氧化水解酶基因BtLPMO10B及氧化水解酶与应用

摘要

本发明公开了一种氧化水解酶基因及其编码的氧化水解酶的制备与应用。本发明所涉及的氧化水解酶BtLPMO10B基因来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(ACCC 10066)。本发明还提供了一种制备氧化水解酶BtLPMO10B的方法，即利用基因工程的技术方法，将该酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该工程菌株表达制备的氧化水解酶BtLPMO10B对不溶性几丁质具有较强的结合能力，可氧化水解多糖物质产生具有不同聚合度的糖酸。本发明提供的氧化水解酶BtLPMO10B可辅助多糖水解酶，提高多糖的水解效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型氧化水解酶BtLPMO10B的基因序列(来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种ACCC10066)及其编码的氧化水解酶的制备方法和应用(Preparationandapplicationofanovellyticpolysaccharidemonooxygenase)。本发明还提供了该氧化水解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明涉及的氧化水解酶BtLPMO10B可应用在生物能源、绿色农业、健康食品及生物医药等领域。

背景技术

几丁质是一种主要来源于海洋虾蟹壳、昆虫外壳等的等难溶性天然多糖，几丁质的高效生物降解在生物能源、绿色农业、生物医药、材料化工等领域具有重要的意义。目前可用于几丁质生物降解的酶主要为糖苷水解酶，从其催化反应模式上又可分为三类：内切型糖苷水解酶、外切型糖苷水解酶、二糖水解酶。到目前为止，已有大量的关于这些糖苷水解酶的报道，然而由于这些难溶性天然多糖的晶体结构难以被破坏，致使糖苷水解酶的催化效率较低。2010年挪威生命科学大学的团队首次报道了一种来自粘质沙雷氏菌的几丁质氧化水解酶(SmCBP21)，该酶可催化位于几丁质糖链C1位上的氧化反应，生成具有不同聚合度的糖酸，该酶可以通过氧化破坏几丁质表面的晶体结构，辅助几丁质酶高效降解几丁质。对于该类酶的新发现和深入研究对于实现几丁质等多糖物质的生物转化具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型氧化水解酶BtLPMO10B及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型氧化水解酶BtLPMO10B的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的新型氧化水解酶BtLPMO10B基因的基因工程表达体系。

本发明的第四个目的是提供新型氧化水解酶BtLPMO10B在多糖降解中的应用。

本发明所提供的新型氧化水解酶BtLPMO10B，来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株(购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC10066)，其氨基酸序列具有如下特征之一：

1)序列表SEQIDNO.2中的氨基酸残基序列；

2)将序列表SEQIDNO.2中的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后，具有降解多糖活性的蛋白质；

3)与序列表SEQIDNO.2中所限定的氨基酸序列的同源性达到90％及以上且具有降解多糖活性的蛋白质。

本发明还提供了新型氧化水解酶BtLPMO10B的编码基因(命名为BtLPMO10B)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)具有与序列表中SEQIDNO.1所限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到90％及以上，且能编码降解多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

本发明的氧化水解酶BtLPMO10B的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的BtLPMO10B的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶BtLPMO10B的方法，是将编码基因BtLPMO10B克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的氧化水解酶。

所述的重组表达氧化水解酶BtLPMO10B的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达氧化水解酶BtLPMO10B的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的氧化水解酶BtLPMO10B对于几丁质具有较强的结合能力，可氧化水解几丁质等多糖物质，可辅助多糖水解酶提高多糖的降解效率。

本发明提供的氧化水解酶BtLPMO10B可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。

附图说明

图1：氧化水解酶BtLPMO10B的蛋白表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道1：蛋白质标识物(marker)；泳道2：发酵液上清，上样量10μl，泳道3：5μg纯化后的BtLPMO10B。

图2：氧化水解酶BtLPMO10B的底物结合实验。A为上清中未与底物结合的蛋白，电泳实验的上样量为10μL；B为沉淀中与底物结合的蛋白。1，对照(BtLPMO10B+缓冲液)；2，BtLPMO10B+α-几丁质粉末；3，BtLPMO10B+β-几丁质粉末；4，BtLPMO10B+微晶纤维素；5，BtLPMO10B+几丁质珠；6，BtLPMO10B+α-胶体几丁质。

图3：氧化水解酶BtLPMO10B的酶解产物分析。

具体实施方式

实施例1苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种的培养及其基因组DNA的提取

苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株(购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC10066)的单克隆接种到10ml液体LB培养基中，接着放入温度为30℃，转数为150rpm的摇床培养16个小时，取3ml菌液，离心收集菌体，用于基因组DNA的提取。基因组DNA的提取与纯化方法按照试剂盒说明书操作完成。

实施例2BtLPMO10B基因在大肠杆菌中的重组表达

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种ACCC10066基因组DNA为模板，用下述引物对进行PCR扩增。引物设计如下：

正向引物P-F：5’-ggaattccatatgcacggttttgttgaaaagcccggta-3’；

反向引物P-R：5’-ccgctcgagcactgttttccataatgataatgca-3’；正向引物下划线标注的是限制性内切酶NedI位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。TaqDNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30sec-50℃退火30sec-72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR产物用NdeI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产物pET-23b载体用NdeI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。NdeI和XhoI均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET-23b载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株后涂布于含有50μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养12h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/ml氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物和反向引物进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去上海英骏生物技术有限公司测序，结果表明，在pET-23b的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SEQIDNO1所示的BtLPMO10B基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。

