用于治疗血液病症的富集和扩增的人脐带血干细胞

摘要

本发明涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体以及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。所述扩增的人脐带血干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA-并表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。在一个实施方案中，本发明的所述富集群体中的所述干细胞对于醛脱氢酶活性呈阳性(ALDH+)。另外，在一个实施方案中，所述扩增的干细胞几乎不含T细胞和B细胞并且含有有限数量的单核细胞(CD14)。此外公开了使用本发明的所述干细胞治疗受试者的血液病症的方法和测定化合物对造血干细胞的作用的方法。

说明书

本申请要求2013年5月20日提交的美国临时专利申请序列No.61/825,354和2014年4月24日提交的美国临时专利申请序列No.61/983,805的权益，所述临时专利申请两者特此以全文引用的方式并入。

发明领域

本发明涉及富集和扩增的人脐带血干细胞、其产生方法，和治疗方法。

发明背景

脐带血(“CB”)造血干细胞(“HSC”)具有使其区别于其成人对应物的众多表型特性和功能特性(Cairo等,“Placentaland/orUmbilicalCordBlood:AnAlternativeSourceofHematopoieticStemCellsforTransplantation,”Blood90:4665-4678(1997)；Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“CordBloodGraftEngineering,”Biol.BloodMarrowTransplant19(1):S74-S78(2013)；Navarrete等,“CordBloodBanking:AHistoricalPerspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“UmbilicalCordBloodTransplantation:Pros,ConsandBeyond,”BloodRev.23:199-204(2009))。CBCD34+细胞由于其广泛的增殖能力、其在体外产生造血集落的能力增加、其产生含有胎儿血红蛋白的红系细胞的能力，和较小数目的这些细胞重新构成清髓的同种异体接受者的能力，而被认为是更原始的(Cairo等,“Placentaland/orUmbilicalCordBlood:AnAlternativeSourceofHematopoieticStemCellsforTransplantation,”Blood90:4665-4678(1997))。由于单一CB收集物中存在有限数目的干细胞，因此使用CB细胞作为罹患血液恶性肿瘤和遗传病症的同种异体干细胞接受者的HSC移植物已经局限于儿童或较小成人接受者(Cairo等,“Placentaland/orUmbilicalCordBlood:AnAlternativeSourceofHematopoieticStemCellsforTransplantation,”Blood90:4665-4678(1997)；Navarrete等,“CordBloodBanking:AHistoricalPerspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“UmbilicalCordBloodTransplantation:Pros,ConsandBeyond,”BloodRev.23:199-204(2009))。这些限制导致在成人接受者中不可接受的高移植失败率和延迟的植入动力学(Cairo等,“Placentaland/orUmbilicalCordBlood:AnAlternativeSourceofHematopoieticStemCellsforTransplantation,”Blood90:4665-4678(1997)；Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“CordBloodGraftEngineering,”Biol.BloodMarrowTransplant19(1):S74-S78(2013)；Navarrete等,“CordBloodBanking:AHistoricalPerspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“UmbilicalCordBloodTransplantation:Pros,ConsandBeyond,”BloodRev.23:199-204(2009)；Barker等,“CombinedEffectofTotalNucleatedCellDoseandHLAMatchonTransplantationOutcomein1061CordBloodRecipientswithHematologicMalignancies,”Blood115:1843-1849(2010)；Delaney等,“StrategiestoEnhanceUmbilicalCordBloodStemCellEngraftmentinAdultPatients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010))。克服这些障碍的尝试包括几种不同的策略，例如使用能够促进HSC循环和这些CD34+细胞(2、6-9)的后续分裂的多种细胞因子组合进行两种不同CB移植物的输注或CBCD34+细胞的离体扩增。对于离体干细胞扩增的这些初始尝试已经导致产生较大数目的造血祖细胞和前体细胞，但骨髓重建细胞的数目降低。HSC在很大程度上是在体内缓慢循环的休眠细胞。(Giebel等,“PrimitiveHumanHematopoieticCellsGiveRisetoDifferentiallySpecifiedDaughterCellsUpontheirInitialCellDivision,”Blood107(5):2146-2152(2006)；Ho等,“TheBeautyofAsymmetry:AsymmetricDivisionsandSelf-RenewalintheHaematopoieticSystem,”Curr.Opin.Hematol.14(4):330-336(2007)；Huang等,“SymmetryofInitialCellDivisionsAmongPrimitiveHematopoieticProgenitorsIsIndependentofOntogenicAgeandRegulatoryMolecules,”Blood94(8):2595-2604(1999)；Srour等,“ModulationofInvitroProliferationKineticsandPrimitiveHematopoieticPotentialofIndividualHumanCD34+CD38–/loCellsinG0,”Blood105(8):3109-3116(2005))。在这些细胞因子组合存在下发生的CBCD34+细胞的快速离体循环和分裂导致HSC定型，其中残余骨髓重建潜能归因于已保持静止或已经历有限数目的细胞分裂的一小部分的干细胞(10-13)。最近，由于希望扩增可移植的CBHSC的数目，已经将间充质细胞饲养层或许多分子如固定化notch配体、铜螯合剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)、全反式视黄酸、芳基烃受体拮抗剂、前列腺素E2(PGE2)或c-MPL激动剂添加至这些细胞因子组合(Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“StrategiestoEnhanceUmbilicalCordBloodStemCellEngraftmentinAdultPatients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010)；Boitano等,“ArylHydrocarbonReceptorAntagonistsPromotetheExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”Science329:1345-1348(2010)；DeFelice等,“HistoneDeacetylaseInhibitorValproicAcidEnhancestheCytokine-InducedExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”CancerRes.65:1505-1513(2005)；Himburg等,“PleiotrophinRegulatestheExpansionandRegenerationofHematopoieticStemCells,”Nat.Med.16:475-482(2010)；Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Nishino等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemCellsbyaSmall-MoleculeAgonistofc-MPL,”Exp.Hematol.37:1364-1377e1364.(2009)；North等,“ProstaglandinE2RegulatesVertebrateHaematopoieticStemCellHomeostasis,”Nature447:1007-1011(2007))。这些方法中的几种已经在临床试验中进行了评估，但导致产生较大数目的短期而非长期骨髓重建细胞(Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；deLima等,“TransplantationofExvivoExpandedCordBloodCellsUsingtheCopperChelatorTetraethylenepentamine:APhaseI/IIClinicalTrial,”BoneMarrowTransplant41:771-778(2008)；deLima等,“Cord-BloodEngraftmentwithExVivoMesenchymal-CellCoculture,”N.Engl.J.Med.367(24):2305-2315(2012)；Delaney等,“Notch-MediatedExpansionofHumanCordBloodProgenitorCellsCapableofRapidMyeloidReconstitution,”Nat.Med.16(2):232-236(2010))。可选地，也在寻求促进CBCD34+细胞的归巢和植入的效率的策略以增加同种异体CB移植的功效(Goessling等,“ProstaglandinE2EnhancesHumanCordBloodStemCellXenotransplantsandShowsLong-TermSafetyinPreclinicalNonhumanPrimateTransplantModels,”CellStemCell8(4):445-458(2011)；Hoggatt等,“DifferentialStemandProgenitor-CellTraffickingbyProstaglandinE2,”Nature495(7441):365-369(2013)；O'Leary等,“TheRoleofDipeptidylPeptidase4inHematopoiesisandTransplantation,”Curr.Opin.Hematol.20(4):314-319(2013))。

已经提出了一种扩增功能性CBHSC的数目的可选方法。这种方法基于如下假设：使用含血清(SC)培养基和细胞因子组合离体扩增HSC的先前尝试实际上导致HSC遗传程序的沉默(Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“StrategiestoEnhanceUmbilicalCordBloodStemCellEngraftmentinAdultPatients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010)；Rao等,“ConciseReview:CordBloodBanking,TransplantationandInducedPluripotentStemCell:SuccessandOpportunities,”StemCells30:55-60(2012)；Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Araki等,“ExpansionofHumanUmbilicalCordBloodSCID-RepopulatingCellsUsingChromatin-ModifyingAgents,”Exp.Hematol.34:140-149(2006)；Araki等,“Chromatin-ModifyingAgentsPermitHumanHematopoieticStemCellstoUndergoMultipleCellDivisionsWhileRetainingTheirRepopulatingPotential,”Blood109:3570-3578(2007)；Azuara等,“ChromatinSignaturesofPluripotentCellLines,”Nat.CellBiol.8:532-538(2006)；Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)；Delcuve等,“RolesofHistoneDeacetylasesinEpigeneticRegulation:EmergingParadigmsfromStudieswithInhibitors,”Clin.Epigenetics4(1):5(2012)；Gul等,“ValproicAcidIncreasesCXCR4ExpressioninHematopoieticStem/ProgenitorCellsbyChromatinRemodeling,”StemCellsDev.18:831-838(2009))。这种可选策略与越来越多的证据相一致，所述证据表明，表观遗传机制在确定HSC是经历对称分裂并产生另外的干细胞，还是经历充其量维持HSC数目而同时产生造血祖细胞(HPC)的不对称分裂，或是经历减少HSC数目并产生更大数目的HPC的对称定向分裂中起到重要作用(Araki等,“ExpansionofHumanUmbilicalCordBloodSCID-RepopulatingCellsUsingChromatin-ModifyingAgents,”Exp.Hematol.34:140-149(2006)；Araki等,“Chromatin-ModifyingAgentsPermitHumanHematopoieticStemCellstoUndergoMultipleCellDivisionsWhileRetainingTheirRepopulatingPotential,”Blood109:3570-3578(2007)；Asai等,“Necdin,ap53TargetGene,RegulatestheQuiescenceandResponsetoGenotoxicStressofHematopoieticStem/ProgenitorCells,”Blood120(8):1601-1612(2012)；Li,“QuiescenceRegulatorsforHematopoieticStemCell,”Exp.Hematol.39(5):511-520(2011)；Will等,“Satb1RegulatestheSelf-RenewalofHematopoieticStemCellsbyPromotingQuiescenceandRepressingDifferentiationCommitment,”Nat.Immunol.14(5):437-445(2013)；Wilson等,“HematopoieticStemCellsReversiblySwitchfromDormancytoSelf-RenewalDuringHomeostasisandRepair,”Cell135(6):1118-1129(2008))。

本发明涉及克服本领域中的这些和其他缺点。

发明概述

本发明的一个方面涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体。所述扩增的干细胞表达CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA-和多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

本发明的另一个方面涉及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。这种方法涉及提供人脐带血干细胞的分离群体并且在有效产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的条件下在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(“HDACI”)存在下在不含血清(“SF”)培养体系中处理所述人脐带血干细胞的分离群体。所述扩增的干细胞表达CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA-和多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

本发明的另一个方面涉及治疗受试者的血液病症的方法。这种方法涉及向所述受试者施用本发明的分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体以治疗所述受试者中的所述血液病症。

在本发明中，在不含血清的培养条件下经过HDACI处理的CD34+细胞显示能够产生另外的CD34+细胞，其具有许多与原始干细胞相关的特征，包括增加的醛脱氢酶(ALDH)活性，增加的CD90、c-Kit(CD117)、整合素α6(CD49f)和CXCR4(CD184)的表达，但缺乏CD45RA表达(Notta等,“IsolationofSingleHumanHematopoieticStemCellsCapableofLong-TermMultilineageEngraftment,”Science333(6039):218-221(2011))。另外，包括SOX2、OCT4(也称为POU5F1)、NANOG和小脑锌指蛋白家族成员3(ZIC3，也称为HTX)、但不包括hTERT(端粒酶反转录酶)的多种多能性基因的上调与丙戊酸(VPA)处理相关(Azuara等,“ChromatinSignaturesofPluripotentCellLines,”Nat.CellBiol.8:532-538(2006))。在HDACI处理的CD34+细胞中的SOX2、OCT4和NANOG的基因敲低导致CD34+和CD34+CD90+细胞数目急剧降低。已发现，在SF培养条件下用HDACI处理能够将CBCD34+细胞分裂程序化以产生更大数目的原始细胞，所述原始细胞能够重建受辐照和二代免疫缺陷接受者小鼠而不形成血液恶性肿瘤或畸胎瘤。有限稀释分析表明，在VPA处理细胞中的SCID重建细胞(SRC)数目是原代CBCD34+细胞(PC)中的36倍。这些数据表明，上调干细胞特异性转录因子的表观遗传策略导致分裂的CBHSC的自我更新和多谱系分化能力的保存。

附图简述

图1A-D示出HDACI对CBCD34+、CD34+CD90+和CD34+CD90+CD184+细胞的离体扩增的影响。图1A是原代脐带血(CB)CD34+细胞(PC)的离体扩增策略的示意图。在不含血清(SF)或含血清(SC)培养基中用细胞因子激活新鲜分离的PC持续16小时。然后在所述培养条件下在具有或不具有其他细胞因子的情况下在存在/不存在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)的情况下进一步处理细胞7天。将扩增的细胞/再次分离的CD34+细胞用于进一步分析。在含细胞因子的SF培养基中在不存在(对照)或存在丙戊酸(VPA)、Scriptaid(SCR)或CAY10433(C433)的情况下将单独的CBPC处理7天。VPA相比于其他HDACI导致每个CB收集物产生显著更大绝对数目的CD34+细胞(*p<0.05和**p<0.005)(图1B)、CD34+CD90+细胞(*p<0.05和**p<0.005)(图1C)和CD34+CD90+CD184+细胞(***p＝0.0005)(图1D)(平均值±SE；图1B、图1C(ANOVA，p≤0.0007)和图1D(ANOVA，p＜0.0001))，(n＝6-7)。

