一株具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌及其应用

摘要

本发明公开了一株具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌及其应用，代号为LTGPAF?6F，该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016053，分类命名为Klebsiella sp.LTGPAF?6F。本发明所述菌株LGPAF?6F具有产胞外多糖、吲哚乙酸，能自生固氮等促生抗逆性状。将该菌株制备成10

说明书

技术领域

本发明属于微生物的资源利用与农业和作物抗逆研究技术领域，涉及一株具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

随着人口的不断增长和环境不断恶化，水资源短缺，土壤盐碱化和可耕地面积少成为全世界农业生产面临的主要问题。并且，随着高温、干旱、洪涝等极端天气的频繁出现，对全球的粮食生产也造成了巨大的损害。近年来，关于植物对逆境适应能力的研究已成为全球关注的热点，如何提高植物的抗逆能力也已成为研究的重中之重。对于如何提高作物抗逆性目前已形成了一些方法，比如培育抗逆性强的植物品种、改进栽培措施等。然而，这些措施对解决问题还远远不够，仍然需要探究新的方法和技术。正如肠道微生物与人体健康的关系日益受到医学领域的关注一样，内生菌在促进植物生长发育和提高植物抗逆性方面发挥的作用也日益受到农业科研人员和微生物学者的重视。

克雷伯氏菌属(Klebsiella)中大多数种属于医源性致病菌或条件致病菌，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pnenmoniae)对人致病性最强，但是近年来在农业微生物和工业污染治理等领域的研究表明，克雷伯氏菌对植物本身不表现致病性，而且还是一种绿色菌肥和高效净化剂。克雷伯氏菌普遍分布于禾本科植株的根部以及土壤中，是一种丰富的根系联合固氮微生物资源，与植物在长期进化和系统发育过程建立起紧密的合作关系，对植物的生长及代谢起着间接的促进作用。因此，从长期生活在极端环境的植物组织中发掘优良的克雷伯氏菌种质资源，用于提高植物在不良生境的生存能力，对于恶劣自然条件下的植被恢复和农业生产具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，而提供一种具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌及其应用，能够协助作物在干旱的环境中生长，提高作物抗旱能力。

其技术方案为：

一株具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌，代号为LTGPAF-6F，该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC M 2016053，分类命名为Klebsiella>

优选地，所述克雷伯氏菌LTGPAF-6F的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述克雷伯氏菌LTGPAF-6F的nifH基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能产生吲哚乙酸。

优选地，所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能产生胞外多糖。

优选地，所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能自发固氮。

一种含有本发明所述克雷伯氏菌LTGPAF-6F的液体制剂，其中该菌株的有效菌数为10⁸～10⁹CFU/mL。

本发明所述具有促植物抗干旱作用的克雷伯氏菌LTGPAF-6F在与植物共生促进作物耐干旱过程中的应用。

优选地，所述的干旱情况为持续不浇水12天。

优选地，所述的作物为小麦。

本发明所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F在促进植物生长过程中的应用。

本发明所述的克雷伯氏菌在产吲哚乙酸过程中的应用。

本发明所述的克雷伯氏菌在产胞外多糖过程中的应用。

本发明所述的克雷伯氏菌在固定空气中的氮元素过程中的应用。

本发明的有益效果：

本发明所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能提高植物的耐旱性，在停止浇水12天，恢复浇水3天后，接种了菌株LTGPAF-6F的小麦幼苗比未接菌的小麦幼苗的鲜重提高了54.7％，地上部分和地下部分的长度也分别提高10.3％和18.9％。

本发明所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能产吲哚乙酸，有助于促进植物生长。能产生胞外多糖，有助于提高植物抗旱性。

本发明所述的克雷伯氏菌LTGPAF-6F能固定空气中的氮元素，有助于提高植物对氮元素的利用。

附图说明

图1是Klebsiella sp.LTGPAF-6F在LB培养基培养24h的菌落照片；

图2是不接菌小麦幼苗与接种Klebsiella sp.LTGPAF-6F的小麦幼苗在干旱胁迫条件下生 长状态的比较(第二盆和第三盆)以及两组无干旱对照(第一盆和第四盆)；

图3是干旱胁迫条件下接种Klebsiella sp.LTGPAF-6F的小麦幼苗与不接菌小麦幼苗的鲜重比较；

图4是干旱胁迫条件下接种Klebsiella sp.LTGPAF-6F的小麦幼苗与不接菌小麦幼苗的根长和茎长比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。

