一种用HPLC同时测定藤茶中11种黄酮类成分的方法

摘要

本发明公开了一种用HPLC同时测定藤茶中11种黄酮类成分的方法，属于药用植物成分分析技术领域，是先分别配制混合标准品溶液与藤茶供试样品溶液，然后采用高效液相色谱分别对混合标准品溶液与供试样品溶液进行检测，经计算获得供试样品中二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素的含量。本发明测定方法稳定性和重现性好，操作简单、结果准确可靠，可应用于藤茶中多种黄酮类成分的同时测定。

说明书

技术领域

本发明属于药用植物成分分析技术领域，具体涉及一种利用HPLC同时测定藤茶中11种黄酮类成分的方法。

背景技术

藤茶为葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物，学名为显齿蛇葡萄（AmpelopsisgrossedentataW.T.Wan），是我国特有的一种药食两用植物，主要分布于我国长江流域以南等省区海拔200~1300m的山区。藤茶味甘、淡、性凉，具有清热解毒、祛风湿等功效，民间常用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症，已有上千年历史。现代药理研究表明，藤茶具有抗氧化、抑菌消炎、降血糖、降血脂、降血压和护肝效果，对因烟酒过度等引起的咽喉炎、消化功能障碍等病症具有独特功效。2013年显齿蛇葡萄（藤茶）叶被国家卫生计生委批准为新食品原料[2013年第16号]。目前已有大量的藤茶饮用茶产品及深加工产品在市场上销售。

研究表明，藤茶中的主要次生代谢物以黄酮类化合物为主，是迄今在自然界中发现的黄酮含量最高的一种天然植物，故被誉为“植物黄酮之王”。藤茶中的黄酮类物质种类多样，目前已发现了十几种黄酮类成分，包括二氢杨梅素、槲皮素、花旗松素、山奈酚、藤茶素、杨梅苷、橙皮素、芹菜素等。

目前黄酮类化合物含量的分析检测方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等，其中分光光度法测定的是总黄酮的含量，不能反映各黄酮类成分的情况。HPLC法具有易操作、灵敏度高和稳定性好等特点，已成为分析测定黄酮的主要方法。目前，利用HPLC法测定藤茶黄酮类物质的含量已有一定的文献报道，但主要是测定藤茶的二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷等个别黄酮类成分的含量，对其他黄酮类成分的测定很少涉及，更没有同时测定的报道。但藤茶由于品种、生态环境及栽培管理条件等方面的不同，其黄酮类成分含量存在显著差异。因此，建立一种简便、准确的分析测定藤茶中多种黄酮类成分的方法，对藤茶质量的控制及科学评价具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用HPLC同时测定藤茶中11种黄酮类成分的方法，该方法简单，精确度高，重现性好，可为科学评价和有效控制藤茶的内在质量提供可靠依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用HPLC同时测定藤茶中11种黄酮类成分的方法，包括以下步骤：

1）混合标准品溶液的制备：分别精密称取适量的二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素标准品于10mL棕色容量瓶中，用无水甲醇溶解并定容至刻度，得到各成分浓度分别为112.5、135、150、125、165、125、210、138、99、300、100mg·L^-1的混合标准品溶液；

2）供试样品溶液的制备：将藤茶样品用液氮研磨成粉末，冷冻干燥至含水量小于5%，然后将其粉碎、过筛后，称取所得冻干粉0.1g于三角瓶中，加入10mL无水甲醇，摇匀，37℃振荡提取12h，4500r/min离心15min，残渣再加10mL无水甲醇，于相同条件下重复提取1次，并用少量无水甲醇洗涤残渣，合并3次上清液并定容至25mL，得供试样品溶液；

3）将所得混合标准品溶液与供试样品溶液分别经0.45μm有机微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行检测，经计算获得供试样品中二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素的含量；

其高效液相色谱的条件为：色谱柱：VisionHTC18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：无水甲醇-0.4wt%磷酸水溶液；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：5μL；检测波长：290nm，360nm；梯度洗脱程序为：0~20min，无水甲醇的体积浓度为30%；20~30min，无水甲醇的体积浓度由30%增加至40%；30~45min，无水甲醇的体积浓度由40%增加至42%；45~60min，无水甲醇的体积浓度由42%增加至50%。

所述藤茶样品为藤茶的嫩茎叶。

本发明的优点在于：

1、在本发明确定的色谱条件下，60min内便可完成对藤茶中11种黄酮类成分的同时测定分析，且每一种黄酮类成分的色谱峰峰形尖锐，对称性好，其分离度均大于1.5，能够达到完全分离。

2、本发明所建立的同时测定藤茶中11种黄酮类成分的分析方法简单、重复性好，结果准确可靠，可为藤茶的质量控制提供依据。

附图说明

图1为二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素在200-600nm波长范围内的吸收光谱图；

图2为杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁、芹菜素在200-600nm波长范围内的吸收光谱图；

图3为本发明混合标准品溶液在290nm（A）和360nm（B）波长下的液相色谱图；

图4为尤溪藤茶样品1在290nm（A）和360nm（B）波长下的液相色谱图；

其中，图中各峰标识：1-二氢杨梅素；2-二氢槲皮素；3-香橙素；4-杨梅苷；5-芦丁；6-杨梅素；7-柚皮素；8-槲皮素；9-橙皮素；10-山奈酚；11-芹菜素。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1实验部分

1.1仪器与试药

ThermoFisherLCQFleet高效液相色谱-质谱联用仪，配有四元梯度泵、二级管阵列检测器、自动进样器；SartoriusBT125D型分析天平（赛多利斯科学仪器(北京)有限公司）；高速离心机（Sigma3K-30）；紫外、可见分光光度计（ThermoScientificEvolution201）；冷冻干燥机(TelstarLyoQuest-55)。