图2A-B示出VPA对CBCD34+和CD34+CD90+细胞的离体扩增的影响。在图2A中，在不含血清(SF)的培养物中发生在细胞因子存在下的CBCD34+和CD34+CD90+细胞的产生比于含血清(SC)的培养物中发生的程度更大。在含VPA的SF培养物中，相比于SC培养物，观察到CD34+和CD34+CD90+细胞的增加倍数的显著差异。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005(平均值±SE；ANOVA，p<0.0001)，(n＝5-7)。图2B示出在SF培养基中在对照条件下或在VPA存在下处理的PC和CD34+细胞的表型分析。对于每个细胞群体分析CD34、CD90、CXCR4(CD184)、CD49f和CD45RA的表达。描绘了CD34+CD90+细胞(方框)的CD184、CD49f和CD45RA的共表达(n＝4)。

图3A-B示出VPA对CD34+细胞迁移和归巢的影响。图3A示出在不存在(对照)或存在VPA(7天)的情况下产生的再次分离的CD34+细胞的SDF1(100ng/mL)诱导迁移的结果。在16小时和48小时后显著更大数目的VPA处理的CD34+细胞向SDF1迁移(平均值±SE，^*p<0.05，单尾t检验)，(n＝4)。图3B示出在输注后16小时和48小时在不存在(对照)或存在VPA(7天)的情况下产生的再次分离的CD34+细胞在NSG小鼠中的归巢(平均值±SE，****p<0.0001，*p<0.05)。NSG接受者小鼠(n＝35)。

图4A-B示出VPA对CD34+CD90+细胞的细胞周期的不同阶段的影响。图4A示出在对照(上图：26.4％)条件下SF培养或含有VPA的培养物(下图：82.9％)处理7天后的CD34+CD90+细胞的流式细胞术细胞周期分析，其中相应的点图通过BrdU脉冲标记(2.5小时)并用7AAD染色示出细胞周期的不同阶段的细胞(G0/G1、S和G2/M)。示出了3个代表性实验之一。图4B示出在细胞周期的不同阶段中的CD34+CD90+细胞的百分比。在含VPA的培养物中在G0/G1(*p<0.05)、S(*P<0.05)和G2/M(****p<0.0001)阶段中观察到CD34+CD90+细胞的数目显著增加(平均值±SD；ANOVAp<0.002)，(n＝3)。

图5A-B示出VPA对CBCD34+和CD34+CD90+细胞在不存在细胞因子的情况下的离体扩增的影响。在图5A中，原代CBCD34+细胞(PC)如图1A中所示用细胞因子激活并且在SF培养条件下在仅培养基(无细胞因子)或仅VPA(无细胞因子)中在不存在其他细胞因子下处理7天。仅含有培养基(无细胞因子)和仅含有VPA(无细胞因子)的两种培养物相比于PC产生显著更大数目的CD34+和CD34+CD90+细胞(****p<0.0001和*p<0.05)(平均值±SE；ANOVA，p<0.0001)，(n＝6)。在图5B中，在仅含有培养基(无细胞因子)相对于仅含有VPA(无细胞因子)的SF培养物中观察到CD34+和CD34+CD90+细胞的增加倍数的显著差异。*p<0.05，**p<0.005(平均值±SE；ANOVA，p<0.0001)，(n＝6)。

图6示出HDACI对HDAC蛋白质表达水平的影响。新鲜分离脐带血单核细胞(CB-MNC)并且在不存在和存在Scriptaid(SCR)、CAY10433(C433)或丙戊酸(VPA)的情况下处理24小时。制备总细胞裂解物并且使用如实施例中所述对I类(1、2和3)、IIa类(4和5)和IIb类(6)HDAC具特异性的HDACmAb进行蛋白质印迹。使用b-肌动蛋白作为上样对照。未被处理的新鲜分离的CB-MNC，C对照。示出4种代表性实验之一。

图7A-B示出在扩增的CB-CD34+细胞中的醛脱氢酶(ALDH)功能活性。图7A示出在对照条件下或用VPA处理7天的原代脐带血(CB)CD34+细胞(PC)的结果，其中对细胞因子评估ALDH活性。包括ALDH+CD34+细胞(左列)、ALDH+细胞(中列)的细胞的各种群体的轮廓曲线分析。将ALDH+细胞(方框)门控以进行CD34和c-kit(CD117)的共表达(右列)。相比于含血清(SC)对照培养物(p＝0.005)以及含VPA的培养物(p＝0.001)，在不含血清(SF)中观察到更大程度的ALDH活性。类似地，相比于SC培养物，在SF中的ALDH+CD34+和ALDH+CD34+CD117+细胞的百分比显著更大(分别为p＝0.001和p＝0.007)。左图：SC培养物，和右图：SF培养物。示出7个代表性实验之一。如图7B中所示，在SF培养物中，相比于SC培养物，在VPA存在下产生远远更大数目的ALDH+CD34+CD117+细胞(平均值±SD；*p<0.05，ANOVA，p＝0.009)，(n＝3-5)。

图8A-C示出在VPA扩增的CD34+细胞中的多能性基因的转录物的结果。图8A示出多能性基因在VPA处理的CD34+细胞中的表达的结果。在不含血清(SF)和含血清(SC)培养物中在存在或不存在VPA的情况下处理后，再次分离CD34+细胞。从总RNA制备cDNA并且进行RT-PCR。胚胎干(ES)细胞代表SOX2/OCT4/NANOG转录物的阳性对照和CD34表达的阴性对照。通过RT-PCR在SF培养条件下的VPA处理CD34+细胞中未检测到假OCT4的表达。在两种不同凝胶上使对照/VPA(SF)和VPA(SC)/ES细胞的泳道进行电泳并且在单一凝胶上使OCT4假基因/真基因的泳道进行电泳。GAPDH-管家基因，M-A50-bpDNA梯级。示出4种代表性实验之一。图8B示出VPA对与多能性相关的基因的影响的定量。如上所述分离并处理在不同条件下培养的CD34+细胞(图8A)。通过SybrGreenQ-PCR计算基因(SOX2/OCT4/NANOG)的相对转录物水平。通过相对于PC中存在的相应转录物水平标准化来计算从对照培养物(左图)和含VPA培养物(右图)中再次分离的CD34+细胞的mRNA表达的变化倍数(平均值±SD；ANOVA，p＝0.0001)，(n＝4)。图8C示出在SF或SC培养条件下VPA处理后与染色质重塑和多能性相关的基因表达的定量。如上所述计算SET、MYST3、SMARCAD1和ZIC3基因的mRNA表达水平的变化倍数(平均值±SE，ANOVA，p＝0.04)，(n＝3)。

图9A-C示出多能性基因在VPA扩增的CD34+细胞中表达的结果。图9A示出在对照条件下培养7天后或在暴露于VPA后在再次分离的CD34+细胞中的SOX2、OCT4和NANOG表达的代表性流式细胞术分析的结果。将细胞固定，渗透化，并用匹配的同种型IgG(每个图中的最左侧曲线)或SOX2/OCT4/NANOGmAb染色，以评估从对照(对照图中的最右侧曲线)和VPA(VPA图中的最右侧曲线)培养物中再次分离的CD34+细胞中的蛋白质的胞内水平。示出4种代表性实验之一。图9B示出多能性基因表达的共焦显微术分析结果：在SF培养物中在用VPA处理后再次分离CD34+细胞并且如实施例中所述用同种型匹配的IgG、或OCT4/SOX2/NANOG和ZIC3抗体(FITC)免疫染色。细胞核用DAPI染色。示出共焦z系列的单一光学截面(比例尺＝10μm，OCT4、SOX2和NANOG(63x)以及IgG、ZIC3和更高放大倍数的OCT4(126x))。示出3种代表性实验之一。图9C示出多能性基因的共免疫沉淀的结果。ES(H9)细胞和VPA处理细胞(V)的后代在第7天裂解，ES或V细胞裂解物用NANOGpAb(或抗IgG对照)免疫沉淀(IP)并通过SDS-PAGE分级。来自ES和VPA处理细胞的总蛋白质裂解物(输入)也包括在相同凝胶中，但是不连续的，并且使用OCT4pAb进行蛋白质印迹分析(WB)。也利用ES和V裂解物进行使用NANOGmAb的WB。b-肌动蛋白是上样对照。示出3种代表性实验之一。

图10A-E示出siRNA介导的多能性基因敲低的结果。在图10A中，在不含血清(SF)培养物中用VPA处理原代CBCD34+细胞(PC)。在3天后，如实施例中所述将细胞用SOX2、OCT4和NANOG的汇集物(SON)、乱序siRNA(阴性对照)和GAPDHsiRNA(阳性对照)转染。通过SybrGreenQ-PCR定量SOX2、OCT4、NANOG、GAPDH和ZIC3转录物并且相对于CD34转录物水平标准化。*p<0.05，**p≤0.006，***p＝0.0001(平均值±SE；ANOVA，p<0.0001)，(n＝3)。在图10B中，通过RT-PCR分析在siRNA介导的基因敲低后的SOX2/OCT4/NANOG、CD34和GAPDH的表达。M-DNA标志物，胚胎干(ES)细胞代表SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的阳性对照。泳道在相同凝胶上进行电泳。在图10C中，通过共焦显微术分析多能性基因表达。上图：乱序siRNA，和下图：SONsiRNA，显示在用VPA处理的细胞中的SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3表达。图像代表共焦z系列的光学截面：比例尺＝10μm(40x)。在两个其他实验中获得类似的数据。在图10D中，在转染7天后，使用流式细胞术分析CD34+和CD34+CD90+的细胞的百分比。曲线图代表在用包括乱序和SON的siRNA转染后在VPA培养物中产生的CD34+和CD34+CD90+细胞的百分比的比较分析。*p＜0.05(平均值±SE；ANOVA，p＝0.0005)，(n＝3)。图10E示出计算在用乱序或SONsiRNA转染后在含VPA培养物中产生的CD34+和CD34+CD90+细胞/CB收集物的绝对数目。*p<0.05，***p＝0.0001(平均值±SE；ANOVA，p＝0.0008)，(n＝3)。

图11A-F示出在原代NSG小鼠中的人细胞嵌合性的分析结果。向NSG小鼠移植原代细胞(PC)、从对照培养物和含有VPA的培养物中再次分离的CD34+细胞。通过流式细胞术测定与(图11A)人细胞(CD45+)、(图11B)CD34+CD45+细胞、(图11C)CD34+CD184+细胞、(图11D)CD33+细胞和(图11E)巨核细胞(CD41+)、红系细胞(血型糖蛋白A(GPA+))、粒细胞(CD14+)、T细胞(CD3+)和B细胞(CD19+)的嵌合性百分比(平均值±SD)。在图11F中，利用PC、在具有或不具有VPA的SF培养条件下在不存在或存在细胞因子的情况下处理的CD34+细胞进行移植所实现的平均人细胞嵌合性程度的比较分析。(图11A)**p＝0.006，***p＝0.0008(ANOVA，p<0.0001)，(图11B)**p＝0.004(ANOVA，p＝0.03)，(图11C)*p＝0.01，**p＝0.0008(ANOVA，p＝0.01)，(图11D)**p＝0.003，****p<0.0001(ANOVA，p<0.0001)和(图11E)平均值±SD*p<0.05，**p<0.005，(ANOVA，p<0.0001)和(图11F)*p<0.05(单尾t检验)，**p≤0.002(ANONA<0.0001)。NSG接受者(n＝27)。

图12A-B示出在二代NSG小鼠中的人细胞嵌合性的分析结果。在移植原代CBCD34+细胞(PC)或在先前所述的各种条件下扩增7天的移植物后第13-14周，将原代接受者小鼠处死并且将2×10⁶个BM细胞移植到二代NSG小鼠中。每个条柱代表如通过单克隆抗体染色和流式细胞术分析所测定的二代NSG小鼠的骨髓中出现的人供体细胞植入的中值百分比和(图12A和图12B)在来自原代接受者的不同类型的移植物的移植后第15-16周的二代NSG小鼠中发生的多谱系造血细胞植入的中值百分比。每个组中存在2-3只小鼠。谱系发展模式在统计学上显著不同，*P<0.05，**p<0.005，(平均值±SD，图12A和图12B(ANOVA，p<0.0001))，NSG接受者(n＝18)。

图13A-C示出在原代CBCD34+细胞(PC)和在对照条件下培养或用VPA处理的相等数目的CD34+细胞的后代中存在的SCID重建细胞(SRC)的频率的比较结果。在图13A中，将增加数目的PC(50、250、500、2500和5000)和用相等数目的在对照条件下或在VPA存在下培养的细胞起始的培养物后代单独地移植到NSG小鼠中。示出在12-13周后植入接受者小鼠的BM中的人CD45+细胞的百分比。在图13B中，使用具有或不具有人细胞植入证据的小鼠数目进行Poisson统计学分析(表3)。曲线图表示在PC或来自对照培养物或含有VPA的培养物的相等数目的CD34+细胞的后代移植后，不具有人细胞嵌合性的小鼠的百分比(阴性)。虚线表示95％置信区间。在图13C中，使用Poisson统计分析计算SRC数目并且表示为SRC/1×10⁶CD34+细胞的数目。**P≤0.002(ANOVA，p＝0.003)，NSG接受者小鼠(n＝111)。

图14示出原代脐带血(CB)CD34+细胞(PC)和在不具有细胞因子的不含血清(SF)培养基(仅培养基)中或在不具有细胞因子的仅VPA存在下培养7天的CD34+细胞的表型分析结果。示出培养细胞的CD34、CD90、CXCR4(CD184)、CD49f和CD45RA表达。描绘了CD34+CD90+细胞的CD184、CD49f和CD45RA的共表达。(n＝4)

图15示出HDACI对HEK293细胞中的HDAC蛋白质水平的影响。将HEK293细胞用SCR、C433和VPA处理2小时(T1)和24小时(T2)。如实施例中所述用若干I类(1、2和3)、IIa类(4和5)和IIb类(6)HDAC的初级单克隆抗体(mAb)探测蛋白质印迹。每个HDACI均一地影响HDAC2和HDAC4的表达。使用β-肌动蛋白作为上样对照。(n＝4)

图16示出在ES细胞中的多能性基因的共焦显微术分析的结果。如实施例中所述将ES(H9)细胞固定，渗透化，并用OCT4/SOX2/NANOG/ZIC3抗体(FITC)染色。细胞核用DAPI染色。在ES细胞的细胞核中相比于细胞质中，包括SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的多能性基因蛋白更显著。示出共焦z系列的单一光学截面(比例尺＝25μm(63倍放大倍数，具有光学放大))。