本发明涉及的克雷伯氏菌，分类命名为Klebsiella sp.LTGPAF-6F，该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2016053，保藏时间为30年。

本发明所述克雷伯氏菌的分离鉴定方法如下：

本发明所述菌株LTGPAF-6F为植物内生菌，是从中国新疆荒漠地区采集的骆驼刺(Alhagi sparsifolia Shap.)根部分离获得的，经鉴定其属于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)。

分离过程如下：选取健康的骆驼刺根部组织，用剪刀将其剪下，在清水中浸泡几分钟，洗去杂质，用75％乙醇浸泡1min，2％次氯酸钠浸泡3min，75％乙醇浸泡30s，再用无菌水对组织冲洗5遍。表面消毒后，在无菌条件下，将组织研磨成匀浆状。转移1mL研磨液至50mL PAF培养基(示蛋白胨10.0g，酸水解酪蛋白10.0g，无水MgSO₄>2PO₄>2PO₄，6.0g>2HPO₄，0.2g>4·7H₂O，2.0g葡萄糖酸，2.0g柠檬酸，2.0g(NH₄)₂SO₄，0.1mL微量元素(10mg>3BO₃，11.19mg>4.H2O，124.6mg>4.7H₂O，78.22mg>4.5H₂O，10mg>3，100mL水)，0.1mL>2O(100mg>4·7H₂O，10mL水)]中，相同条件下培养24h。第4d，转移1mL菌悬液至50mL>4)₂SO₄，添加0.2％ACC]中，相同条件下培养24h，然后将菌悬液梯度稀释后涂布于ADF平板上，28℃培养72h，挑取单菌落纯化保存。

本发明所述克雷伯氏菌LTGPAF-6F的生理生化特征：在TSB、R2A、Marine Agar 2216、Nutrient Agar、MacConkey Agar、LB等多种培养基上生长良好；如图1所示，在LB平板上培养24h后，形成圆形，直径2-3mm，不透明，半湿润，凸起的乳白色菌落；NaCl的最高耐受浓度为7％；能耐44℃高温；pH生长范围为5.0～8.5；为兼性厌氧菌，在有氧和无 氧条件均生长良好；产过氧化氢酶和细胞色素氧化酶；能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

将菌株LTGPAF-6F接种到5mL的PAF液体培养基中，28℃、150rpm震荡培养48h，8000rpm离心收集菌体，按照CTAB法提取该菌株的基因组总DNA。以基因组DNA为模板，利用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)PCR扩增16S rRNA基因片段，测序后获得菌株LTGPAF-6F的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。将该16S rRNA基因序列提交GenBank数据库进行多重序列比对，发现其与克雷伯氏菌属(Klebsiella)的相关模式菌株的序列相似性最高，与Klebsiella michiganensis W14^T的序列相似性达到99.4％。因此，将菌株LTGPAF-6F归入克雷伯氏菌属，命名为Klebsiella>

以下给出本发明所述克雷伯氏菌的一些性能研究结果：

克雷伯氏菌LTGPAF-6F的产吲哚乙酸(IAA)能力测定

将克雷伯氏菌LTGPAF-6F接种于含0.5mg/mL L-色氨酸的SMS液体培养基[sucrose 10g、(NH₄)₂SO₄>2HPO₄>4>3>600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液(50mL>4+1mL>3)，避光静置30min，测定其OD₅₃₀值，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。计算菌浓度OD₆₀₀值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量。通过测定，该克雷伯氏菌LTGPAF-6F的IAA产量可达30.7μg/(mL·OD₆₀₀)。

克雷伯氏菌LTGPAF-6F产胞外多糖能力测定

将克雷伯氏菌LTGPAF-6F接种于0.5×TSB液体培养基，30℃，180rpm摇床培养至稳定期，4℃、6000g离心15min去菌体，收集上清液，加入2.5倍体积遇冷的乙醇，可明显看到有絮状沉淀析出，表明该菌株能够产胞外多糖。

