基于g-C3N4电致化学发光增强效应的蛋白激酶活性检测方法

摘要

本发明公开了一种基于g?C3N4电致化学发光增强效应的蛋白激酶活性检测方法，属于电致化学发光技术领域。先将多肽组装到g?C3N4修饰电极表面，在蛋白激酶和巯基三磷酸腺苷的作用下，多肽发生巯基磷酸化，进而通过金?硫键作用将金纳米簇捕获到多肽的巯基磷酸化位点上，使得g?C3N4的电致化学发光信号增强。g?C3N4电致化学发光信号的增强程度与蛋白激酶的浓度呈正相关，据此可实现蛋白激酶活性的灵敏性检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于g-C₃N₄电致化学发光增强效应的蛋白激酶活性检测方法，属于电致化学发光技术领域。

背景技术

蛋白激酶又称蛋白质磷酸化酶，是催化蛋白质或多肽发生磷酸化的重要物质。在真核细胞中，蛋白激酶调控多种细胞信号转导，如基质的修饰活动等。蛋白激酶同样控制很多其他的细胞过程，包括：细胞的新陈代谢、细胞转录、细胞周期进程、细胞骨架重排及细胞运动等。蛋白激酶A（PKA）催化的磷酸化过程在调节细胞生物过程中起到非常重要的作用，PKA活性的过表达与很多疾病及癌症有密切关系。因此，构建操作简单、灵敏的激酶活性检测方法不仅可以为癌症早期诊断提供信息，还能在抗癌药物研发中起到重要作用。

碳氮化合物因其在光学、力学等方面的优异性能而受到各国科学家的关注。其中，类石墨烯氮化碳（g-C₃N₄）室温下非常稳定，具有无毒和光响应等性质。g-C₃N₄还具有电致化学发光（ECL）和荧光（PL）特性，ECL过程是在电极表面发生电子转移形成激发态诱导发光，ECL与PL相比，背景干扰低、灵敏度高且操作简单。

金属纳米簇是由几到几十个半径小于其电子费米波长的金属原子构成的新型纳米发光材料。金属纳米簇的性质介于孤立的原子与纳米粒子之间。以牛血清白蛋白（BSA）为模板在碱性溶液中制备金纳米簇（AuNCs），将金属纳米簇与重要生物活动有效联系起来，为金属纳米簇在生物及医理药理学等重要领域的应用提供了重要帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于g-C₃N₄电致化学发光增强效应的蛋白激酶活性检测方法，该方法在高灵敏和选择性激酶活性及其抑制剂分析中具有良好的应用前景。

本发明是这样实现的。基于g-C₃N₄电致化学发光增强效应的蛋白激酶活性检测方法，其特征在于，将多肽/g-C₃N₄修饰电极浸入含有蛋白激酶和巯基三磷酸腺苷的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中，使多肽发生磷酸化，将磷酸化多肽修饰电极浸入金纳米簇溶液中孵育；随着蛋白激酶浓度的增加，组装到电极表面的金纳米簇增多，金纳米簇对g-C₃N₄的电致化学发光增强效应越强，蛋白激酶浓度与g-C₃N₄的电致化学发光增强的程度呈正相关，据此实现对蛋白激酶活性的检测；g-C₃N₄的电致化学发光强度随着蛋白激酶抑制剂浓度的增加而降低，据此关系计算出鞣花酸的半抑制浓度，用于评价抑制剂的抑制效果。

本发明中，多肽/g-C₃N₄修饰电极按以下方法制备：

（1）g-C₃N₄的制备：将2.0g二氰胺置于管式炉中，以3°C/min的升温速率加热到550°C并保持4h，得到C₃N₄；将0.5g的C₃N₄加入到50mL5M的硝酸溶液中加热回流24h，冷却至室温后，离心，用二次水洗涤至上清液pH为7，收集上清液即为g-C₃N₄溶液。

（2）金纳米簇的制备：在37°C剧烈搅拌下，将3mL10mM氯金酸溶液快速加入到3mL50mg/mL牛血清白蛋白溶液中，5min后逐滴加入0.3mL1MNaOH，混合溶液在37°C下孵育12h，用超滤管提纯，收集管内产物即为金纳米簇溶液。

（3）制备多肽/g-C₃N₄修饰电极：将10μLg-C₃N₄溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干，再滴涂10μL壳聚糖溶液，晾干后将电极浸入含5mMN-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、8mMN-羟基琥珀酰亚胺和120μM多肽的HEPES缓冲溶液中反应过夜，制成多肽/g-C₃N₄修饰电极。

上述方法中，所述的壳聚糖溶液的质量百分浓度为0.2%，配制方法为将壳聚糖加入到质量百分浓度为1%的醋酸溶液中超声溶解；所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为7.4，含20mM的MgCl₂。

本发明的技术效果是：本发明利用蛋白激酶对多肽磷酸化的催化作用，将巯基三磷酸腺苷的巯基磷酸根转移到多肽/g-C₃N₄修饰电极表面，再通过金-硫键作用将AuNCs捕获到多肽的巯基磷酸化位点上，使得g-C₃N₄的ECL信号增强，g-C₃N₄的ECL信号增强程度与蛋白激酶的浓度呈正相关。据此，利用AuNCs对g-C₃N₄的ECL信号增强效应，构建了一种新型ECL方法用于蛋白激酶活性及其抑制剂分析，该方法具有灵敏度高、稳定性和选择性好等特点。

附图说明

图1是ECL生物传感器用于检测PKA活性的实验原理图。

图2是(a,c)g-C₃N₄和(b,d)AuNCs的(a,b)紫外-可见吸收光谱及(c,d)荧光光谱；内插图为(1,3)g-C₃N₄和(2,4)AuNCs在(1,2)可见光和(3,4)紫外光下的照片。