图17A-G示出畸胎瘤形成测定的结果。将从对照培养物或含有VPA的培养物中再次分离的1×10⁶个ES(H9)细胞或CD34+细胞与Matrigel混合并皮下注射至NSG小鼠的右后肢(n＝9)。在8周后，将小鼠处死并且将群体解剖，固定，并用苏木精和曙红染色。(图17A和图17B)。在三只小鼠中的每一个中，仅ES(H9)细胞形成畸胎瘤(左图)，(图17C)对照和VPA处理的CD34+细胞都不形成畸胎瘤(右图)，(图17D)。染色切片的显微照片呈现出三个不同的胚层(小箭头-外胚层，实心箭头-中胚层，和间断箭头-内胚层)(4倍)，(图17E)中胚层(软骨)(4倍)、(图17F)色素性外胚层(20倍)，和(图17G)内胚层(20倍)。每个组利用3只小鼠，包括ES(H9)、对照和VPA(n＝9只小鼠)。

图18示出CD34+、CD34+CD90+和CD34+CD90+CD184+细胞的绝对数目的结果：将CB-CD34+细胞用VPA处理7天并且在冷冻保存前和冷冻保存后(5周)进行表型分析。ns＝不显著。(n＝2)。

图19A-C示出VPA扩增的HSC产物含有如通过表型所限定的所有种类的HSC。对VPA扩增的CD34+细胞分析CD34+CD90-CD49f-快速(R-SRC)、CD34+CD90+CD49f-中间(IT-SRC)和CD34+CD90+CD49+长(LT-SRC)(n＝3)。

图20A-B是示出HDACI对从ALDH+CD34+和ALDH-CD34+细胞产生的BFU-E+CFU混合物的绝对数目的影响的曲线图：如下文实施例中所述将用CA、VPA、SCR或C433处理的CD34+细胞用Aldefluor和CD34单克隆抗体染色并且在第7天分选。在SF培养物中，相比于SC培养物，在每一种HDACI存在下产生的ALDH+CD34+细胞产生远远更大数目的BFU-E+CFU混合物(ANOVA，p＝0.001)。相比之下，在SC培养物中，相比于SF培养物，从ALDH-CD34+细胞产生更大数目的BFU-E+CFU混合物。平均值±SE，ANOVA，p＝0.01(n＝3)。

发明详述

本发明涉及源自人脐带血的分离和扩增的干细胞的富集群体、其离体扩增，和涉及向受试者施用所述分离和扩增的干细胞的富集群体的治疗方法。根据本发明，有可能通过在不含血清的培养基中和在组蛋白脱乙酰酶抑制剂存在下离体培养造血干细胞以实现表达特定表型的干细胞的独特群体来扩增造血干细胞。

根据一个方面，本发明涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体。所述扩增的干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD49f+、CD117+、ALDH+，但贫乏地表达CD45RA(即是CD45RA-)，并且表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

造血干细胞是多能(multipotent或pluripotent)细胞，这允许它们分化成所有谱系的血细胞并且能够在维持其多能性(multipotency或pluripotency)的同时本身再生。

本发明的富集和扩增的干细胞是从人分离的并且源自人脐带血。

本发明的富集群体的干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD49f+、CD117+和CD45RA-。CD34+、CD90+、CD184+、CD49f+、CD117+是指在细胞表面上表达(+)CD(分化簇)34、90、184、49f和117抗原。这些抗原是造血干细胞的标志物。CD45RA-是指在细胞表面上不(或贫乏地)表达抗原CD45RA。本发明的干细胞群体富集干细胞标志物CD34+、CD90+、CD184+、CD49f+、CD117+和CD45RA-并表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

可以例如通过使用通过使糖尿病小鼠与免疫缺陷小鼠杂交获得的NOD/SCID小鼠来进行用于测试具有骨髓重建能力的人造血干细胞的存在的实验程序。通过这种测定检测的细胞被称为SCID重建细胞(SRC)并且视为与人造血干细胞最接近。

在本发明的干细胞群体中的干细胞被称为扩增的干细胞，这意味着在培养后造血干细胞的数目大于培养前，或换另一种方式，在培养后的干细胞数目大于从脐带血样本获取的细胞数目。

在一个实施方案中，本发明的干细胞的富集群体是仅含有或主要含有由来自脐带血分离物的造血干细胞的自我更新产生的造血干细胞的干细胞群体。从分离的造血干细胞分化的造血祖细胞或含有造血干细胞和造血祖细胞的细胞群体也可存在于富集群体中。然而，在一个实施方案中，富集群体中的造血祖细胞的数目小于造血干细胞的数目。例如，在实验结果中，在7天后VPA处理的细胞主要含有CD34+CD90+(74.2±9.8％)细胞，其中其余细胞为血型糖蛋白+(17.0±5.4％)、CD41+(8.9±2.0％)、CD14+(3.9±1.5％)，几乎没有T细胞(CD3-0.2±0.3％)和B细胞(CD19-0.5±0.1％)。扩增的移植物由原始小幼单核细胞与无颗粒的细胞质和明显核仁的均质群体组成。

在一个实施方案中，所述富集群体包含原始小幼单核细胞与无颗粒的细胞质和明显核仁的均质群体。

造血干细胞的扩增进一步是指造血干细胞的分化以增加具有上述表型的造血干细胞的绝对数目。在一个实施方案中，富集群体中至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％或26％的干细胞处于G2/M期。可选地，富集群体中约18.0％±1.2％或约17-19％的干细胞处于G2/M期。在另一个实施方案中，富集群体中至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％或37％的干细胞处于G0/G1期。可选地，富集群体中约23.2％±13.8％或约20-26％的干细胞处于G0/G1期。

本发明的富集群体的干细胞具有表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的额外特性。在一个实施方案中，富集群体中至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的干细胞表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

根据一个实施方案，干细胞的富集群体的干细胞不显示胚胎干细胞多能性基因hTERT的表达水平的任何上调。

在一个实施方案中，本发明的富集群体中的干细胞对于醛脱氢酶活性呈阳性。特定地，本发明的富集群体中的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的干细胞对于醛脱氢酶活性呈阳性。

本发明的干细胞的富集群体可与选自SCF、Flt3、TPO、IL3的细胞因子和这些细胞因子的组合接触。

另外，富集群体的干细胞可与组蛋白脱乙酰酶抑制剂接触。合适的组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括(但不限于)VPA、SCR、LBH589、TSA、SAHA、Cay10433(C433)(也称为BML-210)和Cay10298。

本发明的富集和扩增群体中的干细胞相比于不与组蛋白脱乙酰酶抑制剂接触的分离和扩增的人脐带血干细胞具有降低的HDAC1、HDAC3和HDAC5表达。

本发明的干细胞的富集群体不含T细胞和B细胞。例如，在本发明的一个实施方案中，富集群体主要含有CD34+CD90+、CD41+和CD14+细胞，基本上没有T细胞和B细胞。例如，富集群体可含有约64-84％CD34+CD90+细胞、约12-23％血型糖蛋白(GPA)+细胞、约7-11％CD41+细胞、约2.5-5.5％CD14+细胞、约0-0.5％T细胞(CD19+)和0.4-0.6％B细胞(CD3+)。在一个实施方案中，扩增的干细胞几乎不含T细胞和B细胞并且含有有限数目的单核细胞(CD14)。

根据一个实施方案，本发明的干细胞的富集群体在HDACI存在下培养约7天后含有以下表型标志物：约64-84％、65-83％、66-82％、67-81％、68-80％、69-79％、70-78％、71-77％、72-76％、73-75％或74％CD34+CD90+细胞；约12-23％、13-22％、14-21％、15-20％、16-19％或17-18％血型糖蛋白(GPA)+细胞；约7-11％、8-10％或9％CD41+细胞；约2.5-5.5％、3-5％或4％CD14+细胞；约0-0.5％CD19+细胞；和约0.4-0.6％CD3+细胞。

本发明的富集和扩增群体中的干细胞可被冷冻保存以供未来使用。冷冻保存方法讨论于Berz等,“CryopreservationofHematopoieticStemCells,”Am.J.Hematol.82(6):463-472(2007)中，所述文献特此以全文引用的方式并入。

本发明的另一个方面涉及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。这种方法涉及提供人脐带血干细胞的分离群体并且在有效产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的条件下在不含血清的培养体系中在组蛋白脱乙酰酶抑制剂存在下处理人脐带血干细胞的分离群体。扩增的人脐带血干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA-并且表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。

在本发明的这个方面的一个实施方案中，在不含血清的培养体系中并且在组蛋白脱乙酰酶抑制剂存在下处理人脐带血干细胞的分离群体以增加干细胞的绝对数目。例如，可进行所述方法以使干细胞(CD34+CD90+)的绝对数目扩增约2.0×10⁴倍。

通过本发明的方法获得的分离和扩增的干细胞的富集群体中的干细胞具有上述扩增干细胞的富集群体的特性。

在进行本发明的方法时，培养体系可包括通常用于动物细胞培养的培养容器如Petri培养皿、烧瓶、塑料袋、Teflon^TM袋，其可能具有或可能不具有利用细胞外基质或细胞粘附分子的初步涂层。当使用时，用于这种涂层的材料可为胶原蛋白I至XIX、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病因子、骨桥蛋白、血纤蛋白原、各种类型的弹性蛋白、各种类型的蛋白多糖、各种类型的钙粘蛋白、桥粒芯粘着蛋白(desmocolin)、桥粒芯蛋白(desmoglein)、各种类型的整合素、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、Matrigel、聚D-赖氨酸、聚L-赖氨酸、壳多糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻酸凝胶和/或水凝胶或其片段。这种涂层材料可为具有人工修饰的氨基酸序列的重组材料。所述造血干细胞可通过使用可以机械地控制培养基组成、pH等并获得高密度培养物的生物反应器来培养(参见Schwartz,“RapidMediumPerfusionRateSignificantlyIncreasestheProductivityandLongevityofHumanBoneMarrowCultures,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:6760(1991)；Koller,“Clinical-scaleHumanUmbilicalCordBloodCellExpansionInaNovelAutomatedPerfusionCultureSystem,”BoneMarrowTransplant21:653(1998)；Koller,“Large-scaleExpansionofHumanStemandProgenitorCellsfromBoneMarrowMononuclearCellsinContinuousPerfusionCultures,”Blood82:378(1993)，其特此以全文引用的方式并入)。

虽然培养体系是不含血清的，但可使用各种营养素来提供干细胞的足够生长和扩增条件。合适的营养素培养基包括(但不限于)达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco'sModifiedEagles'Medium，DMEM)、Ham营养素混合物F12、McCoy5A培养基、伊格尔最低必需培养基(Eagles'MinimumEssentialMedium，EMEM)、αMEM培养基(α改良伊格尔最低必需培养基)、RPMI1640培养基、Iscove改良达尔伯克氏培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium，IMDM)、StemPro34(Invitrogen)、X-VIVO10(Cambrex)、X-VIVO15(Cambrex)、HPGM(Cambrex)、StemSpanH3000(StemcellTechnologies)、StemSpanSFEM(StemcellTechnologies)、StemlineII(Sigma-Aldrich)或QBSF-60(QualityBiological)。

适于培养的培养基可含有钠、钾、钙、镁、磷、氯、氨基酸、维生素、细胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖类等。在培养中，根据情况需要，其他化学组分或生物组分可单独地或组合地并入。有待添加在培养基中的这些组分可包括胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白、甲基纤维素、各种细胞因子、各种生长因子等。合适的细胞因子可包括(但不限于)白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-14(IL-14)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OM)、促红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)。

特别合适的细胞因子包括SCF、Flt3、TPO、IL-3和其组合。

有待添加至培养体系的合适的生长因子可包括(但不限于)转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、蛋白酶连接蛋白I、蛋白酶连接蛋白II、血小板衍生生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(例如δ1)、Wnt蛋白、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5或7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)和多效蛋白(Pleiotrophin)。

另外，具有人工修饰氨基酸序列的重组细胞因子或生长因子可包括在培养体系中并且可包括例如并且不限于IL-6/可溶性IL-6受体复合物和HyperIL-6(IL-6/可溶性IL-6受体融合蛋白)。

在一个实施方案中，细胞因子和生长因子可以约0.1ng/mL至1000ng/mL、优选地1ng/mL至100ng/mL的浓度添加至培养体系。

在根据本发明的这个方面的方法培养干细胞时，补充剂或处理剂可直接添加至培养体系或者例如固定在用于培养的底物或支撑物的表面上。这可能通过以下发生：溶解用于适当溶剂中的组分，用所得溶液涂布底物或支撑物，并且然后洗出过量组分。

当向培养体系添加特定组分时，首先可将其溶解在适当溶剂中并添加至培养基中以使得化合物的浓度将为约100nM至10mM、或约300nM至300μM、或约1μM至100μM、或约3μM至30μM。合适的溶剂的实例包括(但不限于)二甲亚砜(DMSO)和各种醇。

在一个实施方案中，在约25至39℃、或约33至39℃的温度下，在CO₂浓度为约4至10体积％、或约4至6体积％的气氛中，在培养体系中处理造血干细胞，通常持续约7天的时期。

在组蛋白脱乙酰酶抑制剂的存在下处理根据本发明的这个方面的方法处理的干细胞，其实例描述于上文。

通过本发明的方法扩增的造血干细胞可用作细胞移植物。因此，本发明的另一个方面涉及治疗受试者的血液病症的方法。这种方法涉及向所述受试者施用本发明的分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体来治疗所述受试者的血液病症。

因为造血干细胞可以分化成所有谱系的血细胞，所以它们可在离体分化成特定类型的血细胞后移植。通过本发明的方法扩增的造血干细胞可原样移植，或者在例如通过磁珠方法或通过细胞分选方法使用细胞表面抗原作为指标富集后移植。扩增的造血干细胞可移植至其供体(自体)或另一个体(同种异体)。