克雷伯氏菌LTGPAF-6F固氮能力测定

将活化好的克雷伯氏菌LTGPAF-6F接种于液体无氮培养基[4.0g KH₂PO₄，6.0g>2HPO₄，0.2g>4·7H₂O，2.0g葡萄糖酸，2.0g柠檬酸，0.1mL微量元素(10mg>3BO₃，11.19mg>4·H₂O，124.6mg>4.7H₂O，78.22mg>4.5H₂O，10mg>3，100mL无菌水)，0.1mL>4·7H₂O(100mg>4·7H₂O，10mL无菌水)]，30℃，180rpm摇床培养3d，该菌在无氮培养基中长势良好。以该菌株的基因组DNA为模板，利用固氮基因(nifH)的通用引物F(5’-GGCTGCGATCCAAGGCCGA-3’)和R(5’-CTGGCCTTGTTTCGCGGATGGCATGGC)扩增出约300bp的目的片段。将扩增出的>

以下给出本发明的克雷伯氏菌LTGPAF-6F应用的实验

挑取在TSA固体培养基培养24h的克雷伯氏菌LTGPAF-6F的单个菌落，接种于TSB液体培养基，28℃，200rpm培养12h，然后转接于含200mL TSB液体培养液的三角瓶中。置于200rpm、28℃摇床上震荡培养24h，待菌体达到对数生长期，6000rpm离心收集菌体。用灭菌的自来水洗涤菌体两次后，稀释到10⁸～10⁹CFU/mL作为生物菌剂。

将蛭石和土壤以体积比1∶3混合得种植基质，装入菌种袋中，每袋450g，密封后，121℃灭菌25min，然后将灭菌后的混合土壤装入塑料花盆中。

选用籽粒饱满、大小一致的晋麦47的种子，先用75％乙醇浸泡30s，倒掉液体，再加入0.1％HgCl₂浸泡7min，然后用无菌水洗5～6次，最后将小麦种子放到灭菌的湿润的双层滤纸上，置于25℃，黑暗培养2d。选取芽长、根长一致的小麦种子，种到土壤中，每盆种3棵，浇水40mL。

将准备好的盆栽至于25℃温室中，每天光照14h，每隔一天浇水30mL，一个星期之后，将上述准备好的克雷伯氏菌LTGPAF-6F活菌制剂40mL(按每克土壤10⁷～10⁸活菌数量接种)浇到小麦的根部位置，同时设置对照组浇灭菌后的自来水40mL，每个处理3盆重复。培养大约一个星期，等到小麦长到两叶一心期，对接菌处理组和未接菌对照组同时进行干旱处理，停止浇水12天，观察并记录小麦的生长情况。然后恢复浇水3天，记录小麦幼苗的健康状态并照相，然后将小麦从土里取出，将小麦表面的泥土洗净，测定并统计各处理的平均根长、株高、鲜重、干重等生长指标。最后，在无菌条件下对处理组和对照组小麦幼苗分别进行表面消毒(70％乙醇处理1min，2％次氯酸钠处理3min，70％乙醇30s，再用无菌水对组织冲洗5遍)，自然晾干并称重后将小麦幼苗研磨成匀浆，稀释涂布于TSA固体培养基上，28℃培养48h后，观察并记录菌落数量，并挑选2个代表菌落进行16S>

如图2所示为小麦盆栽实验的两组干旱处理及两组无干旱对照，从左至右第一盆是未接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F不进行干旱处理的对照，第二盆是未接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗干旱处理，第三盆是接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗干旱处理，第四盆 是接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F但不进行干旱处理的对照。从图2可以看出，在同等干旱胁迫条件下，接种了克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗(第三盆)保持鲜绿、正常生长，而未接菌的小麦幼苗(第二盆)生长迟缓，且出现明显枯萎现象，表明接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗(第三盆)的生长发育和健康状况明显优于未接菌的小麦幼苗(第二盆)。图3和图4中，CK和LTGPAF-6F分别表示不接菌的小麦幼苗干旱处理和接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗干旱处理。如图3所示，施加了克雷伯氏菌LTGPAF-6F活菌制剂的小麦幼苗干旱处理后的鲜重相比未接菌的对照增加了54.7％。如图4所示，干旱处理时接种了克雷伯氏菌LTGPAF-6F的小麦幼苗同不接菌的对照相比地上部分增长10.3％，地下部分根长增长18.9％。

接种克雷伯氏菌LTGPAF-6F小麦幼苗内生菌的分离结果显示，在28℃培养48h后，TSA分离平板上长出了大量与克雷伯氏菌LTGPAF-6F形态一致的菌落，数量统计达到2×10⁵CFU/g鲜重。挑选代表性菌落进行16S>

以上小麦盆栽实验的结果表明克雷伯氏菌LTGPAF-6F能够定殖于小麦幼苗体内，提高宿主植物对干旱胁迫的抵抗能力，并促进其生长发育。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。