h移种。

二级种子培养：二级种子培养基体积7m³。

交联酯化淀粉77kg、麦芽糊精112kg、鱼粉70kg、丝素粉49kg、干酪素28kg、玉米浆105L、生物氮素35kg、硫酸铵4.9kg、轻质碳酸钙14kg、糖化酶0.28kg、聚醚改性硅0.42gkg。

二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至26℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮61mg/100ml、溶磷62ug/ml、总糖42mg/100ml、pH6.3。然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为1:7（V/V），二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；空气流量55m³/h；搅拌转速65r/min；罐温：0～5h：29～30℃；6～7h：34～35℃；8h～二级种子培养结束：29～30℃；至菌体浓度36%、pH值7.0、培养时间16h停止二级种子培养。

发酵培养：发酵培养基有效体积100m³。

复合变性淀粉1400kg、麦芽糊精1800kg、牛肉粉1200kg、丝素粉900kg、干酪素600kg、玉米浆1700L、生物素600kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙300kg、糖化酶6kg、聚醚改性硅9kg、硫酸镁5kg、硫酸锌3kg、磷酸二氢钾40kg。

二级种子液的质量结果：菌体浓度36%、pH值7.3，移种量为11.8m³。

发酵过程中，发酵温度控制在29-31℃；空气流量350m³/h；搅拌转速105r/min；pH控制在6.5-7.5，菌体浓度25-45%。

发酵培养结束，万古霉素发酵单位8690u/以上，发酵周期控制在137h。

实施例3

一级种子培养：种子培养基有效体积1m³。

种子培养基：氧化交联淀粉10kg、麦芽糊精15kg、鱼粉9kg、丝素粉6kg、玉米浆12L、生物氮素4kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg、糖化酶0.03kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至27℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮45mg/100ml、溶磷55ug/ml、总糖25mg/100ml、pH6.5。然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉素母瓶发酵液按照0.15L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量30m³/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度27%、pH7.1、培养时间13h移种。

二级种子培养：二级种子培养基体积8m³。

氧化交联淀粉96kg、麦芽糊精136kg、鱼粉88kg、丝素粉64kg、干酪素40kg、玉米浆128L、生物氮素48kg、硫酸铵6.4kg、轻质碳酸钙24kg、糖化酶0.4kg、聚醚改性硅0.56kg。

二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至27℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮67mg/100ml、溶磷65ug/ml、总糖45mg/100ml、pH6.5。然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为1:8（V/V），二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；空气流量70m³/h；搅拌转速70r/min；罐温：0～5h：29～30℃；6～7h：34～35℃；8h～二级种子培养结束：29～30℃；至菌体浓度40%、pH值7.2、培养时间17h停止二级种子培养。

发酵培养：发酵培养基有效体积100m³。

复合变性淀粉1500kg、麦芽糊精1900kg、牛肉粉1300kg、丝素粉1000kg、干酪素700kg、玉米浆1800L、生物素700kg、硫酸铵100kg、轻质碳酸钙400kg、糖化酶7kg、聚醚改性硅10kg、硫酸镁6kg、硫酸锌4kg、磷酸二氢钾50kg。

二级种子液的质量结果：菌体浓度38%、pH值7.2，移种量为11.1m³。

发酵过程中，发酵温度控制在29-31℃；空气流量400m³/h；搅拌转速110r/min；pH控制在6.5-7.5，菌体浓度25-45%。

发酵培养结束，万古霉素发酵单位8847u/以上，发酵周期控制在136h。

实施例4

一级种子培养：种子培养基有效体积1m³。

种子培养基：交联酯化淀粉11kg、麦芽糊精16kg、鱼粉10kg、丝素粉7kg、玉米浆13L、生物氮素5kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙4kg、糖化酶0.04kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至28℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮47mg/100ml、溶磷55ug/ml、总糖27mg/100ml、pH6.8。然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉素母瓶发酵液按照0.17L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量35m³/h；搅拌转速75r/min。至菌体浓度29%、pH7.3、培养时间14h移种。