本发明的富集和扩增的造血干细胞可以用作替代常规骨髓或脐带血移植的造血干细胞疗法的移植物。以与常规的骨髓或脐带血移植相同的方式进行本发明的造血干细胞的移植。移植物可为含有缓冲溶液、抗生素、药物化合物以及富集和扩增的造血干细胞的组合物。

进行本发明的这个方面的方法来治疗受试者的血液病症。因此，所述方法不仅适合治疗各种类型的白血病，而且适合治疗各种疾病。例如，在通过化学疗法或放射疗法治疗固体癌症患者的情况下，所述化学疗法或放射疗法可造成骨髓抑制作为副作用，如果在治疗后施用至患者，则所述患者可从造血损伤中迅速恢复。因此，更强烈的化学治疗变得可用，具有改进的治疗作用。

还可进行本发明的治疗方法以通过将造血干细胞分化成特定类型的血细胞并且使其返回患者中来减轻患者中的特定类型的血细胞不足。

可进行本发明的治疗方法来治疗与造血细胞降低和/或造血机能不全相关的疾病，伴随着造血细胞增加的疾病，伴随着造血功能障碍、免疫细胞减少、免疫细胞增加的疾病，伴随着自身免疫或免疫功能低下的疾病，与神经损伤相关的疾病，伴随着肌肉损伤的疾病，和/或局部缺血性疾病。

适于根据本发明的这种方法治疗的疾病或病症的特定实例包括(但不限于)慢性肉芽肿病、重症联合免疫缺陷综合征、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、Chediak-Higashi综合征、免疫缺陷综合征如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、C3缺乏症、先天性贫血如地中海贫血、由于酶缺乏造成的溶血性贫血和镰状细胞性贫血、溶酶体贮积病如高雪氏病(Gaucher'sdisease)和粘多糖病、肾上腺脑白质营养不良、各种癌症和肿瘤，特别是血液癌症如急性或慢性白血病、Fanconi综合征、再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、淋巴细胞减少症、血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、Kasabach-Merritt综合征、恶性淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、多发性骨髓瘤、慢性肝病、肾功能衰竭、库存血液或在操作期间的大量输血、乙型肝炎、丙型肝炎、重症感染、全身性红斑狼疮、关节性风湿病、干皮性骨化病、全身性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎、混合性结缔组织疾病、结节性多动脉炎、桥本氏病(Hashimoto'sdisease)、巴塞多氏病(Basedow'sdisease)、重症肌无力、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、蛇咬伤、溶血性尿毒症综合征、脾功能亢进、出血、Bernard-Soulier综合征、Glanzmann血小板无力症、尿毒症、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多、红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓增生性疾病、创伤性脊髓损伤、神经损伤、神经断裂、骨骼肌损伤、瘢痕、糖尿病、脑梗塞、心肌梗塞和阻塞性动脉硬化。

可进行本发明的治疗方法以减轻辐射曝露或过度曝露的不良影响，包括急性放射综合征(ARS)。

在本发明的治疗方法的另一个实施方案中，本发明的富集和扩增的造血干细胞用于基因疗法。在基因疗法中，将治疗性基因转染至造血干细胞中，并且将所得转染细胞(即，转化的造血干细胞)移植至患者中。根据所治疗的疾病，有待转染的治疗性基因可包括(但不限于)激素、细胞因子、受体、酶、多肽等的基因。合适的治疗基因的特定实例包括(但不限于)胰岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧基肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶A2、酯酶、α1抗胰蛋白酶、凝血因子(VII、VIII、IX等)、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶、UDP葡糖醛酸基转移酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、血红蛋白、NADPH氧化酶、普通脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、α-艾杜糖醛酸酶、细胞色素P450酶、腺苷脱氨酶、布鲁顿激酶、补体C1至C4、JAK3、共同细胞因子受体γ链、毛细血管扩张性共济失调突变基因(ATM)、囊性纤维化(CF)、肌纤蛋白、胸腺体液因子、胸腺生成素、胃泌素、选择素、胆囊收缩素、血清素、P物质、主要组织相容性复合物(MHC)和多药耐药性因子(MDR-1)的基因。

另外，抑制疾病基因表达的RNA基因可有效作为治疗性基因并且可用于本发明的方法中。例如，反义RNA、siRNA、shRNA、诱饵RNA和核糖酶。

对于将治疗性基因转移至造血干细胞中，可使用对于动物细胞的普通基因转移方法，包括用于动物细胞的载体例如反转录病毒载体如鼠类干细胞载体(MSCV)和Moloney鼠类白血病病毒(MmoLV)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒载体和慢病毒载体(参见Verma,“GeneTherapy:Promises,ProblemsandProspects,”Nature389:239(1997)，其特此以全文引用的方式并入)。可选地，可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、脂质体方法、脂质转染、显微注射等。在这些程序中，反转录病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体通常是优选的，因为预期它们整合至染色体DNA中允许基因的永久表达。

在一个实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体如下是优选的。细胞首先用通过将治疗性基因插入野生型腺相关病毒DNA的两个末端的ITR(反向末端重复序列)之间而获得的载体质粒和用于补充病毒蛋白的辅助质粒转染并且随后感染作为辅助病毒的腺病毒以诱导含有AAV载体的病毒粒子的产生。并非腺病毒，用于表达充当辅助者的腺病毒基因的质粒可被转染。接着，用病毒粒子感染造血干细胞。优选在载体DNA中的靶基因上游插入适当启动子、增强子、绝缘子等以调节基因的表达。除治疗性基因之外引入标记基因如药物抗性基因使得容易选择带有治疗性基因的细胞。所述治疗性基因可为有义基因或反义基因。

当利用用于本发明的治疗方法中的治疗性基因转染本发明的造血干细胞时，通过如上文所讨论的适当方法来培养细胞以扩增造血干细胞。可通过本领域中的标准方法评估基因转移效率。可将基因转染至造血干细胞中，通过扩增造血干细胞的上述方法扩增所得细胞(转化的造血干细胞)，并使用所得转化的造血干细胞以在基因治疗方法中施用至受试者。

用于基因疗法的移植物可为含有缓冲溶液、抗生素、药物和转化的造血干细胞的组合物。

可通过根据本发明的方法的基因疗法治疗的合适的疾病包括(但不限于)慢性肉芽肿病、重症联合免疫缺陷综合征、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、Chediak-Higashi综合征、免疫缺陷综合征如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、乙型肝炎、丙型肝炎、先天性贫血如地中海贫血、由于酶缺乏造成的溶血性贫血、Fanconi贫血和镰状细胞性贫血、溶酶体贮积病如高雪氏病和粘多糖病、肾上腺脑白质营养不良，和各种癌症和肿瘤。

本发明的另一个方面涉及测定化合物对造血干细胞的作用的方法。这种方法涉及提供分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体，其中所述干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD49f+、CD117+、ALDH+、CD45RA-并表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3，并且使所述干细胞与待测试的化合物接触。然后在与所述化合物接触后分析所述干细胞以测定化合物对干细胞的作用。

在一个实施方案中，分析所述干细胞的细胞表面标志物，其多能性基因表达，所述细胞是活的和/或分裂的，和/或所述化合物是否对细胞致命。

实施例

提供以下实施例以说明本发明的实施方案，但绝不打算限制其范围。

实施例1-表观遗传重编程诱导脐带血干细胞的扩增

方法

CBCD34+细胞的分离和其离体培养

CB收集物购自纽约血液中心(NewYorkBloodCenter)的胎盘血计划(PlacentalBloodProgram)。通过Ficoll-Hypaque密度离心分离CB-MNC，并且通过如前所述的免疫磁性选择来纯化CD34+细胞(Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。将高度纯化的(90％-98％)PC(4.0-5.0×10⁴)在补充有150ng/mlSCF、100ng/mlfms样酪氨酸激酶受体3(FLT3配体)、100ng/ml血小板生成素(TPO)和50ng/ml白介素3(IL-3)(R&DSystems)的SFStemlineII(Sigma-Aldrich)培养基或含有30％FBS(HyCloneLaboratories)的IMDM(Lonza)中培养并且在维持在37℃与5％CO₂的加湿温育器中温育。在温育16小时后，在不存在或持续存在细胞因子的情况下，使细胞暴露于不同浓度的单独的HDACI，包括曲古抑菌素A(TSA)、辛二酰基苯胺羟肟酸(SAHA)、VPA(Sigma-Aldrich)、SCR和CAY10433(C433，也称为BML-210)、CAY10398(也称为MD85)和CAY10603(分子式：C₂₂H₃₀N₄O₆)(CaymanChemicals)，再持续7天(图1A)。通过表1列出的特定术语指代所研究的细胞群体和它们的各种培养条件。

表1.用于指代所研究的细胞群体的术语

使用台盼蓝排除法对活PC和培养细胞进行计数。如果使用所述的各种培养条件来培养原代CB收集物内的所有CD34+细胞，则基于确定存在于单独的CB收集物中的CD34+细胞的数目和已经产生的CD34+细胞的数目来计算CD34+细胞或亚群的扩增倍数。

表型分析

将在存在或不存在HDACI的情况下扩增的PC或培养细胞用抗人CD34mAb或同种型匹配对照mAb染色并使用FACSCantoII(BD)进行分析。如前所述，使用CD34+细胞分离试剂盒再次分离CD34+细胞，以用于进一步表型分析和功能分析。所有mAb购自BDBiosciencesandCellSignalingTechnology。如前所述进行离体扩增细胞在对照培养物或细胞因子加HDACI中7天后的表型分析(CD34-APC、CD90-FITC、CD184-PE、CD117-PE、CD49f-PE和CD45RA-PECy7)(Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。

迁移测定

如前所述使用6.5mm直径、5μm孔Transwell板(Costar)评估CBCD34+细胞的迁移行为(Shivtiel等,“CD45RegulatesHomingandEngraftmentofImmatureNormalandLeukemicHumanCellsinTransplantedImmunodeficientMice,”Exp.Hematol.39(12):1161-1170(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。向Transwells的下隔室填充补充有100ng/ml基质源因子1(SDF1)(R&DSystems)的StemLineIISF培养基。在37℃下向Transwell过滤器涂以Matrigel持续30分钟。将来自对照和含VPA培养物的再次分离的CD34+细胞(1×10⁵)在100μlStemlineII培养基中涂铺在涂有Matrigel的过滤器上。在16小时和48小时后，对迁移至下隔室的细胞进行计数，并且如下计算迁移百分比：(迁移细胞数目/接种细胞总数)×100。

归巢测定

如前所述进行在对照条件下或存在VPA下处理后再次分离的CD34+细胞(5×10⁵/小鼠)的归巢(Shivtiel等,“CD45RegulatesHomingandEngraftmentofImmatureNormalandLeukemicHumanCellsinTransplantedImmunodeficientMice,”Exp.Hematol.39(12):1161-1170(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。NSG接受者小鼠购自JacksonLaboratory并且在经由尾静脉输注再次分离的CD34+细胞之前以低于致死剂量照射(300cGy)4小时。在其输注后16小时和48小时，从来自每只接受者小鼠的2个大腿骨和2个胫骨收集BM细胞并通过流式细胞术使用人CD34-APCmAb分析人CD34+细胞的存在。通过在接受者小鼠的BM中定量每10⁶个获取事件的CD34+细胞数目来测定这些细胞群体的归巢。四只小鼠不接受细胞并且类似地分析以从实验样本中减去背景(Colvin等,“AllogeneicInvivoStemCellHoming,”.J.Cell.Physiol.211(2):386-391(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。八只NSG小鼠接受在对照条件下培养的CD34+细胞，并且10只小鼠接受来自含VPA培养物的CD34+细胞。

通过BrdU标记进行细胞周期分析

使用FITC-BrdU试剂盒(BDPharmingen)根据制造商的说明书评估培养的CD34+CD90+细胞的细胞周期状态。在VPA存在下在对照条件下培养7天的CBCD34+细胞随后用BrdU脉冲2.5小时。然后将细胞用染色缓冲液(PBS加3％FBS)洗涤并用CD34-APC和CD90-PEmAb染色，固定并用Cytofix/Cytoperm缓冲液渗透化，并且用Perm/洗涤缓冲液(都来自BDPharmingen)洗涤。在渗透化后，在37℃下将细胞用30μgDNA酶处理30分钟，然后用FITC缀合的抗BrdU抗体和7AAD染色。然后使用FAC-SCantoII流式细胞仪利用FACSDiva软件(BDBiosciences)记录CD34+CD90+门控细胞的细胞周期状态。

HDACI对HDAC的影响

从新鲜分离的CB-MNC和在SCR(8μM)、C433(80μM)和VPA(1.25mM)存在下培养的人胚胎肾293(HEK293)细胞制备全细胞提取物。通过SDS-PAGE使用Novex(Invitrogen)分离细胞蛋白并通过iBlot(Invitrogen)转移。将膜用针对单独的组蛋白脱乙酰酶(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6和β-肌动蛋白；CellSignalingTechnology)的mAb探测并且使用具有HRP缀合的二抗的化学发光系统(AmershamBiosciences)根据制造商的说明书显色。利用ImageJ软件(NIH)进行蛋白质印迹的密度测量分析。

基于ALDH活性的原始细胞分离

增加的ALDH活性是原始造血细胞和癌症干细胞的特征(Hess等,FunctionalCharacterizationofHighlyPurifiedHumanHematopoieticRepopulatingCellsIsolatedAccordingtoAldehydeDehydrogenaseActivity,”Blood104:1648-1655(2004)；Lioznov等,“AldehydeDehydrogenaseActivityasaMarkerfortheQualityofHematopoieticStemCellTransplants,”BoneMarrowTransplant35:909-914(2005)；Storms等,“DistinctHematopoieticProgenitorCompartmentsareDelineatedbytheExpressionofAldehydeDehydrogenaseandCD34,”Blood106:95-102(2005)；Aguila等,“SALL4isaRobustStimulatorfortheExpansionofHematopoieticStemCells,”Blood118:576-585(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。为了鉴定具有高ALDH活性的细胞群体，根据制造商的说明书使用Aldefluor试剂盒(StemCellTechnologiesInc.)。将细胞(1×10⁶/ml)悬浮在测定缓冲液中，然后将一半细胞添加至Aldefluor底物(测试样本)并且将剩余一半添加至DEAB抑制剂(对照样本)。将测试和对照样本在37℃下温育40分钟。随后再将细胞用CD34-APC和/或CD117-PEmAb或同种型匹配IgG染色20分钟。利用BDFACSCantoII流式细胞仪洗涤和分析细胞。

