一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法

摘要

本发明公开了一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法，其步骤：1）硝基苯降解菌接入LB培养基中扩大培养，离心获得菌株；2）用海藻酸钠?聚乙烯醇?火山岩包埋获得固定化的硝基苯降解菌小球；3）活化固定化小球：将硝基苯降解菌小球从冰箱中取出，无机盐培养基洗涤，并浸泡在无机盐培养基中，曝气以活化固定化小球；4）固定化降解菌的降解性能研究：将固定化小球置于不同理化条件及不同底物浓度的硝基苯溶液中，进行硝基苯降解研究。该发明具有工艺简单、生产成本低、易于在工业上应用、提高菌株降解能力、稳定性较好及使用寿命长等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方。 通过该固定化方法菌株的降解底物浓度明显提高，菌株可降解的理化条件范围得到拓宽。

背景技术

硝基苯（Nitrobenzene，NB）作为许多化工原料的中间体，被广泛用于生产染料、润 滑油、杀虫剂和化工原料苯胺等。由于其化学结构的特点使其难以降解，硝基苯也具有较强 的生物毒性。基于这些特性，硝基苯已被我国列为水中优先控制污染物。硝基苯污染来源主 要包括含硝基苯工业废水的排放及运输过程中的泄露。硝基苯降解及去除方法包括物理、 化学和生物方法，生物方法相对于物理化学方法兼具经济及环境效益，研究硝基苯的生物 降解具有重要意义，微生物降解是生物降解一个重要方向。

微生物降解往往会受到环境条件及硝基苯浓度的限制，而在工业生产产生的废水 则常伴随高盐度和酸碱度，因此需要提高微生物的耐受能力。固定化微生物技术是在20世 纪70年从固定化酶技术发展起来的一项技术，自20世纪80年代以来，固定化微生物技术在 废水污染治理中的研究受到越来越多的关注。固定化微生物技术可以使微生物在某一固定 区域具有较高的密度，减轻或消除微生物的流失，提高反应速度，目前固定化微生物技术研 究涉及重金属、营养物质、酚类物质、石油污染、印染废水等领域。

根据文献报道硝基苯降解菌固定化已有研究，其固定化材料包括活性炭、聚乙烯 醇、海藻酸钠等。但大多是单独应用或采用聚乙烯醇和海藻酸钠联合应用于固定化材料，其 中聚乙烯醇是一种合成高分子凝胶载体，它的优点是机械强度高，抗微生物分解性及化学 稳定性好，缺点是传质性能较差，易降低细胞的活性；海藻酸钠是天然高分子凝胶载体，优 点是对微生物无毒性，传质性能好，缺点是机械强度低，易被微生物分解，使用寿命短。基于 上述两者的优点及缺点，较多采用两者结合用于制作固定化载体，但是载体的机械强度及 使用寿命仍然是需要解决的问题。火山岩又称喷出岩（Effusiverock），属于岩浆岩（火成 岩）的一类，是火山作用时喷出的岩浆冷凝、成岩、压实等作用形成的岩石，由于喷发时喷发 出来的岩浆有气体渣、固体岩浆等，其发生了化学变化和物理变化形成火山岩，火山岩已被 应用于人工湿地作为湿地填料，微生物可在其表面挂膜生长。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法，即采用海藻 酸钠-聚乙烯醇-火山岩包埋法对硝基苯降解菌进行固定化，并用此固定化微球进行硝基苯 降解研究：火山岩为岩浆岩的一种，其具有比表面积大、空隙率高、稳定性强等特点，在环境 中不参与生物膜的生物的化学反应，对固定的微生物无害、无抑制作用；基于火山岩的特点 及载体机械强度的需求，因此本发明采用火山岩、海藻酸钠及聚乙烯醇联合制作固定化载 体固定硝基苯降解菌。固定化微球具有机械强度高，稳定性好，可降解硝基苯浓度增加，降 解理化条件扩宽、使用寿命长等优点，将投入含硝基苯溶液中，能有效降低水溶液中硝基苯 的含量，并且明显提高降解效率；扩大菌株可降解硝基苯的浓度范围；拓宽硝基苯降解菌可 降解的理化条件范围；载体材料价格便宜，生物相容性好；其工艺操作简单，生产成本低，易 于在工业上应用。

为了实现上述目的，采用以下的技术方案：

一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法，其步骤是：

1）硝基苯降解菌的扩大培养：将菌株接入液体LB培养基，30℃200rpm条件下进行扩 大培养；

所述的液体LB培养基组成和配比如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏 水1000mL，pH为7.0，121℃，105kPa高温灭菌20min；

2）硝基苯降解菌菌悬液的制备：

取步骤1）中好氧条件下培养至对数末期的菌液，在8000rpm条件下离心5min，收集菌 体细胞，用无机盐培养基重悬两次后，收集菌体，4℃条件下贮藏备用；

所用无机盐培养基组成如下：将7gNa₂HPO₄·12H₂O、1gKH₂PO₄、10mgCaCl₂· 2H₂O、2mg柠檬酸铁、20mgMgSO₄·7H₂O溶于900ml去离子水中，调节pH为7.0，然后定容 至1L。