二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素标准品均购自上海同田生物技术有限公司（纯度大于98%)，无水甲醇（色谱纯，Fisher公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

藤茶样品分别采集自福建尤溪县、贵州江口县，经福建农林大学生命科学学院植物学教研室鉴定为显齿蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataW.T.Wan)。

1.2高效液相色谱条件：

色谱柱：VisionHTC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：无水甲醇（A）-0.4wt%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱条件：0~20min，30%A；20~30min，30%A-40%A；30~45min，40%A-42%A；45~60min，42%A-50%A；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：5μL；检测波长：290nm，360nm。

1.3混合标准品溶液的制备：

分别精密称取适量的二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素标准品于10mL棕色容量瓶中，用无水甲醇溶解并定容至刻度，得到各成分浓度分别为112.5、135、150、125、165、125、210、138、99、300、100mg·L^-1的混合标准品溶液，将其于-20℃条件下储存供液相分析用。

1.4供试样品溶液的制备：

将藤茶样品用液氮研磨成粉末，冷冻干燥至含水量小于5%，然后将其粉碎过40目筛后密封，储存于-80℃备用；称取所得冻干粉0.1g于三角瓶中，加入10mL无水甲醇，摇匀，37℃振荡提取12h，4500r/min离心15min，残渣再加10mL无水甲醇，于相同条件下重复提取1次，并用少量无水甲醇洗涤残渣，合并3次上清液并定容至25mL，得供试样品溶液，将其于-20℃条件下储存供液相分析用。

1.5高效液相色谱测定

将所得混合标准品溶液与供试样品溶液分别经0.45μm有机微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱法进行检测后，经计算获得供试样品中二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素的含量。

2结果与讨论

2.1检测波长的选择

利用紫外可见分光光度计对11种黄酮类标准品进行全波长（200~600nm范围内）扫描，以确定不同黄酮类成分的最大吸收波长，结果见图1、图2。由图1可以看出，二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素在290nm左右有最大吸收峰；由图2可以看出杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁、芹菜素在360nm附近有最大吸收峰。

2.2洗脱梯度的选择

设定不同的洗脱梯度程序，根据各洗脱梯度程序下色谱峰的峰形及分离度，确定最佳洗脱梯度为0~20min，30%A-30%A；20~30min，30%A-40%A；30~45min，40%A-42%A；45~60min，42%A-50%A。采用上述梯度洗脱程序，11种黄酮类成分能够在60min内达到完全分离，其分离度均大于1.5，且峰形尖锐，对称性好（如图3，其中A为290nm下的液相色谱图，B为360nm下的液相色谱图）。

2.3HPLC定量分析的方法学考察

2.3.1线性关系考察

精密吸取混合标准品溶液0.25、0.5、1、2、4、8mL，分别用无水甲醇稀释并定容至10mL，按1.2的色谱条件将所得各浓度标准品溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后，进样5μL进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线的回归方程及相关系数，结果见表1。

表1HPLC测定11种黄酮类标准品的回归方程、相关系数、线性范围

由表1可知，二氢杨梅素、二氢槲皮素等11种黄酮类成分的质量浓度和相应峰面积呈良好线性关系。

2.3.2精密度试验

精密吸取混合标准品溶液5mL，加无水甲醇稀释至二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁和芹菜素的浓度分别为22.5、27.0、30.0、25.0、33.0、25.0、42.0、27.6、19.8、60.0、20.0mg·L^-1，按1.2项下的色谱条件将所得溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后，连续进样6次、每次5μL进行测定，记录峰面积并计算各黄酮类成分的含量，然后根据测定结果计算相对标准偏差RSD。经计算，二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、柚皮素、橙皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、槲皮素、芦丁、芹菜素相对应的RSD值分别为0.41%、0.21%、0.16%、0.25%、0.11%、0.17%、0.23%、0.35%、0.28%、0.24%、0.35%，结果表明该方法精密度良好。

2.3.3重复性试验

精密称取同一批藤茶样品6份，按1.4的方法平行制备成6份供试样品溶液，按1.2的色谱条件将所得溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后进样5μL进行测定，记录峰面积并计算各黄酮类成分的含量，然后计算RSD值。经计算，11种黄酮类成分的保留时间和含量的RSD值均小于3%，表明该测定方法的重复性良好。

2.3.4稳定性试验

精密称取一份藤茶样品，按1.4的方法制备成供试样品溶液，按1.2的色谱条件将所得溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后，分别于0、2、4、6、8、12、24小时进样5μL进行测定，并计算各黄酮类成分的含量。经计算，11种黄酮类成分的保留时间和含量的RSD值均小于3%，表明供试样品溶液在24h内稳定。

2.3.5加样回收率试验

精密称取已知11种黄酮类成分含量的同一藤茶样品6份，分别加入适量的11个黄酮类成分标准品，并按照1.4的方法制备供试样品溶液，按1.2的色谱条件将所得溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后进样5μL进行测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表211种黄酮类成分的回收率试验结果

由表2结果表明，该方法的回收率在85.0%~101.21%的范围内，相对标准偏差RSD≤2.04％，表明该方法具有较好的可靠性和准确性。

2.4藤茶样品中11种黄酮类成分的含量测定

按照本发明的方法，对福建尤溪和贵州江口两个产地的4个藤茶样品中11种黄酮类成分进行同时测定，并通过与标准品的紫外图谱和保留时间相比较来确认色谱图中11种黄酮类成分，结果见图4和表3。

表3藤茶样品中11种黄酮类成分的含量（按干重计，单位为mg·g^-1）

从图4和表3中可以看出，藤茶样品中的11种黄酮类成分能良好的分离，不同样品间的黄酮类成分含量不同。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。