将上述重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行氧化水解酶BtLPMO10B的诱导表达及纯化，结果如图1所示，氧化水解酶BtLPMO10B的表达量较高，且以可溶的形式存在，经过Ni柱纯化后的氧化水解酶BtLPMO10B在电泳胶上呈单一条带，分子量大小为45kDa，与通过氨基酸序列预测的分子量一致。

(1)SEQIDNo:1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1245个碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株ACCC10066

(f)与核苷酸序列相关的特征关键词:为“氧化水解酶”

(2)SEQIDNO2:的信息(参见序列表)

(a)序列特征:

*长度：415个氨基酸残基

*类型：蛋白

*结构：包含1个AA10家族氧化水解酶结构域、2个FnIII结构域和1个CBM结构域

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株ACCC10066

序列表

SEQIDNO.1

ATGCACGGTTTTGTTGAAAAGCCCGGTAGCCGATCCGCTTTATGTAGTCCAACTTATGGTGCGCTAAATGTAAACTGTGGAAGTGTTATGTATGAACCACAAAGTTTAGAAGCTCCAAAAGGGTTCCCACAAGGTGGTCCAGTAGATGGACAAATTGCTTCAGCAGGCGGAAAATTTGGTGGTATTTTAGATCAACAAACAGAAAATCGTTGGTTTAAAAATACAATCACTGGTGGGGAAAATACATTTACTTGGAAGTATACTGCGCCTCACTTAACGAGTAAGTGGCATTACTATATTACTAAAAAAGGATGGAATCCAAATAAAGCGCTAACAAGAGCAGATTTCGAACCAATTGGAACTGTACAACATGATGGTTCTGCAGCTTCAAATAATTTAACTCATAAAATCAATGTACCTACTGATCGTAGTGGATATCATGTGATTTTAGCAGTATGGGATGTAGCTGATACAGCAAATGCATTCTATAATGTAATTGATGTTAATCTTATTAATGATGTGAAACCAGACATAGAAGCACCAAGTATTCCAAATGGACTTCAGACGCAAAAAGTAACAGCGAATAGTGTAGAACTAACATGGAACGCTTCTACGGATAATGTAGGGGTAAAAGGATATCAAATCTTCCGTAACGGAGAGATGATTGATACAGTACCAGGGACTCATTTTATTGATAAGAAGTTACAACCAAGTACAGAATACTCTTATACTGTAAAAGCAATTGACGCAGCTGGCAATGTATCGACAGAAAGTACAGCGCTTACAGTAAAAACGACAGTTGAGACTCCTGATACAGAAGCACCAACACAACCAAAAGGATTACATAGTATGGGAACGACAGCGTCAAGTGTGGATTTAATGTGGAGTCCATCTGACGATAATATTGGTGTAGACCATTATGATATTTATAGAGAAACAGAAGGATCAATGAAAAAGATTGCAACATCCAATACAACTTCTTATTTGGATAAAAATCTGCTCGCTAATACTACTTATAAATATGTAGTGAAAGCTGTTGATGTAGCTGGAAATGAATCCGTACAGAGTGATATATTCACAATTACTACAAAAACCGAAAGCGCTTCATATGAAGCGTGGGATGCAAAAAAAGCATATAAAAAGGGAGATAGAGTTCTACACGAAGGAAAAGTATATGAAGCAGTCCAGAGTTATCAAGGAAATGGTGATCCAAACTGGATATTTATGCATTATCATTATGGAAAACAGTG

SEQIDNO.2

MHGFVEKPGSRSALCSSTYGALNVNCGSVMYEPQSLEAPKGFPQGGPVDGQIASAGGKFGGILDQQTANRWFKNTITGGENTFTWKYTAPHLTSKWHYYITKKGWNPNKALTRADFEPIGTVQHDGSAASNNLTHKINIPTDRSGYHVILAVWDVADTANAFYNVIDVNLINDVKPDIEAPSIPNGLQTQKVTANSVELTWNASTDNVGVKGYQIFRNGEMIDTVLGTHFIDKKLQPSTEYSYTVKAIDSAGNVSKESTALTVKTTDEIPDTEAPTQPKGLHSMGTTASSVDLMWSPSDDNIGVDHYDIYRETEGSMKKIATSNTTSYMDKNLLANTTYKYVVKAVDVAGNESVQSDIFTITTKTESASYEAWDAKKAYKKGDRVLHEGKVYEAVQSYQGNGDPNWIYALSLWKTV

实施例3氧化水解酶BtLPMO10B的生化特性分析

(1)多糖结合能力分析

氧化水解酶BtLPMO10B与各种多糖的结合实验按以下条件进行：在1.5ml的Eppendorf管中将5mg各种不同多糖与0.5mg纯化后的氧化水解酶BtLPMO10B混合，反应终体积通过20mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液定容为1ml。酶与底物的结合在室温下进行24小时，为了让酶与多糖更好的结合，利用DH-II旋转混合仪(宁波新芝公司)。结束后，通过离心分别收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE电泳检测。结果如图2所示，氧化水解酶BtLPMO10B与非晶体性质的几丁质(几丁质珠和胶体几丁质)具有较强的结合能力，而与晶体几丁质(α-几丁质和β-几丁质)结合能力较弱，与微晶纤维素的结合能力几乎无法观测到。

(2)酶反应产物分析

为了分析酶反应产物，将氧化水解酶BtLPMO10B(1μM)，抗坏血酸(1mM)和胶体几丁质(2.0mg/ml)混合在一起，反应总体积通过pH8.0,20mMTris-HCl缓冲液定容为1ml。反应在30℃进行24h。产物通过MALTITOF/TOFMS进行分析(如图3)。结果表明氧化水解酶BtLPMO10B能氧化水解胶体几丁质，产生聚合度为4-7的糖酸。