图3是(a)裸电极，(b)g-C₃N₄、(c)CS/g-C₃N₄、(d)BSA/多肽/CS/g-C₃N₄、(e)BSA/磷酸化多肽/CS/g-C₃N₄和(f)是AuNCs/BSA/磷酸化多肽/CS/g-C₃N₄修饰电极的(A)交流阻抗图和(B)循环伏安图。

图4是(a)裸电极，(b)g-C₃N₄、(c)CS/g-C₃N₄、(d)多肽/CS/g-C₃N₄、(e)BSA/多肽/CS/g-C₃N₄、(f)BSA/磷酸化多肽/CS/g-C₃N₄修饰电极和(g)AuNCs/BSA/磷酸化多肽/CS/g-C₃N₄修饰电极在含10mMNa₂S₂O₈和0.1MKCl的PBS(0.1M，pH7.4)中的ECL图。扫描速率为100mV/s，光电倍增管电压为700V。

图5是ECL强度-时间图，PKA浓度分别为0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30和50U/mL。内插图是标准曲线。

图6是不同浓度鞣花酸的ECL强度-时间图，内插图是ECL强度-浓度曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例1

（1）g-C₃N₄的制备：将2.0g二氰胺置于管式炉中，以3°C/min的升温速率加热到550°C并保持4h，得到C₃N₄；将0.5g的C₃N₄加入到50mL5M的硝酸溶液中加热回流24h，冷却至室温后，离心，用二次水洗涤至上清液pH为7，收集上清液即为g-C₃N₄溶液。

（2）金纳米簇的制备：在37°C剧烈搅拌下，将3mL10mM氯金酸溶液快速加入到3mL50mg/mL牛血清白蛋白溶液中，5min后逐滴加入0.3mL1MNaOH，混合溶液在37°C下孵育12h，用超滤管提纯，收集管内产物即为金纳米簇溶液。

运用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对g-C₃N₄和AuNCs进行表征（图2）。g-C₃N₄溶液在可见光和紫外光下分别呈现乳白色（瓶1）和蓝色（瓶3），在315nm处出现了紫外特征吸收峰（图2中a），荧光发射峰位于440nm（图2中c）。AuNCs溶液在可见光和紫外光下分别呈现深棕色（瓶2）和红色（瓶4），在500nm处出现了一个宽的紫外特征吸收峰（图2中b），荧光发射峰位于630nm（图2中d）。

实施例2

玻碳电极先用粒径为1.0、0.3、0.05μm的α-Al₂O₃糊在麂皮上抛光，再用硝酸溶液、乙醇和超纯水分别清洗。将10μLg-C₃N₄溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干，再滴涂10μL壳聚糖（CS）溶液，晾干后将电极浸入含5mMN-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、8mMN-羟基琥珀酰亚胺和120μM多肽的HEPES缓冲溶液中反应过夜；将电极浸入含PKA和巯基三磷酸腺苷（ATP-s）的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中反应100min，用二次水清洗后，将电极置于AuNCs溶液中孵育2.5h。电极的组装过程如图1所示。

运用电化学交流阻抗法和循环伏安法对ECL传感器的制备过程进行表征。由图3A可见，裸玻碳电极的电子传递电阻（Ret）很小（曲线a）；当将g-C₃N₄修饰到电极表面后，Ret值增大（曲线b）；壳聚糖的非导电性进一步增大了Ret（曲线c）；当多肽和BSA修饰到电极表面后，Ret值显著增大（曲线d）；在PKA和ATP-s的作用下多肽发生磷酸化，电极的电阻值进一步增大，表明ATP-s的巯基磷酸根成功地转移到多肽上（曲线e）；通过金-硫键将AuNCs捕获到电极上，Ret值继续增大（曲线f），这可能是由于AuNCs表面包覆的BSA阻碍了[Fe(CN)₆]^3?/4?向电极表面的传递。电极修饰过程的循环伏安表征结果（图3B）与交流阻抗相一致。

图4为电极组装过程的ECL强度-时间图。在10mMNa₂S₂O₈的共反应剂中，裸电极的ECL强度很低（曲线a）；当g-C₃N₄组装到电极表面后，产生强的ECL响应（曲线b）；将CS、多肽和BSA逐步组装到g-C₃N₄修饰电极表面并在20U/mLPKA和100μMATP-s溶液中使多肽发生磷酸化反应，g-C₃N₄的ECL响应逐步减小（曲线c-f）；当通过金-硫键将AuNCs组装到修饰电极表面后，g-C₃N₄的ECL信号显著增强（曲线g）。

实施例3

基于g-C₃N₄的ECL增强效应检测PKA活性

由图5可见，随着PKA浓度的增大，g-C₃N₄的ECL信号逐渐增强，当PKA浓度为20U/mL时，ECL强度值基本达到稳定。内插图为PKA检测的标准曲线，PKA浓度在0.02-20U/mL范围内与ECL信号呈线性，检测限为0.005U/mL。本方法比采用电化学和荧光法检测PKA的检测限低且线性范围宽，表明本发明提出的基于g-C₃N₄的ECL增强效应检测蛋白激酶活性的方法能实现PKA活性的高灵敏检测。

实施例4

以鞣花酸为例对PKA的抑制剂进行筛选研究。由图6可见，g-C₃N₄的ECL信号随鞣花酸浓度的增加而降低，当鞣花酸浓度为7μM时，ECL信号达到最小，鞣花酸对PKA的半抑制浓度为3.3μM。另外两种非PKA特异性抑制剂如槲皮素和5,6-二氯-l-β-D-呋喃核糖基苯丙咪唑则对g-C₃N₄的ECL信号几乎没有影响，以上结果表明，鞣花酸对PKA的抑制效果最强。