一种分子标志物及其制备生物标志物试剂的应用

摘要

本发明涉及一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，包括6个miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）和12个蛋白质（前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S 蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1、胎球蛋白A、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2和血小板因子4）。还包括该分子标志物的应用。

说明书

技术领域

本发明属于检验医学、临床医学、生物技术、生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，及其作为检测试剂的应用及使用方法。

背景技术

神经管畸形(neuraltubedefects,NTDs)包括无脑畸形、脊柱裂、脑膨出、脑积水等,是一种严重的出生缺陷。全世界每年有神经管畸形儿30万～40万例，中国发生率明显高于西方国家。神经管畸形病理改变复杂，导致治疗效果很差。近年来，虽然随着孕期补充叶酸的普及率提高，神经管畸形的发生率有所降低。但由于神经管畸形是复杂的多基因疾病，由环境因素和遗传因素共同作用所致，单纯补充叶酸很难预防所有的神经管畸形的发生，目前为止，神经管畸形仍然是常见的出生缺陷之一，脑积水、下肢功能障碍和尿便失禁依然是严重的术后并发症。

建立无创的神经管畸形产前诊断新方法，一直是人们不断追求的理想目标。随着影像学技术（超声和MRI）的不断发展使一些有明显结构异常畸形的诊断时间获得提前，但也只能在畸形完全形成后给予诊断，失去治疗和预防的最佳时机，不能达到早期诊断的要求。通过在孕妇血液和尿液中筛选早期诊断的分子标志物,对于建立早期无创诊断新方法具有重要意义。羊水和血清中甲胎蛋白的含量测定可以用于神经管畸形的筛查，但由于甲胎蛋白检测受影响因素较多，包括母亲年龄与体重、怀孕胎龄和病毒感染等，同时甲胎蛋白检测的假阳性和假阴性率也较高。目前尚无理想的神经管畸形产前诊断分子标志物。由于神经管畸形属于多基因疾病，发病机制复杂，影响因素较多，并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定，因此，非常适合利用高通量的基因组和蛋白质组学技术从众多复杂的基因或蛋白质中筛选出一组（数十或数百个）特异性分子标志物，才能更准确进行早期诊断和疾病进展程度判断。因此，我们实验室利用miRNA芯片对神经管畸形孕妇外周血特异改变的miRNA进行筛选，并利用定量PCR进行大样本的验证。利用蛋白质组学（ITRAQ）方法比较神经管畸形胎儿母亲血清与正常孕妇血清的差异表达蛋白质，并利用ELISA方法进行大样本验证。因此，我们发现了一些有临床应用价值的分子标志物，对于神经管畸形的早期诊断和干预具有极其重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明是一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，及其作为检测试剂的应用及使用方法，其目的在于解决神经管畸形发病机制复杂，影响因素较多，并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定的问题。

技术方案：

一种分子标志物，其特征在于：该标志物由6个miRNA和12个蛋白质组成，其中所述的miRNA分别为：miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575、miR-765；所述的蛋白质分别为：前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2、血小板因子4。

还包括含有该分子标记物的试剂盒。

所述的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂针对的神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂、脊膜膨出。

一种由所述的分子标志物制备的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂的使用方法，其特征在于：该方法使用训练的算法来比较生物样品和对照样品之间的miRNA和蛋白质水平的差异，确定神经管畸形分子标志物最佳诊断模型。

所述的分子标志物制备的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂的使用方法，其特征在于：所述的生物样品包括孕妇血液、尿液、羊水、胎儿标本。

优点及效果：本发明的这些分子标志物可单独或联合用于先天畸形临床常规筛查，具有巨大的经济和社会效益。

附图说明：

图1、图2为；人miRNA芯片在神经管畸形孕妇中筛选到17个差异表达miRNA；

图3为：荧光定量PCR结果显示miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765、miR-1182和miR-1275表达与正常组比较出现统计学差异；

图4为：荧光定量PCR结果显示miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765和miR-1275为怀孕特异性miRNA；