多能性基因的qPCR

使用TRIzol和来自QIAGEN,CA的RNeasy试剂盒从人ES细胞系H9(WA09；WiCellResearchInstituteInc.,Madison,Wisconsin,USA)、PC、来自对照培养物或在SF和SC培养基中含有VPA的培养物的再次分离的CD34+细胞提取总RNA。使用RNA至cDNAEcoDryPremix试剂盒(Clontech)将总RNA(0.5-1.0μg)反转录为cDNA。引物序列列于表6中。使用SYBRGreen(ThermoFisherScientific)和Realplex热循环仪(Eppendorf)进行qPCR。一式三份地进行所有实验，并且在每个测定中包括非模板对照(缺乏cDNA模板)。GAPDH充当内标。扩增子在具有50bp大小(DNA梯级)分子量标记的2％琼脂糖凝胶上进行电泳。

表6.用于RT-PCR和Q-PCR的引物序列

*Redshaw和Strain,“HumanhaematopoieticStemCellsexpressOct4pseudogenesandlacktheabilitytoinitiateOct4promoter-drivengeneexpression,”J.Negat.ResultsBiomed.9:2-8(2010)，其特此以全文引用的方式并入。

免疫荧光染色

将PC和来自对照培养物和含有VPA的培养物的再次分离的培养CD34+细胞用不含甲醇的甲醛(2.8％)在37℃下固定10分钟，在冰上短暂冷冻，并且用100％冰冷甲醇渗透化。将细胞在冰上再温育20分钟并且用温育缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)阻断10分钟并在室温下用FITC缀合的mAb或同种型对照对SOX2和OCT4染色一小时。细胞也依次用NANOG的兔mAb和FITC缀合的抗兔二抗染色，并且通过流式细胞术洗涤并分析细胞。

将PC和来自对照培养物和含VPA的培养物的再次分离的细胞沉积在载玻片上，用甲醛固定，并且根据制造商的说明书(CellSignalingTechnology)用针对SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的抗体染色。表达SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的ES细胞充当阳性对照。使用LeicaTCSSP5(Wetzlar)和z系列进行共焦显微术分析。利用LASAF成像软件获取图像。

NANOG和OCT4的共IP

将用VPA处理7天的ES细胞和CD34+细胞裂解在RIPA缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1％Triton、0.1％NP40和1.5mMEDTA)中。将来自ES或VPA处理细胞的细胞裂解物(1.0mg)与6μg的IgG(对照)、20μl(6μg)的NANOGpAb(目录AF1997；R&DSystems)一起温育并且在4℃下在滚转平台上操作过夜。第二天添加蛋白G珠粒(50μl)(CellSignalingTechnology)，并且将样本再持续旋滚转4小时。将所述珠粒用裂解缓冲液洗涤三次，并且通过使珠粒沸腾来洗脱结合蛋白。来自ES处理细胞(25μg)和VPA处理细胞(125μg)的总细胞裂解物通过SDS-PAGE分馏并通过蛋白质印迹使用NANOGmAB(CellSignalingTechnology)分析。来自IP实验的蛋白通过SDS-PAGE分离，使用iBlot(Invitrogen)转移，用山羊pAb抗OCT4进行免疫印迹，洗涤，并使用ECL检测试剂盒显色。

多能性基因的siRNA介导的沉默

在SF培养条件下用VPA处理CBCD34+细胞。将VPA处理的细胞用单独的SOX2、OCT4、NANOG、GAPDH和乱序siRNA或用SOX2、OCT4和NANOGSilencerSelectsiRNA(Invitrogen,CA)的组合转染。根据制造商关于Neon转染系统的说明书(Invitrogen)纳入GFP质粒以测定转染效率。

在VPA处理72小时后，将细胞(0.5×10⁶至1×10⁶)在PBS中洗涤并且悬浮在8μl的Neon再悬浮缓冲液R中。根据制造商的说明书将单独的siRNA(2μl，10-30nM)或SOX2、OCT4、NANOG的组合(SON)或pcDNA6.2/EmGFP质粒(200ng；Invitrogen)与8μl细胞混合。将细胞用1,400的电压和20ms的宽度脉冲三次并且立即转移至补充有细胞因子加VPA的预温热培养基。使用台盼蓝排除法在转染48小时后评估细胞活力。

另外，使用人CD34和CD90mAb将用乱序或组合SONsiRNA处理的细胞染色，并且通过流式细胞术分析测定CD34+和CD34+CD90+细胞的百分比。在转染7天后制备RNA，并且使用SYBRGreen法对于如上所述的SOX2、OCT4、NANOG、ZIC3、CD34和GAPDHmRNA进行qPCR。将相对表达水平标准化为CD34表达。通过如上所述的共焦显微术评估在SONsiRNA介导的多能性基因敲低后的SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3蛋白质表达水平。

离体扩增的CBCD34+细胞的体内骨髓重建潜能的测定

如前所述，在输注PC(2×10⁵)之前将NSG小鼠用300cGy以低于致死剂量照射4小时，并且将在对照条件下或在存在或不存在细胞因子的情况下含有VPA的培养物中培养一周后再次分离的CD34+细胞经由尾静脉注射至NSG小鼠中(Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Araki等,“ExpansionofHumanUmbilicalCordBloodSCID-RepopulatingCellsUsingChromatin-ModifyingAgents,”Exp.Hematol.34:140-149(2006)；Araki等,“Chromatin-ModifyingAgentsPermitHumanHematopoieticStemCellstoUndergoMultipleCellDivisionsWhileRetainingTheirRepopulatingPotential,”Blood109:3570-3578(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。在移植后第13-14周将小鼠处死。对于来自每只小鼠的BM细胞分析表达人CD45-PECy7或APC、CD34-APC或FITC、CD36-APC、CD33-PECy7、CD14-FITC、CD19-PE、CD41-FITC、CD71-FITC和血型糖蛋白A-PE(GPA-PE)的细胞的存在。至少0.1％人CD45+细胞在每只接受者小鼠的骨髓中的存在被视为指示供体人造血细胞植入(Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Araki等,“ExpansionofHumanUmbilicalCordBloodSCID-RepopulatingCellsUsingChromatin-ModifyingAgents,”Exp.Hematol.34:140-149(2006)；Araki等,“Chromatin-ModifyingAgentsPermitHumanHematopoieticStemCellstoUndergoMultipleCellDivisionsWhileRetainingTheirRepopulatingPotential,”Blood109:3570-3578(2007)；Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。将来自原代NSG接受者小鼠的BM细胞(2×10⁶)再次输注至以低于致死剂量照射的二代NSG接受者小鼠。在移植后第15-16周将小鼠处死，并且将BM细胞用mAb染色并通过流式细胞术分析如上所述的人细胞嵌合性证据。

有限稀释分析

通过如前所述的有限稀释分析来分析在PC和在对照条件下或在VPA存在下扩增的相等数目的CD34+细胞的后代中的人SRC的频率(Boitano等,“ArylHydrocarbonReceptorAntagonistsPromotetheExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”Science329:1345-1348(2010)，其特此以全文引用的方式并入)。将增加数目的PC(50、250、500、2,500、5,000)或用VPA培养7天或在对照条件下培养的相等数目的PC的后代输注至NSG小鼠(n＝111)。将来自有限稀释实验的数据汇集并通过向单击模型(n＝111)应用Poisson统计学来分析。使用L-Calc软件(StemCellTechnologiesInc.)计算频率并使用可通过沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究生物信息学所(WalterandElizaHallBioinformaticsInstituteofMedicalResearch)获得的ELDA软件(bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)绘图。使用下式将非相应值的log分数转化为阴性小鼠的百分比：阴性小鼠的百分比＝elog分数。

用于畸胎瘤形成的测定

将从对照培养物或含有VPA的培养物再次分离的CD34+细胞(1×10⁶)或类似数目的ES细胞悬浮在100μlPBS中。将这些细胞与相等体积的冰冷Matrigel混合并且皮下注射至每组三只NSG小鼠的右后肢(来自对照培养物、VPA处理培养物的再次分离的CD34+细胞，和ES细胞)。每周对小鼠观察畸胎瘤形成并在8周后处死。将畸胎瘤解剖，固定，切片，并用H&E染色并且进行形态检查(O'Connor等,“FunctionalAssaysforHumanEmbryonicStemCellPluripotency,”MethodsMolBiol.690:67-80(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。

统计学

结果以不同数目的单独实验的平均值±SD或平均值±SEM表示。除非另外说明，否则使用学生双尾t检验评估统计学差异。此外使用通过Tukey检验和/或Bartlett检验对于等方差性进行逐对比较和通过F检验进行方差比较进行单因素ANOVA。小于或等于0.05的P值被视为显著的。

研究批准

所有动物研究都由伊坎医学院动物护理和使用委员会(animalcareandusecommitteeoftheIcahnSchoolofMedicine)批准。这项研究不需要知情同意书或受试者批准，因为低体积的不可鉴定的CB单元购自纽约血液中心(NewYorkBloodCenter)。

结果

HDACI和SF培养基对CBCD34⁺和CD34⁺CD90⁺细胞的离体扩增的影响

限定允许HSC的离体扩增的培养条件已成为众多研究的主题(Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“StrategiestoEnhanceUmbilicalCordBloodStemCellEngraftmentinAdultPatients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010)；Boitano等,“ArylHydrocarbonReceptorAntagonistsPromotetheExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”Science329:1345-1348(2010)；DeFelice等,“HistoneDeacetylaseInhibitorValproicAcidEnhancestheCytokine-InducedExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”CancerRes.65:1505-1513(2005)；Himburg等,“PleiotrophinRegulatestheExpansionandRegenerationofHematopoieticStemCells,”Nat.Med.16:475-482(2010)；Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Nishino等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemCellsbyaSmall-MoleculeAgonistofc-MPL,”Exp.Hematol.37:1364-1377e1364.(2009)；North等,“ProstaglandinE2RegulatesVertebrateHaematopoieticStemCellHomeostasis,”Nature447:1007-1011(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。先前表明，可以使用SC培养条件和利用DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTI)和HDACI进行依序处理来进行CBHSC数目的有限扩增(Milhem等,“ModificationofHematopoieticStemCellFateby5aza2'deoxycytidineandTrichostatinA,”Blood103:4102-4110(2004)；Araki等,“ExpansionofHumanUmbilicalCordBloodSCID-RepopulatingCellsUsingChromatin-ModifyingAgents,”Exp.Hematol.34:140-149(2006)；Araki等,“Chromatin-ModifyingAgentsPermitHumanHematopoieticStemCellstoUndergoMultipleCellDivisionsWhileRetainingTheirRepopulatingPotential,”Blood109:3570-3578(2007)；Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。为了进一步优化将另外促进CBHSC扩增的培养条件，首先评估CD34+的产生，并且在补充有细胞因子的SF和SC培养物中的CD34+CD90+细胞在此处被称为对照条件。用于扩增CBCD34+细胞的离体扩增策略的示意图和用于指代所研究的细胞群体的术语提供于图1A和表1中。以不同剂量和温育时间(5-9天)添加多种HDACI(VPA、scriptaid[SCR]、曲古抑菌素A[TSA]、辛二酰基苯胺羟肟酸[SAHA]、CAY10433(也称为BML-210)[C433]、CAY10398(也称为MD85)和CAY10603[分子式：C22H30N4O6])。评估其增加在SC或SF培养条件下体外产生的CD34⁺细胞数目的能力。在所研究的八种HDACI中，显示用VPA、SCR和C433处理7天对于这个目的最有效。相比于对照条件(16.2％±9.2％)，用这些试剂中的每一种进行处理导致产生类似百分比的CD34+CD90+细胞(SCR：73.4％±13.9％，C433：70.1％±18.4％，和VPA：75.2％±10.7％)(ANOVA，P<0.0001)。然而，如果细胞维持超过7天，则所述百分比逐步下降。类似地，已发现，相比于对照条件，这些HDACI中的每一种可有效产生更大绝对数目的CD34+和CD34+CD90+细胞/CB收集物(ANOVA，P≤0.0007)(图1B和图1C)以及促进CD34+CD90+细胞的CXCR4表达(CD184)并且产生更大绝对数目的CD34+CD90+CD184+细胞(ANOVA，P<0.0001)(图1D)。当在最佳和半最佳浓度下组合时，VPA、SCR和C433的作用不具加和性。

更仔细地研究了血清对于HDACI促进CD34+细胞扩增的能力的影响。使用SF对照培养条件导致CD34+和CD34+CD90+细胞数目相比于利用SC对照培养条件实现的细胞数目的更大扩增(分别地，ANOVA，P<0.0001)(图2A)。相比于存在VPA的SC条件(CD34+细胞扩增78倍和CD34+90+细胞扩增89倍；ANOVA，P≤0.005)，在SF条件下，添加VPA导致CD34+细胞(213倍)和CD34+90+细胞(20,202倍)的数目急剧增加(图2A)。

通过分析CD34+CD90+VPA处理细胞表达白血球共同抗原CD45RA和整合素α6(CD49f)的同种型来检查VPA扩增的CD34+细胞的更仔细的表型分析。人HSC已显示表达CD49f而非CD45RA(Notta等,“IsolationofSingleHumanHematopoieticStemCellsCapableofLong-TermMultilineageEngraftment,”Science333(6039):218-221(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。在图2B中，证实47.0％±4.4％的来自含有VPA的培养物的CD34+CD90+细胞表达CD49f，而少数这些细胞表达CD45RA(1.9％±2.1％)。

