一种从茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种从茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，该方法是将茶花蜂花粉先粉碎脱脂，然后采用乙醇进行超声提取，得到的醇提物再经过大孔树脂进行纯化。采用该方法获得的茶花蜂花粉提取物对酪氨酸酶的抑制效果明显提高，半抑制率浓度最优可达到0.35mg/ml，因此可广泛用于制备预防和治疗人体黑色素沉着的美白保健品和护肤品，以及抑制食品酶促褐变的食品添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及酪氨酸酶抑制剂的制备方法，特别涉及一种从茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制剂的方法。

背景技术

酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成过程中的关键限速酶，该酶催化酪氨酸形成多巴，再以多巴为底物生成多巴醌，多巴醌在非酶促条件下反应最终合成黑色素。酪氨酸酶的活性与黑色素的合成量密切相关，如果酪氨酸酶活力过高，容易导致各种色斑，甚至黑色素瘤的形成。酪氨酸酶也是果蔬酶促褐变的主要酶，果蔬在贮运保鲜的过程中，在氧气和酪氨酸酶的作用下发生褐变，导致感官和品质下降，影响产品的运销。抑制酪氨酸酶的活性，不仅可以防止人体黑色素的异常沉着，解决色斑和美白等问题，还对抑制果蔬的酶促褐变，延长货架期具有重要意义。

蜂花粉是指蜜蜂从植物花朵采集的花粉，经过蜜蜂加入花蜜和唾液混合而成的团状物。蜂花粉含有200多种营养成分，被认为是最完美的营养品之一。蜂花粉还含有多种生物活性成分，具有延缓衰老、保肝护肝、提高免疫力、软化心脑血管、防止贫血、抑制前列腺疾病等保健作用，是一种天然的优质资源。我国蜂花粉资源丰富，但目前市场上的蜂花粉主要是简单杀菌的粗制品，附加值低，与国际上著名蜂产品相比，价格较低，蜂花粉资源未被充分开发利用。蜂花粉对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，我们前期研究了目前市场上最常见的蜂花粉品种：油菜蜂花粉、荷花蜂花粉、茶花蜂花粉和玫瑰蜂花粉，发现茶花蜂花粉对酪氨酸酶的抑制效果最强。因此，选择茶花蜂花粉制备一种天然安全高效的酪氨酸酶抑制剂。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种从茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，该方法得到的酪氨酸酶抑制剂具有更强的酶抑制效果。

本发明提供的方法包括以下步骤；

(1)将茶花蜂花粉粉碎，按重量加入5～20倍的石油醚进行超声脱脂，抽滤得到滤渣，将滤渣干燥，除去残留的石油醚；

(2)向脱脂后的茶花蜂花粉中加入70～90％的乙醇水溶液作为提取剂，料液比为1g：20～40ml，在40～50℃条件下进行超声提取，提取时间为30～40min，超声功率为100～200W，提取次数为2～3次，提取后过滤，将滤液浓缩，真空冷冻干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；

(3)将茶花蜂花粉醇提物溶解在6～10倍重量的水中，然后离心分离滤液；

(4)将步骤(3)得到的滤液上大孔树脂进行吸附，滤液与大孔树脂的体积比为1：6～8，用浓度为0％，50％，95％乙醇溶液依次梯度洗脱，洗脱流速为1～2ml/min，收集95％乙醇洗脱组分，浓缩后真空冷冻干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

优选地，步骤(2)中，向脱脂后的茶花蜂花粉中加入80％的乙醇水溶液作为提取剂，料液比为1g：30ml。

优选地，步骤(2)中，在50℃条件下进行超声提取，提取时间为35min，超声功率为100W，提取次数为3次。

优选地，步骤(4)中，所述的大孔树脂为AmberliteXAD7HP大孔树脂。

优选地，步骤(4)中，滤液与大孔树脂的体积比为1：8，洗脱流速为1ml/min。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用超声提取、真空冷冻干燥等工艺，全部工艺流程均在较低的温度条件下进行，从而减少了对活性成分的破坏，并提高了提取效率；采用大孔树脂纯化能有效富集活性成分，提高产品的纯度。实验证明，未经过大孔树脂工艺纯化的茶花蜂花粉提取物对酪氨酸酶的IC₅₀(半抑制率浓度)为1.39mg/ml，而利用本发明制备的茶花蜂花粉提取物对酪氨酸酶的IC₅₀最优为0.35mg/ml，IC₅₀值越小说明抑制效果越好。利用本发明提供的方法获得的茶花蜂花粉提取物对酪氨酸酶的抑制效果明显提高，可用于制备预防和治疗人体黑色素沉着的美白保健品和护肤品，以及抑制食品酶促褐变的食品添加剂。