二级种子培养：二级种子培养基体积9m³。

交联酯化淀粉117kg、麦芽糊精162kg、鱼粉108kg、丝素粉91kg、干酪素54kg、玉米浆153L、生物氮素63kg、硫酸铵8.1kg、轻质碳酸钙36kg、糖化酶0.54kg、聚醚改性硅0.72kg。

二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至28℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮73mg/100ml、溶磷68ug/ml、总糖48mg/100ml、pH6.7。然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为1:9（V/V），二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；空气流量65m³/h；搅拌转速75r/min；罐温：0～5h：29～30℃；6～7h：34～35℃；8h～二级种子培养结束：29～30℃；至菌体浓度39%、pH值7.4、培养时间18h停止二级种子培养。

发酵培养：发酵培养基有效体积100m³。

复合变性淀粉1600kg、麦芽糊精2000kg、牛肉粉1400kg、丝素粉1100kg、干酪素800kg、玉米浆1900L、生物素800kg、硫酸铵110kg、轻质碳酸钙500kg、糖化酶8kg、聚醚改性硅11kg、硫酸镁7kg、硫酸锌5kg、磷酸二氢钾60kg。

二级种子液的质量结果：菌体浓度39%、pH值7.0，移种量为10.5m³。

发酵过程中，发酵温度控制在29-31℃；空气流量450m³/h；搅拌转速115r/min；pH控制在6.5-7.5，菌体浓度25-45%。

发酵培养结束，万古霉素发酵单位8753u/以上，发酵周期控制在135h。

实施例5

一级种子培养：种子培养基有效体积1m³。

种子培养基：交联酯化淀粉12kg、麦芽糊精17kg、鱼粉11kg、丝素粉8kg、玉米浆14L、生物氮素6kg、硫酸铵0.9kg、轻质碳酸钙5kg、糖化酶0.05kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至30℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50mg/100ml、溶磷60ug/ml、总糖30mg/100ml、pH7。然后在火焰保护下，将已经培养好的东方链霉素母瓶发酵液按照0.2L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温29～30℃；空气流量40m³/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度30%、pH7.5、培养时间15h移种。

二级种子培养：二级种子培养基体积10m³。

交联酯化淀粉140kg、麦芽糊精190kg、鱼粉130kg、丝素粉100kg、干酪素70kg、玉米浆180L、生物氮素80kg、硫酸铵10kg、轻质碳酸钙50kg、糖化酶0.7kg、聚醚改性硅0.9kg。

二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至30℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮80mg/100ml、溶磷70ug/ml、总糖50mg/100ml、pH7。然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为1:10（V/V），二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；空气流量70m³/h；搅拌转速80r/min；罐温：0～5h：29～30℃；6～7h：34～35℃；8h～二级种子培养结束：29～30℃；至菌体浓度37%、pH值7.6、培养时间19h停止二级种子培养。

发酵培养：发酵培养基有效体积100m³。

复合变性淀粉1700kg、麦芽糊精2100kg、牛肉粉1500kg、丝素粉1200kg、干酪素900kg、玉米浆2000L、生物素900kg、硫酸铵120kg、轻质碳酸钙600kg、糖化酶9kg、聚醚改性硅12kg、硫酸镁8kg、硫酸锌6kg、磷酸二氢钾70kg。

二级种子液的质量结果：菌体浓度40%、pH值6.8，移种量为10m³。

发酵过程中，发酵温度控制在29-31℃；空气流量500m³/h；搅拌转速120r/min；pH控制在6.5-7.5，菌体浓度25-45%。

发酵培养结束，万古霉素发酵单位8642u/以上，发酵周期控制在135h。

上述实施例1-5的发酵过程中，采用流加法进行补料，其中

补氨水工艺：氨水的浓度控制在20-30%，发酵周期分别达到60h和100h时，补入氨水，用量为发酵液体积的0.2-0.4%，补料的时间控制在30-60min。

补干酪素工艺：配置10-15%的干酪素溶液并经过灭菌处理。发酵周期分别达到50h、80h和120h时，补入干酪素溶液，用量为发酵液体积的0.4-0.6%，补料的时间控制在10-20min。