由于CXCR4/SDF1轴对于HSC归巢是关键的(Gul等,“ValproicAcidIncreasesCXCR4ExpressioninHematopoieticStem/ProgenitorCellsbyChromatinRemodeling,”StemCellsDev.18:831-838(2009)，其特此以全文引用的方式并入)，因此检查VPA处理的CD34+细胞响应于SDF1的迁移。如图3A中可见，显著更大数目的用VPA处理的CD34+细胞在16小时和48小时后响应于SDF1而迁移(P＝0.01和P＝0.03)。接着检查在VPA处理后CD34+细胞的CXCR4表达的上调是否与这些细胞向NOD/SCID/γcnull(NSG)小鼠的骨髓的归巢增加相关。如图3B中所示，VPA处理导致CD34+细胞相比于在对照条件下培养的CD34+细胞在输注后16小时(P<0.0001)和48小时(P＝0.01)的归巢增加。接着通过在培养第7天用BrdU标记对照培养物和含有VPA的培养物(2.5小时)内的细胞后代来检查所培养CD34+细胞的细胞周期状态并且比较处于细胞周期的不同阶段的CD34+CD90+细胞的比例(图4A)。已发现，用VPA处理的细胞相比于对照培养物含有远远更大比例的CD34+CD90+细胞(75.2％±10.7％对比16.2％±9.2％)。另外，相比于对照培养物中的细胞(2.2％±1.0％，P<0.0001)，更大数目的VPA处理的CD34+CD90+细胞处于G2/M(18.0％±1.2％)，这表明VPA处理的CD34+CD90+细胞持续分裂并保持其原始表型，从而造成在第7天观察到更大数目的CD34+CD90+细胞。相比于对照培养物(5.0％±1.4％)中可见，在含VPA培养物中的CD34+CD90+G0/G1细胞隔室也增加(23.2％±13.8％)，这表明暴露于VPA的CD34+CD90+细胞能够恢复为G0/G1。此外，在培养7天后，相比于含VPA培养物中的CD34+CD90+细胞，较小比例的来自对照培养物的CD34+CD90+细胞在S期(17.5％±1.8％对比29.4％±7.9％)(图4B)。这些数据表明，在培养期内对照细胞相比于VPA处理的细胞更早地分裂，其持续分裂并在第7天产生CD34+CD90+细胞。为了确定VPA的作用是否取决于持续暴露于细胞因子，CBCD34+细胞经历初始激活持续16小时并且然后在仅SF培养基中或在补充有VPA、但不存在其他细胞因子的SF培养基中培养7天(图1A)。这些研究表明，在用细胞因子初始激活后，在仅SF培养基(无细胞因子(图5A))中温育后发生CD34+和CD34+90+细胞的扩增。然而，当在仅VPA存在下(无细胞因子)培养细胞时，相比于PC，产生甚至更大绝对数目的CD34+(P<0.0001)和CD34+CD90+细胞(P<0.05)(图5A)。然而，在最初未激活并且然后在不存在其他细胞因子的情况下温育的培养物中未出现CD34+细胞的这种相同程度的扩增，这表明CD34+和CD34+CD90+细胞数目扩增对于至少之前暴露于细胞因子的依赖性。第7天，21.2％±5.1％的仅在培养基(无细胞因子)中培养的细胞是CD34+，并且其表型与PC的表型类似，而仅暴露于VPA的细胞的特征为CD90、CD184和CD49f而非CD45RA的急剧上调(图14)，这种研究结果与VPA一致，导致表观遗传重编程。当在仅培养基(无细胞因子)中培养时，每个CB收集物的CD34+和CD34+CD90+细胞数目经历5.2倍和144倍扩增，相比之下，在仅含有VPA(无细胞因子)的培养物中，分别为9.0倍和486倍扩增(ANOVA，P<0.0001)(图5B)。通过在7天温育期内向含VPA的SF培养物添加细胞因子，CD34+(213倍)和CD34+CD90+(20,202倍)细胞的扩增程度甚至更急剧增强(图2A)。

HDACI对HDAC水平的影响

HDAC存在于细胞中作为多蛋白复合物的亚基并且管控基因表达。I类HDAC(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)与酵母转录调控子RPD3具有序列同源性。然而，II类HDAC(HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10)共有与酵母中存在的脱乙酰酶HDA1类似的结构域(Delcuve等,“RolesofHistoneDeacetylasesinEpigeneticRegulation:EmergingParadigmsfromStudieswithInhibitors,”Clin.Epigenetics4(1):5(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。I类和II类HDAC与转录共抑制因子mSIN3、NCoR和SMRT相互作用，其募集HDAC至转录因子(Delcuve等,“RolesofHistoneDeacetylasesinEpigeneticRegulation:EmergingParadigmsfromStudieswithInhibitors,”Clin.Epigenetics4(1):5(2012)；Kramer等,“TheHistoneDeacetylaseInhibitorValproicAcidSelectivelyInducesProteasomalDegradationofHDAC2,”EMBOJ.22:3411-3420(2003)，其特此以全文引用的方式并入)。HDACI先前已显示导致CBCD34+细胞中的H3乙酰化增加(Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。然而，不仅可以通过在催化结构域结合这些抑制剂，而且可以通过经由泛素/蛋白酶体途径实现HDAC的精细调节降解来调节HDAC活性。已报道，有限量的E2泛素结合酶Ubc8和E3泛素连接酶RLIM维持易于通过VPA调节的HDAC的平衡稳态蛋白质水平(Kramer等,“TheHistoneDeacetylaseInhibitorValproicAcidSelectivelyInducesProteasomalDegradationofHDAC2,”EMBOJ.22:3411-3420(2003)；Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Cunliffe,“EloquentSilence:DevelopmentalFunctionsofClassIHistoneDeacetylases,”Curr.Opin.Genet.Dev.18(5):404-410(2008)，其特此以全文引用的方式并入)。为了确定哪些HDAC受HDACI影响，在处理2小时和24小时后在CB单核细胞(CB-MNC)和人胚胎肾293(HEK293)细胞中评估SCR、C433和VPA对I类和II类HDAC蛋白质水平的影响。在CB-MNC处理2小时后，SCR、C433和VPA不抑制HDAC表达，但导致在处理24小时后不同程度的I类HDAC(HDAC1、HDAC2和HDAC3)、IIa类HDAC(HDAC4和HDAC5)和IIb类(HDAC6)HDAC的抑制。SCR和C433是每一种HDAC的最有效抑制剂(图6和表7)。

表7.蛋白质印迹的密度测定分析

上表：通过密度测定评估HDAC蛋白质水平并且标准化为b-肌动蛋白表达。下表：I类和II类HDAC相对于对照的下调百分比。在每种HDACI存在下发生HDAC1、HDAC3和HDAC5的降低。(平均值±SE，n＝4)。

由于单独的HDAC在调节胞内过程和响应于细胞特定功能中的胞外环境中起到关键作用，因此预测特定细胞类型将响应于给定HDACI的方式的能力是有限的(Delcuve等,“RolesofHistoneDeacetylasesinEpigeneticRegulation:EmergingParadigmsfromStudieswithInhibitors,”Clin.Epigenetics4(1):5(2012)；Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Kouzarides,“ChromatinModificationsandTheirFunction,”Cell128:693-705(2007)；Oh等,“ConciseReview:MultidimensionalRegulationoftheHematopoieticStemCellState,”StemCells30:82-88(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。已发现，在用这些HDACI处理HEK293细胞后的HDAC抑制模式显著不同于CB-MNC的，并且在处理2小时后相比于24小时更明显(图15)。HDAC2和HDAC4的下调对于三种HDACI中的每一种对HEK293细胞的影响是共同的，而HDAC1、HDAC3和HDAC5的降低对于用相同试剂处理的CB-MNC是共同的。这些研究结果表明，SCR、C433和VPA各自是I类和II类HDACI，但其对于特定HDAC的作用根据所处理的细胞类型而改变。先前已显示，HDAC3的下调对于体外HSC扩增是必要的(Elizalde等,“HistoneDeacetylase3ModulatestheExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”StemCellsDev.21:2581-2591(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。所检查的每种HDACI能够扩增CBCD34+细胞数目，但是VPA在促进CD34+细胞扩增方面是最有效的化合物，而不是最有效的HDAC抑制剂。利用VPA进行其余实验。

VPA改变培养的CBCD34+细胞中的ALDH活性

由于在体外用细胞因子扩增的CB和骨髓细胞的表型并不总是与功能相关，因此使用ALDH活性作为HSC的功能标志物(Hess等,FunctionalCharacterizationofHighlyPurifiedHumanHematopoieticRepopulatingCellsIsolatedAccordingtoAldehydeDehydrogenaseActivity,”Blood104:1648-1655(2004)；Lioznov等,“AldehydeDehydrogenaseActivityasaMarkerfortheQualityofHematopoieticStemCellTransplants,”BoneMarrowTransplant35:909-914(2005)；Spangrude等,“Long-TermRepopulationofIrradiatedMicewithLimitingNumbersofPurifiedHematopoieticStemCells:InvivoExpansionofStemCellPhenotypebutnotFunction,”Blood85(4):1006-1016(1995)；Storms等,“DistinctHematopoieticProgenitorCompartmentsareDelineatedbytheExpressionofAldehydeDehydrogenaseandCD34,”Blood106:95-102(2005)；Veeraputhiran等,“AldehydeDehydrogenaseasanAlternativetoEnumerationofTotalandViableCD34(+)CellsinAutologousHematopoieticProgenitorCellTransplantation,”Cytotherapy13:1256-1258(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。在SF培养物中培养的细胞中相比于在细胞因子存在下在SC培养物中培养的细胞中观察到更高比率的具有ALDH活性的细胞。此外，在SF培养条件下向含有细胞因子的培养物中添加VPA导致相比于在SC培养物中所观察到的甚至更高比例的ALDH+细胞(图7A和表2)。

表2.ALDH+、ALDH+CD34+和ALDH+CD34+CD117+细胞的频率

在对照条件下或在SF或SC培养基中含有VPA的培养物中培养PC。相比于在SC培养物中所观察，向SF培养物中添加VPA导致在CD34+和CD34+CD117+细胞中更大程度的ALDH活性。每个值代表具有特定表型的细胞的百分比。平均值±SEM。^AP≤0.007。ANOVA，P<0.0001。n＝3-5。

在SF培养物加VPA中产生的ALDH⁺CD34⁺CD117⁺细胞的绝对数目大于在SC培养物中所达到的绝对数目(P＝0.009)(图7B)。

VPA影响与多能性相关的基因的表达

转录因子SOX2、OCT4和NANOG是通过共同占据靶基因(包括其启动子)而确定胚胎和诱导多能干细胞(iPS)命运决定的核心调节因子，从而在维持自我更新和多能性所需的调节和自动调节反馈回路中协作(Boyer等,“CoreTranscriptionalRegulatoryCircuitryinHumanEmbryonicStemCells,”Cell122:947-956(2005)；Loh等,“TheOct4andNanogTranscriptionNetworkRegulatesPluripotencyinMouseEmbryonicStemCells,”Nat.Genet.38(4):431-440(2006)，其特此以全文引用的方式并入)。通过检查在对照条件下培养7天后再次分离的CD34+细胞或在SF和SC培养基中用VPA处理的那些CD34+细胞中的SOX2、OCT4和NANOG表达来探索这些主要转录因子在VPA介导的HSC扩增中的作用。RT-PCR揭示SOX2、OCT4和NANOG转录物在来自含VPA的SF培养物的CD34+细胞中的表达，而在对照培养物或添加有VPA的SC培养物中几乎不能检测到OCT4和SOX2转录物(图8A)。定量PCR(qPCR)证实，相比于在SC培养物中所观察到的，在SF培养物中在VPA存在下这些多能性基因的表达上调(ANOVA，P＝0.0001)(图8B)。其他人已经报道了如下可能性：在成人干细胞中的OCT4表达实际上是由于非活性假基因的表达而非OCT4的功能形式(Redshaw等,“HumanHaematopoieticStemCellsExpressOct4PseudogenesandLacktheAbilitytoInitiateOct4Promoter-DrivenGeneExpression,”J.Negat.ResultsBiomed.9(1):2-8(2010)；Zangrossi等,“Oct-4ExpressioninAdultHumanDifferentiatedCellsChallengesitsRoleasaPureStemCellMarker,”StemCells25:1675-1680(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。使用RT-PCR，已发现一种OCT4假基因不存在于VPA处理的CD34+细胞中(图8A)。qPCR分析表明，这两种假基因转录物都不存在。不同于OCT4、SOX2和NANOG，在VPA处理的CD34+细胞中，端粒酶反转录酶(hTERT)(ES细胞中的另一种已知多能性标志物)(Takahashi等,“InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors,”Cell131:861-872(2007)，其特此以全文引用的方式并入)不上调。检查了SOX2、OCT4和NANOG的下游靶基因，包括SET、SMARCAD1和MYST3，其在染色质重塑中起到关键作用，以及另外的多能性基因ZIC3(Boyer等,“CoreTranscriptionalRegulatoryCircuitryinHumanEmbryonicStemCells,”Cell122:947-956(2005)；Takahashi等,“InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors,”Cell131:861-872(2007)；Lim等,“Zic3isRequiredforMaintenanceofPluripotencyinEmbryonicStemCells,”Mol.Biol.Cell18:1348-1358(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。SMARCAD1、MYST3和ZIC3而非SET在于SF培养物中的经VPA处理的CD34+细胞中也急剧上调(ANOVA，P＝0.04)。在血清存在下在补充有VPA的对照培养物中未检测到ZIC3mRNA，而仅在补充有VPA的SF培养物中上调(图8C)。ZIC3基因已鉴定为ES细胞中的OCT4、SOX2和NANOG的靶标。与OCT4、NANOG和SOX2转录网络重叠的ZIC3在维持多能性方面是重要的，并且可以直接调节NANOG的表达(Boyer等,“CoreTranscriptionalRegulatoryCircuitryinHumanEmbryonicStemCells,”Cell122:947-956(2005)；Lim等,“Zic3isRequiredforMaintenanceofPluripotencyinEmbryonicStemCells,”Mol.Biol.Cell18:1348-1358(2007)；Declercq等,“Zic3EnhancestheGenerationofMouseInducedPluripotentStemCells,”StemCellsDev.(2013)，其特此以全文引用的方式并入)。