图5为：不同孕周神经管畸形孕妇与正常孕妇血清PCSK9水平变化情况；

图6为：不同孕周正常孕妇血清PCSK9水平变化趋势；

图7为：脊柱裂与正常胎鼠E11-E17血清LIFR水平（*P<0.05，**P<0.01）；

图8为：LIFRmRNA在神经管畸形与正常胎儿脊髓组织组的表达情况（*p<0.05）；

图9为：6种miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）在不同神经管畸形类型中表达情况（CON正常组、SB脊柱裂组、ANE无脑儿组）；

图10为：铜蓝蛋白在神经管畸形、唐氏综合症和正常孕妇血清中的表达及ROC曲线；

图11为：甲胎蛋白在神经管畸形、唐氏综合症和正常孕妇血清中的表达及ROC曲线；

图12为：PCSK9在神经管畸形孕妇血清中表达情况，(a)PCSK9在正常孕妇血清中变化情况，(b)PCSK9在神经管畸形孕妇血清中变化情况，(c)ROC曲线分析，**p<0.01。

具体实施方式：

本发明是一种分子标志物，该标志物由6个miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）和12个蛋白质（前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2和血小板因子4）组成。

本发明的应用包括作为神经管畸形产前诊断判的生物标志物试剂的应用，包括制备用于神经管畸形产前筛查、临床诊断和生化检验的试剂盒。

所述的神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂、脊膜膨出等。

所述的神经管畸形产前无创诊断的生物标本包括孕妇血液、尿液、羊水和胎儿标本等。

所述的神经管畸形产前无创诊断的方法包括芯片、质谱技术、MRM、蛋白质组技术、ELISA、PCR、Western-blot、免疫组化、免疫透射比浊法、放射免疫法、催化活性测定法等相关方法。

其中使用训练的算法来比较生物样品和对照样品之间的miRNA和蛋白质水平的差异，确定神经管畸形分子标志物最佳诊断模型。

标志物中的miRNA分子的筛选：

（1）首先利用人miRNA芯片（AgilentTechnologies，SantaClara,CA)在神经管畸形孕妇血清中检测到104个miRNA，在正常孕妇血清中检测到156个miRNA，与正常孕妇相比怀有神经管畸形胎儿的孕妇有12个miRNA出现异常高表达，5个miRNA出现异常低表达（图1所示）。

（2）利用荧光定量PCR方法对芯片筛查的差异表达miRNA进行大样本验证，结果证实神经管畸形孕妇高表达的miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765和miR-1182与正常比较出现显著性差异。另外，神经管畸形低表达的miR-1275也与正常比较出现显著性差异（图3所示）。

（3）经过检测上述7个存在统计学差异的miRNA在胎儿出生后表达改变，发现除了miR-1182以外，其它6个miRNA均为怀孕特异性表达的指标，证实高表达的miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765、miR-1182和低表达的miR-1275可以作为神经管畸形产前诊断的分子标志物（图4所示）。

标志物中蛋白质分子的筛选：

（1）用ITRAQ定量方法比较神经管畸形胎儿孕妇血清与正常孕妇血清的差异表达蛋白质：对孕周匹配（18w/18w,19w/19w,19w/19w）的三个畸形组血清与三个正常组血清进行了iTRAQ蛋白定量，发现16种在神经管畸形孕妇血清中差异表达的蛋白质。同时我们利用ELISA方法对其进行了大样本验证，结果发现9种蛋白质（铜蓝蛋白、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2和血小板因子4）在神经管畸形孕妇血清中的表达明显异常，是神经管畸形产前诊断的特异性蛋白质标志物（表1所示）。