(2)本发明提取的酪氨酸酶抑制剂产率高，得率达到4～8％，制备过程操作简单，周期短，易于推广应用，可进行工业化生产。

(3)本发明可以提高蜂花粉的附加值和经济效益，促进蜂产品企业和蜂农增收。

附图说明

图1为实施例1～3制备的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制效果试验结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1：

(1)将干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入10倍重量的石油醚，超声1h，脱脂3次，抽滤得到滤渣，将滤渣干燥，除去残留的石油醚；

(2)脱脂后的茶花蜂花粉中加入80％的乙醇水溶液作为提取剂，料液比为1g：30ml，在50℃条件下进行超声提取，提取时间为35min，超声功率为100W，提取次数为3次，提取后抽滤，将提取液旋蒸浓缩，真空冷冻干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；

(3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸馏水按1g：10ml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸馏水，超声10min使茶花蜂花粉醇提物均匀分散到蒸馏水中，然后以4000r/min离心5min后，得到滤渣和滤液；

(4)将上述得到的滤液上AmberliteXAD7HP大孔树脂进行吸附，滤液与大孔树脂的体积比为1：8，用浓度为0％，50％，95％乙醇水溶液依次梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集95％乙醇洗脱组分，浓缩后真空冷冻干燥，得到酪氨酸酶抑制剂，产率为8％。

实施例2：

(1)将干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入5倍重量的石油醚，超声2h，脱脂3次，抽滤得到滤渣，将滤渣干燥，除去残留的石油醚；

(2)脱脂后的茶花蜂花粉中加入70％的乙醇水溶液作为提取剂，料液比为1g：40ml，在40℃条件下进行超声提取，提取时间为40min，超声功率为200W，提取次数为3次，提取后抽滤，将提取液旋蒸浓缩，真空冷冻干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；

(3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸馏水为1g：6ml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸馏水，超声10min使茶花蜂花粉醇提物均匀分散到蒸馏水中，然后离心分离滤液；

(4)将上述得到的滤液上AmberliteXAD7HP大孔树脂进行吸附，滤液与大孔树脂的体积比为1：6，用浓度为0％，50％，95％乙醇水溶液依次梯度洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集95％乙醇洗脱组分，浓缩后真空冷冻干燥，得到酪氨酸酶抑制剂，产率为4.2％。

实施例3：

(1)将干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入20倍重量的石油醚，超声脱脂1次，抽滤得到滤渣，将滤渣干燥，除去残留的石油醚；

(2)脱脂后的茶花蜂花粉中加入90％的乙醇水溶液作为提取剂，料液比为1g：20ml在45℃条件下进行超声提取，提取时间为30min，超声功率为100W，提取次数为2次，提取后抽滤，将提取液旋蒸浓缩，真空冷冻干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；

(3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸馏水为1g：8ml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸馏水，超声溶解后离心，分离滤液；

(4)将上述得到的滤液上AmberliteXAD7HP大孔树脂进行吸附，滤液与大孔树脂的体积比为1：7，用浓度为0％，50％，95％乙醇水溶液依次梯度洗脱，洗脱流速为1.5ml/min，收集95％乙醇洗脱组分，浓缩后真空冷冻干燥，得到酪氨酸酶抑制剂，产率为6.8％。

试验例：

将上述3个实施例的酪氨酸酶抑制剂进行酪氨酸酶抑制效果验证：将产物用磷酸盐缓冲液(pH6.8，50mM)配制成不同浓度的受试物。取20μl上述受试物于酶标板中，加入50μl酪氨酸酶溶液(200U/ml)，37℃孵育2min，然后加入180μlL-多巴溶液(0.5mM)，用酶标仪在5min内测定475nm波长下的OD值变化。

酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(受试物OD值变化速率/酶活OD值变化速率)]×100％

测试结果如图1所示，3个实施例酪氨酸酶抑制剂的IC₅₀值分别为0.35，0.39，0.38mg/ml。从实验结果可以看出，应用本发明技术从茶花蜂花粉中制备的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，并且呈剂量依赖效应，可以用于美白祛斑保健品和护肤品，以及食品护色剂等领域。