然后通过流式细胞术分析研究SOX2、OCT4和NANOG蛋白在CD34+细胞中的表达。在SF培养物中，而非在SC培养物中，在VPA存在下，SOX2、OCT4和NANOG表达最佳(图9A和表3)。然后使用mAb染色和共焦显微术研究SOX2、OCT4和NANOG蛋白在CD34+细胞中的表达(图9B和图16)。多能性基因上调并且定位于VPA处理的CD34+细胞中的细胞核和细胞质，而在ES细胞中，这些蛋白质主要定位于亚核区域。虽然在对照条件下或在PC中产生的CD34+细胞中未观察到这些蛋白，但在PC中观察到低水平的ZIC3蛋白。OCT4和SOX2是主要转录因子，其结合于NANOG启动子并促进其转录和相关基因网络的转录(Boyer等,“CoreTranscriptionalRegulatoryCircuitryinHumanEmbryonicStemCells,”Cell122:947-956(2005)；Loh等,“TheOct4andNanogTranscriptionNetworkRegulatesPluripotencyinMouseEmbryonicStemCells,”Nat.Genet.38(4):431-440(2006)，其特此以全文引用的方式并入)。在SF而非SC培养物中，用VPA处理导致NANOG上调，这表明SOX2与OCT4之间可能的功能相互作用(表3)。

表3.多能性基因的表达

在从对照培养物和在SF和SC培养基中用VPA处理7天的培养物中再次分离的CD34+细胞(纯度：95％-99％)中，通过mAb染色和流式细胞术分析来评估SOX2、OCT4和NANOG的表达。每个数字代表表达特定多能性蛋白的CD34+细胞的百分比。平均值±SEM。^AP<0.05。ANOVA，P<0.0001。n＝4。

然后通过来自VPA处理细胞的蛋白质的共IP来证明NANOG与OCT4之间的物理相互作用(图9C)。此外，蛋白质印迹分析揭示，相比于在ES细胞中，在VPA处理细胞中的内源性OCT4和NANOG的表达不太丰富(图9C)。

多能性基因是CD34+CD90+细胞扩增所必需的

为了建立在VPA处理培养物中的多能性基因上调与CD34+CD90+细胞扩增之间的功能联系，将CD34+细胞用单独的siRNA或用针对SOX2、OCT4和NANOG(SON)的siRNA的组合汇集物转染。最初，测试不同浓度的siRNA的单独基因和其在对照培养物或用VPA处理的培养物中对细胞的潜在毒性作用。相比于用乱序siRNA处理的细胞，用SONsiRNA处理的细胞的形态外观无改变。未观察到在用乱序、SON和GAPDHsiRNA转染后在对照培养物和含VPA培养物中产生的细胞总数显著降低(表8)。使用qPCR和RT-PCR监测在VPA处理培养物中siRNA转染后的多能性基因表达(图10A和图10B)。siRNA介导的基因敲低导致SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3的转录物表达显著降低(80％-84％)(ANOVA，P<0.0001)。共焦显微术和mAb染色也揭示SOX2、OCT4和NANOG蛋白表达显著降低。OCT4、SOX2和NANOG调节网络下游的ZIC3蛋白表达降低至更小程度(图10C)。相比于对每个多能性基因具有特异性的单独siRNA或相比于乱序siRNA，在用SONsiRNA处理后观察到CD34+(47.8％±4.4％对比22.8％±8.6％)和CD34+CD90+(20.5％±6.1％对比11.7％±4.5％)(ANOVA，P＝0.0005)细胞的百分比显著降低(图10D)。此外，在用SONsiRNA处理经VPA处理的CD34+细胞后，观察到每个CB收集物的CD34+和CD34+CD90+细胞的绝对数目分别降低89.1％和88.7％(ANOVA，P＝0.0008)(图10E)。

这些数据表明，VPA处理导致所培养CD34+细胞的表观遗传重编程，其指导多能性基因的后续转录激活，这对于在SF培养物中产生CD34+和CD34+CD90+细胞是必需的。

表8.siRNA转染对对照培养物和VPA处理培养物的影响

上表：如先前关于VPA培养物所述用siRNA转染对照培养物。在用乱序和SONsiRNA转染后72小时后观察到CD34+CD90+细胞的总细胞数和百分比无显著差异。(n＝4)(*p≤0.5，ns)

下表：如先前在方法章节中所述用乱序和GAPDHsiRNA转染VPA处理的培养物。在GAPDHsiRNA转染后在72小时观察到CD34+CD90+细胞的细胞数或百分比无显著差异。(n＝3)(*p<0.25，ns)

VPA处理的CD34⁺细胞在NSG小鼠中的体内功能行为

PC和在对照条件下和在VPA和细胞因子存在下培养的CBCD34+细胞的骨髓重建潜能通过评估其在NSG接受者小鼠的骨髓内的植入来评估。在所有接受者小鼠中，与所移植的移植物类型无关，检测到人CD45+和CD45+CD34+细胞。在移植后13周至14周(图11A和图11B)，在接受PC的小鼠中19.4％±4.9％的骨髓细胞是供体源CD45+细胞，相比于在接受来自对照培养物的细胞的小鼠中是13.2％±6.4％。相比之下，相比于对照细胞所达到的结果，VPA处理的CBCD34+细胞的移植导致更大程度的人CD45+细胞嵌合性(32.2％±11.3％)和CD45+CD34+细胞(13.0％±8.7％)(分别地P＝0.0008和P＝0.004)(图11A和图11B)。CD45+细胞与VPA移植物的嵌合性程度也在统计学上大于利用PC所达到的嵌合性程度(P＝0.006)。

相比于接受PC或在对照条件下扩增的移植物的小鼠的骨髓，在接受VPA处理的CD34+细胞的小鼠的骨髓内的显著更大数目的供体源CD34+细胞共表达CD184(9.9％±9.6％)(ANOVA，P＝0.01)(图11C)。在移植后分化成多种造血谱系的VPA处理的CD34+细胞移植物的模式显著不同于在PC或在对照条件下扩增的细胞中的模式(ANOVA，P<0.0001)(图11D和图11E)，其中在接受VPA处理的移植物的小鼠中出现更高比例的CD41+、CD19+和血型糖蛋白A阳性(GPA+)细胞。

接着在其产生期间评估VPA介导的SRC扩增对于持续暴露于细胞因子的依赖性。如图11F中可见，在仅培养基(无细胞因子)中在不存在细胞因子的情况下和在仅存在VPA(无细胞因子)的情况下培养的CD34+细胞的移植实现类似程度的嵌合性(8.2％±5.0％对比12.5％±5.0％；P＝0.1，NS)。在不存在持续细胞因子暴露的情况下产生的移植物保留产生属于多种造血谱系的细胞的能力(表9)。

表9.在NOD/SCID/yc^null(NSG)小鼠中在不存在细胞因子的不含血清(SF)条件下培养的VPA处理的CD34+细胞的体内功能行为

接受2.0×105个原代CBCD34+细胞(PC)或从仅含有培养基(无细胞因子)的培养物和仅含有VPA(无细胞因子)的培养物在不含血清(SF)条件下培养7天后再次分离的CD34+细胞的NSG小鼠的骨髓分析。示出在移植12-13周后的人细胞嵌合性(CD45+、CD33+和CD34+)和多谱系造血细胞植入(包括B细胞(CD19+)、粒细胞(CD14+)、红系细胞(血型糖蛋白A(GPA+))和巨核细胞(CD41+))的百分比。(平均值±SE，*p<0.05，(ANOVA，P<0.0001)。NSG小鼠接受者(n＝15)。

在对照条件下培养的细胞移植所达到的供体细胞嵌合性程度与在仅培养基(无细胞因子)或仅VPA(无细胞因子)中在整个7天时期内不暴露于细胞因子的细胞所达到的供体细胞嵌合性程度类似。然而，在细胞因子加VPA存在下产生的移植物移植后观察到人细胞嵌合性程度的急剧增加(32.3±10.2％；ANOVA，P<0.0001)。这些数据表明，如果PC用细胞因子激活仅16小时并且然后在仅培养基中或在仅存在VPA下在不存在细胞因子的情况下培养，则SRC持续。然而，细胞因子在整个培养期内的存在进一步增强VPA的有效性，从而导致在NSG接受者中的更高程度的人细胞嵌合性。

通过将原代接受者中存在的供体源细胞移植到二代接受者中来评估所扩增的移植物的自我更新潜能。在15至16周后，用来自已经移植有用VPA处理的CBCD34+细胞的原代接受者的骨髓细胞移植的二代接受者达到最大程度的人CD45+细胞嵌合性(ANOVA，P<0.0001)(图12A)。如图12B中所示，二代接受者小鼠中的供体源细胞属于多种造血谱系，并且这种模式不同于在接受来自原代接受者的骨髓细胞的二代接受者中所观察到的模式，所述原代接受者接受PC移植物或在对照条件下扩增的移植物(ANOVA，P<0.0001)。供体源红系细胞植入程度在来自接受VPA处理移植物的小鼠的骨髓细胞的二代接受者中尤其显著(图12B)(Sauvageau等,“InvitroandInvivoExpansionofHematopoieticStemCells,”Oncogene23:7223-7232(2004)，其特此以全文引用的方式并入)。接受VPA处理的移植物的骨髓细胞的原代或二代接受者都未产生血癌迹象或患上畸胎瘤。为了进一步排除畸胎瘤形成的可能性，将从对照培养物或含VPA的培养物再次分离的CD34+细胞或者ES细胞各自皮下注射至NSG小鼠的后肢并且在8周后评估。仅在注射有ES细胞的动物中观察到由源自三个不同胚层的细胞构成的畸胎瘤(图17)。

为了评估在VPA处理后多能性基因上调的持久性，在原代和二代接受者NSG小鼠中评估这些基因在供体细胞中的表达。使用qPCR，未检测到多能性基因的转录物，包括原代和二代接受者的骨髓细胞中的SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3，表明VPA诱导的上调是短暂的。

为了评估利用VPA处理实现的HSC扩增的程度，使用有限稀释分析来比较SRC在PC中、在源自在对照条件下培养的相等数目的PC的细胞中或在含有VPA的培养物中的频率。增加数目的PC(50、250、500、2,500和5,000)或来自在对照条件下和在存在VPA下处理后的相等数目的PC的细胞的后代的移植导致人细胞在其移植后的嵌合性程度增加(图13A)。Poisson分布分析揭示，在PC中的SRC频率为1/1,115(95％CI:1/596至1/2,087)，在对照培养物中为1/9,223(95％CI:1/3,419至1/24,879)，和在用VPA处理的培养物中为1/31(95％CI:1/14至1/66)。PC、对照和含VPA的培养物之间的干细胞频率的总差异非常显著(P＝9.42×10-29)，这表明相比于PC或对照培养物，在VPA培养物内的SRC数目有效扩增(图13B和表4和表5)。

表4.在NSG小鼠中的人细胞植入的有限稀释分析

在NSG小鼠的BM中存在的SRC的频率的汇总。将PC和在对照条件下或在存在VPA下培养7天的相等数目的PC的后代移植到NSG小鼠中。在12至13周后，分析BM的人CD45+细胞植入。

计算出在1×10⁶个PC和在对照条件下培养的细胞中分别存在897个SRC和108个SRC。相比之下，计算出在来自含VPA的培养物的1×10⁶个细胞中存在32,258个SRC(表5)。因此，在对照培养条件下温育PC导致SRC数目降低，而VPA处理导致SRC数目相比于在PC中增加36倍(P≤0.002)并且SRC数目相比于在对照条件下培养的细胞中增加299倍(P≤0.002)(图13C)。

表5.SRC的频率

通过应用来自表4中提供的数据的Poisson统计来测定SRC的频率(来自STEMCELLTechnologies的L-Calc软件和ELDA软件)。包括PC、对照和VPA的任何群组之间的干细胞频率的总体差异(^AP＝9.42×10^-29)。