表19种神经管畸形产前诊断的特异性蛋白质标志物表达差异倍数

（2）利用蛋白质组学（iTRAQ）方法筛查神经管畸形孕鼠的血清蛋白质表达谱改变情况，发现前蛋白转化酶枯草溶菌素9（Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)在神经管畸形孕鼠血清、羊水和脊髓组织中均明显低表达，为了明确PCSK9在人类神经管畸形中的诊断价值，我们检测了不同孕周（15-20w,23-27w,37-40w）正常孕妇与神经管畸形孕妇血清PCSK9浓度变化情况，发现在胎儿的不同发育时期，孕妇血清PCSK9浓度神经管畸形组均较正常组显著降低，组间差异有统计学意义(P<0.05)（图5所示）。为明确PCSK9是否为怀孕特异性蛋白质，我们又检测了不同孕周（7-10w,15-20w,23-27w,37-40w）正常孕妇PCSK9血清水平。结果证实随着胚胎发育正常孕妇血清PCSK9的浓度逐渐增加，在孕37-40周其水平是孕7-10周1.96倍（图6所示）。这些结果表明PCSK9是神经管畸形诊断的特异性蛋白质标志物。

（3）利用蛋白质组学方法同样在神经管畸形孕鼠的血清中发现白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactorreceptor，LIFR)明显低表达，而且利用Western-blot和免疫组化的方法也证实LIFR在神经管畸形胎鼠脊髓组织中表达也明显降低（图7所示）。为了明确LIFR在人类神经管畸形组织中的表达情况，我们检测了LIFRmRNA在神经管畸形与正常胎儿脊髓组织中表达情况，神经管畸形组LIFRmRNA的表达水平明显低于相应对照组（图8所示）。说明LIFR可作为神经管畸形产前诊断分子标志物。

以下通过实施例来对本发明的效果进行说明：

实施例一

本发明miRNA分子标志物在神经管畸形产前诊断中的应用取得非常满意的效果。选择33例神经管畸形孕妇和33例正常孕妇，分别检测这些孕妇血清中6个miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）表达情况，结果miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-575和miR-765在神经管畸形孕妇血清中明显高表达，miR-1275在神经管畸形孕妇血清中明显低表达，与正常组比较均出现显著性差异。ROC曲线分析显示，miR-144、miR-720、miR-142-3p、miR-765、miR-1275和miR-575的ROC曲线下面积（AUC）分别是0.702、0.680、0.676、0.646、0.624和0.633。6个miRNA联合诊断的曲线下面积是0.803，诊断效率明显提高。这些miRNA还可以用于区分神经管畸形的不同类型，miR-144和miR-142-3p在无脑儿和脊柱裂组均异常升高，miR-720、miR-765和miR-575只在脊柱裂组异常升高，而miR-1275只在无脑儿组异常降低（图9所示）。

实施例二

本发明铜蓝蛋白在神经管畸形产前诊断中的应用也取得非常满意的效果。利用ELISA方法检测40例神经管畸形孕妇和40例正常孕妇血清中铜蓝蛋白的浓度，并与目前在临床上常用筛查神经管畸形的甲胎蛋白进行比较，铜蓝蛋白在神经管畸形的诊断中有较好的敏感性和特异性（ROC曲线下面积为0.979），优于目前在临床上应用的甲胎蛋白（ROC曲线下面积为0.938）（图10、图11所示）。

实施例三

本发明前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）在神经管畸形产前诊断中的应用也同样取得非常满意的效果。利用ELISA方法检测46例神经管畸形孕妇（表2）和46例正常孕妇血清PCSK9的浓度，结果显示PCSK9浓度在孕15-20周、孕23-27周和孕37-40周的神经管畸形孕妇血清中分别为215.80±88.41ng/ml、240.56±56.39ng/ml和322.50±80.39ng/ml，明显低于正常孕妇（正常孕妇在孕15-20周、孕23-27周和孕37-40周分别为297.00±61.51ng/ml、333.23±66.40ng/ml和456.03±58.70ng/ml）（P<0.01）。ROC曲线分析显示曲线下面积（AUC）是0.763(95%CI:0.65–0.88,p<0.0001)，PCSK9蛋白浓度<154.67ng/ml为诊断神经管畸形产前诊断阈值时，灵敏度为56.67%、特异度为98%（图12所示）。

表2神经管畸形孕妇的临床资料