讨论

可以通过HSC染色质结构和表观遗传可塑性的动态维持造成HSC的多能性质。染色质结构的修饰主要由组蛋白的特定翻译后修饰调节，这决定了所得染色质结构是容许的还是抑制的(Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Kouzarides,“ChromatinModificationsandTheirFunction,”Cell128:693-705(2007)；Oh等,“ConciseReview:MultidimensionalRegulationoftheHematopoieticStemCellState,”StemCells30:82-88(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。CBCD34+细胞在使用SC培养条件和细胞因子组合体外培养后导致的干细胞功能的进行性损失仍然是可移植HSC的数目的体外扩增的障碍(Giebel等,“PrimitiveHumanHematopoieticCellsGiveRisetoDifferentiallySpecifiedDaughterCellsUpontheirInitialCellDivision,”Blood107(5):2146-2152(2006)；Ho等,“TheBeautyofAsymmetry:AsymmetricDivisionsandSelf-RenewalintheHaematopoieticSystem,”Curr.Opin.Hematol.14(4):330-336(2007)；Huang等,“SymmetryofInitialCellDivisionsAmongPrimitiveHematopoieticProgenitorsIsIndependentofOntogenicAgeandRegulatoryMolecules,”Blood94(8):2595-2604(1999)；Srour等,“ModulationofInvitroProliferationKineticsandPrimitiveHematopoieticPotentialofIndividualHumanCD34+CD38–/loCellsinG0,”Blood105(8):3109-3116(2005)，其特此以全文引用的方式并入)。干细胞功能的这种下降可能是由于从宿主内存在的容许性环境中除去完全功能性HSC和其安置在敌对离体环境中，这导致了改变决定干细胞的关键功能(包括自我更新潜能、骨髓重建能力和多谱系分化能力)的基因表达程序的表观遗传修饰。HSC功能的这种损失已被归因于响应于所用的培养条件而发生的快速细胞周期和细胞分裂(Declercq等,“Zic3EnhancestheGenerationofMouseInducedPluripotentStemCells,”StemCellsDev.(2013)；Sauvageau等,“InvitroandInvivoExpansionofHematopoieticStemCells,”Oncogene23:7223-7232(2004)；Walasek等,“HematopoieticStemCellExpansion:ChallengesandOpportunities,”Ann.NYAcad.Sci.1266:138-150(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。先前在离体干细胞扩增方面的尝试已经获得了有限的成功，这可能部分由于它们专注于创造与造血微环境类似并且从而有利于保持干细胞功能完整性的环境(Dahlberg等,“ExvivoExpansionofHumanHematopoieticStemandProgenitorCells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“CordBloodGraftEngineering,”Biol.BloodMarrowTransplant19(1):S74-S78(2013)；Delaney等,“StrategiestoEnhanceUmbilicalCordBloodStemCellEngraftmentinAdultPatients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010)，其特此以全文引用的方式并入)。了解到建立这种离体微环境的难度；已经采取了使用影响染色质结构的药剂来尝试直接维持HSC的表观遗传特性的可选方法。这种方法是基于如下理解：染色质状态的动态变化是通过核小体重构、DNA甲基化和组蛋白乙酰化来介导的(Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Kouzarides,“ChromatinModificationsandTheirFunction,”Cell128:693-705(2007)；Oh等,“ConciseReview:MultidimensionalRegulationoftheHematopoieticStemCellState,”StemCells30:82-88(2012)；Elizalde等,“HistoneDeacetylase3ModulatestheExpansionofHumanHematopoieticStemCells,”StemCellsDev.21:2581-2591(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。为此目的，在这项研究中，评估了能够抑制I类和II类HDAC的若干HDACI，目的在于实现带有参与维持在反复的细胞分裂后的干细胞功能的基因的染色质结构的解凝。HDAC1、HDAC3和HDAC5蛋白通过三种最具活性的HDACI而均匀降低，这表明这三种HDAC的组合在有利于维持体外分裂后的干细胞功能的干细胞命运决定方面起关键作用。

先前已报道，HDACI处理导致H3组蛋白乙酰化增加(Chaurasia等,“Chromatin-ModifyingAgentsPromotetheExvivoProductionofFunctionalHumanErythroidProgenitorCells,”Blood117:4632-4641(2011)，其特此以全文引用的方式并入)，而其他人已指出暴露于这些试剂导致抑制性修饰的损失，其通过结合至HDAC和/或通过促进DNA脱甲基化和核小体的滑动和/或位移(这可允许转录因子结合至相关DNA)，或通过多泛素化(其导致特定HDAC的蛋白酶体降解)来实现(Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Kouzarides,“ChromatinModificationsandTheirFunction,”Cell128:693-705(2007)；Oh等,“ConciseReview:MultidimensionalRegulationoftheHematopoieticStemCellState,”StemCells30:82-88(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。这些相互作用允许募集形成转录机制所需的其他共激活子和/或组蛋白修饰酶，从而导致转录激活(Cedar等,“EpigeneticsofHaematopoieticCellDevelopment,”Nat.Rev.Immunol.11:478-488(2011)；Kouzarides,“ChromatinModificationsandTheirFunction,”Cell128:693-705(2007)；Oh等,“ConciseReview:MultidimensionalRegulationoftheHematopoieticStemCellState,”StemCells30:82-88(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。此处报道，在所评估的所有HDACI中，在其移植到原代和二代NSG小鼠中之后，在产生能够产生最大程度的人细胞嵌合性的细胞方面，VPA是最有效的。VPA处理导致相比于PC，SRC频率增加36倍，同时保持HSC的高增殖潜能和多谱系分化能力特征。显示使用SF而非SC培养条件对于产生功能性HSC的努力是关键的。在SF培养条件下的VPA处理导致相比于在SC条件下的VPA处理产生20,202倍更大数目的CD34+CD90+细胞。这些研究结果表明，血清含有抑制或压制在功能性HSC的保持和/或扩增中所涉及的调节基因的因子并且血清的存在有利于在定型和分化中所涉及到的基因的上调。这些研究结果与由Hirai和同事报道的研究结果显著类似，后者示出通过改变培养基的组成和转导细胞接种在饲养层上的密度来急剧提高产生iPS细胞的效率(Hirai等,“EfficientiPSCellProductionwiththeMyoDTransactivationDomaininSerum-FreeCulture,”PLoSOne7(3):e34149(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。此外已显示，在SF培养条件下的VPA处理导致较高比率的分裂CD34+CD90+细胞在温育7天后的持续分裂，从而造成CD34+CD90+细胞数目的扩增。这些研究结果表明，VPA处理导致CD34+CD90+细胞甚至在7天培养期内持续分裂的能力保持。然而，这种特性在更长期的温育时期后失去，这有可能指示离体干细胞限定基因表达程序在所用条件下的短暂保持。使用SF条件和VPA处理产生的CBCD34+细胞的原始性质在这项研究中得到进一步证明：更大程度的CD184和整合素α6(CD49f)表达，缺乏CD45RA表达，和增加程度的ALDH活性。CXCR4的表达增加特别重要，因为CXCR4与其配体SDF1的相互作用在干细胞移植物向移植接受者的骨髓归巢方面起到关键的作用(Motabi等,“AdvancesinStemCellMobilization,”BloodRev.26(6):267-278(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。

上调的CD184在VPA处理的CD34+细胞中的功能性在这项研究中通过以下证明：这些细胞响应于SDF1而在体外迁移的能力和相比于来自对照培养物的CD34+细胞在更大程度上归巢至NSG小鼠的骨髓的能力。因此，VPA处理的CBCD34+细胞的增强的骨髓重建潜能可以归因于其不仅对HSC产生的影响，而且对促进HSC归巢至接受者小鼠的骨髓的影响。已发现，VPA处理的CD34+细胞也具有以下特征：多能性相关基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3而非hTERT的上调。VPA处理的CD34+细胞的这些特性是iPS细胞和ES细胞的特征并且先前不与正常HSC相关。这些多能性基因(SOX2、OCT4和NANOG)的基因敲低表明VPA损害CD34+CD90+细胞的离体产生。另外，观察到在SON处理后ZIC3的下调，这可能反映了其通过在OCT4、SOX2和NANOG下游操作而促进维持多能性(Lim等,“Zic3isRequiredforMaintenanceofPluripotencyinEmbryonicStemCells,”Mol.Biol.Cell18:1348-1358(2007)；Declercq等,“Zic3EnhancestheGenerationofMouseInducedPluripotentStemCells,”StemCellsDev.(2013)，其特此以全文引用的方式并入)。先前文件记录，其他人已经探索了OCT4存在于人肿瘤中并且已经归因于缺乏OCT4活性的OCT4假基因(Redshaw等,“HumanHaematopoieticStemCellsExpressOct4PseudogenesandLacktheAbilitytoInitiateOct4Promoter-DrivenGeneExpression,”J.Negat.ResultsBiomed.9(1):2-8(2010)；Zangrossi等,“Oct-4ExpressioninAdultHumanDifferentiatedCellsChallengesitsRoleasaPureStemCellMarker,”StemCells25:1675-1680(2007)，其特此以全文引用的方式并入)。这些假基因的转录物不能在VPA处理的细胞中检测到。NANOG与OCT4的物理相互作用通过来自VPA扩增的细胞的这些蛋白的共IP进一步证明，这与用ES细胞所观察到的类似。有趣的是，Yu和同事最近报道OCT4和SOX2促进CD49f在人间充质干细胞中表达，其提高了许多表征VPA处理的CD34+细胞的表型标志物与这些多能性基因的上调有关的可能性(Yu等,“D49fEnhancesMultipotencyandMaintainsStemnessThroughtheDirectRegulationofOCT4andSOX2,”StemCells30(5):876-887(2012)，其特此以全文引用的方式并入)。VPA处理的CBCD34+细胞没有永生化并且相比于iPS和ES细胞具有显著不同的生物特性。不同于可以在培养物中无限期保持的iPS或ES细胞，VPA处理的CD34+细胞数目在培养8天后下降。另外，VPA处理的CD34+细胞在NSG小鼠中不形成畸胎瘤，而畸胎瘤是ES和iPS细胞的特征性质。VPA处理的CD34+细胞短暂表达这些多能性基因通过其转录物在人细胞中的不存在而进一步证明，所述短暂表达在原代和二代NSG接受者小鼠中持续总共30周。这些数据表明，在VPA处理的CD34+细胞中诱导的这些多能性基因的短暂表达可能影响分裂的CBHSC的功能而不导致其永生化。

通过沿着造血细胞分化的层级添加已知影响原始细胞行为的细胞因子组合来显著影响VPA改变CBCD34+细胞的表型的能力。除非至少用细胞因子激活PC持续16小时的时期，否则HSC数目下降。如果CD34+和CD34+CD90+细胞至少用细胞因子激活然后在仅培养基(无细胞因子)或仅VPA(无细胞因子)存在下再温育7天，则仅这些细胞数目可能扩增。然而，仅在后续7天时期内在无细胞因子情况下暴露于VPA的那些细胞表达与在含有VPA和细胞因子(CD34+CD90+CD117+CD49f+CD184+CD45RA–)的培养物中所观察到的类似的HSC表型。重要的是，当在整个7天温育期内向VPA添加细胞因子时，CD34+细胞的扩增程度基本上进一步增加。显著的是，在存在和不存在细胞因子的情况下都产生的CD34+细胞在其移植到NSG小鼠中后保持建立多谱系造血的能力，这表明在激活阶段期间的短暂细胞因子暴露导致有限的增殖，其中对于血液植入保持足够的HSC功能。这些数据表明，安置HSC的离体环境部分地决定其命运并且负责其表型的HSC程序的保持是由于在SF培养基中的VPA的表观遗传重编程的结果，而细胞数目的增加是通过细胞因子暴露而促进的细胞增殖的结果。

此处报道的研究对于CB移植的临床追求具有重要意义。这篇报道中概述的方法的实施有可能使得含有足够数目的SRC的可用干细胞移植物允许成人进行同种异体CB干细胞移植而具有更有利的结果。

实施例2-HDACI对BFU-E+CFU混合物的绝对数目的影响

相比于SC培养物，使用补充有VPA的SF培养物产生的纯化ALDH+CD34+细胞产生更大绝对数目的BFU-E和CFU混合物(8.4×10⁷±6.7×10⁷/CB收集物)(1.4×10⁷±0.88×10⁷；ANOVA，p＝0.001)(图20A)。相比之下，相比于SF培养物(3.5×10⁵±0.78×10⁵)，来自补充有VPA的SC培养物的ALDH-CD34+细胞产生更大数目的BFU-E和CFU混合物(2.7×10⁶±1.0×10⁶)(ANOVA，p＝0.01)(图20B)。这些数据表明，血清差异性地影响ALDH+和ALDH-细胞群体的体外命运。

实施例3-冷冻保存对干细胞表型的影响

由于预期扩增的HSC产物将在其递送至移植中心之前被冷冻保存，因此探索了冷冻保存对表达HSC表型的活细胞的恢复的影响。将CB-CD34+细胞用VPA处理7天并且对细胞数目进行计数并且在解冻之前和之后进行表型分析。使用来自Invitrogen(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)的Synth-a-Freeze进行冷冻保存。

Synth-a-Freeze是含有10％二甲亚砜(DMSO)的限定的液体冷冻保存培养基。Synth-a-Freeze不含抗生素、抗霉菌剂、激素、生长因子、血清或蛋白质。这种介质是HEPES和碳酸氢盐缓冲的。CD34+、CD34+CD90+和CD34+CD90+CD184+细胞的百分比在冷冻保存之前和之后未显著改变(90％-95％细胞保持活性)。表达这些HSC表型的细胞的绝对数目在冷冻保存之前和之后没有差异(图18)。这些数据证实了进行扩增的HSC产物的冷冻保存而无需动物蛋白的可行性。

实施例4--VPA扩增的HSC产物含有如通过表型所限定的所有种类的HSC

已显示，VPA扩增的HSC含有增加数目的长期重建细胞。由于这些细胞表达全能细胞的特征性多能性基因，因此存在这些移植物可能与延迟植入相关的有效关注。Dick实验室已经定义了快速地和在中间时期和长期后重建NSG小鼠的HSC的层级并且已经鉴定了其表型层级特征(Notta等,“IsolationofSingleHumanHematopoieticStemCellsCapableofLong-termMultilineageEngraftment,”Science333(6039):218-221(2011)，其特此以全文引用的方式并入)。快速SCID重建细胞(R-SRC)在其移植后2-4周在NSG小鼠中检测到并且是CD34+CD90-CD49f-，中间SRC(IT-SRC)在12-14周后重建并且是CD34+CD90+CD49f-，以及长期SRC(LT-SRC)在>24周重建并且是CD34+CD90+CD49f+。在三种VPA扩增的HSC产物中评估这些多种HSC种类的分布。如图19A-C中可见，相比于原代CB-CD34+细胞，这些种类的HSC各自以增加的数目存在于VPA处理的细胞中，表明这些扩增的移植物将有可能导致更快速以及持续的植入模式以及相比于非操纵CB移植物较低的移植物失败发生率。有趣的是，在SF条件下仅在细胞因子存在下处理的CB-CD34+细胞含有最大数目的R-SRC(图19C)。这种有趣的研究结果可能是重要的，如果在第1阶段试验完成后，VPA处理的移植物的输注不与造血恢复的较短时间相关。基于这些研究结果，较小部分的原代CD34+细胞可在仅细胞因子存在下扩增并且与VPA处理的细胞产物组合以通过在更大程度上增加R-SRC的数目来促进更快速的植入。

本文所述的所有特征(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)，和/或所公开的任何方法或工艺的所有步骤，可与任何上述方面以任何组合形式组合，其中这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。