3）用海藻酸钠-聚乙烯醇-火山岩包埋获得固定化硝基苯降解菌：

取8-10g聚乙烯醇、2-3g海藻酸钠和2.5-3.0g火山岩于100ml去离子水中，加热搅 拌使其完全混匀后于121℃，105kPa灭菌20min，冷却至室温（20℃-25℃），然后与降解菌悬 液充分混合得到固定化载体与菌株的混合液；将混合液用注射器注入到含4%w/v氯化钙和 1%w/v硼酸固定液中，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于室温 条件下交联固定16h后，取出小球用无菌水清洗，然后在-20℃冰箱中放置24h，取出放置 于4℃解冻，反复进行冻融2次；待小球完全解冻后，用无机盐培养基洗涤3次后置于-20℃冰 箱中备用

4）活化上述固定化小球：

将上述制得的硝基苯降解细菌小球从冰箱中取出，用无机盐培养基洗涤3次，然后浸泡 在无机盐培养基中，自然曝气约12h以活化固定化小球；

5）硝基苯降解研究：

将固定化小球投加到含不同初始浓度硝基苯的无机盐培养基中，在不同盐度、不同温 度、不同pH条件下进行硝基苯降解研究。

本发明具有以下优点和效果：

固定化微球具有机械强度高，稳定性好的优点，与自由菌体相比，固定化菌株可以降解 硝基苯的浓度有所提高，降解硝基苯的理化范围增大，且硝基苯可降解浓度上升至850 mg·L^-1。硝基苯降解速率提高，硝基苯可降解理化条件拓宽，固定化后细菌的耐盐性得到提 高，可在5%盐度条件下发生降解。固定化菌株能明显降解溶液中的硝基苯，固定化具有使菌 株增加对酸碱盐的耐受性，菌株集中不易分散，在自然环境中可以克服原生动物捕食等优 点。与海藻酸钠-聚乙烯醇固定化载体相比，添加火山岩的载体的稳定性更高，火山岩具有 比表面积大、空隙率高、稳定性高等特点，在环境中不参与生物膜的生物的化学反应，对固 定的微生物无害、无抑制作用不载体材料价格便宜，生物相容性好；载体制作工艺操作简 单，生产成本低，且具有易于在工业上应用、硝基苯降解效率高、使用寿命长等优点。

附图说明

图1为固定化菌株在不同初始浓度硝基苯的降解。

将固定化菌株投入不同浓度硝基苯溶液中，溶剂为无机盐培养基，超声溶解硝基 苯，配置硝基苯母液为1000mg·L^-1，稀释至所需浓度。

所用无机盐培养基：将7gNa₂HPO₄·12H₂O、1gKH₂PO₄、10mgCaCl₂·2H₂O、2 mg柠檬酸铁、20mgMgSO₄·7H₂O溶于900ml去离子水中，调节pH为7.0，然后定容至1L。

图2为固定化菌株与自由菌株对一定浓度硝基苯的降解。

将固定化菌株与自由菌株投入相同浓度硝基苯溶液（200mg·L^-1）中，培养条件 （60rpm，30℃）相同；比较固定化菌株与自由菌株对硝基苯的降解效率。培养基同上。

图3为固定化菌株在不同盐度下对硝基苯的降解曲线。

盐度以氯化钠的浓度表示，硝基苯浓度为200mg·L^-1，培养条件及培养基同上。

图4固定化菌株在不同温度下对硝基苯的降解曲线。

温度范围为10-40℃硝基苯浓度为200mg·L^-1培养条件及培养基同上

图5固定化菌株在不同pH下对硝基苯的降解曲线。

pH为4-10硝基苯浓度为200mg·L^-1培养条件及培养基同上，探究在不同酸碱度条 件下固定化菌株对硝基苯降解。

具体实施方式

实施例1：

一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法，其步骤是：

1）硝基苯降解菌的扩大培养：将菌株接入液体LB培养基，30℃200rpm条件下进行扩大 培养；

所述的液体LB培养基组成和配比如下：在950ml去离子水中，加入蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10g，至溶质完全溶解，用5molL^-1NaOH调节pH为7.0，用去离子水定容 至1L。在121℃，105kPa高温灭菌20min；

2）硝基苯降解菌菌悬液的制备：

取步骤1）中好氧条件下培养至对数末期的菌液，在8000rpm条件下离心5min，收集菌 体细胞，用无机盐培养基重悬两次后，收集菌体，4℃条件下贮藏备用；

所用无机盐培养基组成如下：将7gNa₂HPO₄·12H₂O、1gKH₂PO₄、10mgCaCl₂· 2H₂O、2mg柠檬酸铁、20mgMgSO₄·7H₂O溶于900ml去离子水中，调节pH为7.0，然后定容 至1L。

3)用海藻酸钠-聚乙烯醇-火山岩包埋获得固定化硝基苯降解菌：

取10g聚乙烯醇、3g海藻酸钠和2.5g火山岩于100ml去离子水中，加热搅拌使其完 全混匀后于121℃，105kPa灭菌20min，冷却至室温，然后与降解菌悬液充分混合得到固定 化载体与菌株的混合液；将混合液用注射器注入到含4%w/v氯化钙和1%w/v硼酸固定液 中，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于室温条件下交联固定16 h后，取出小球用无菌水清洗，然后在-20℃冰箱中放置24h，取出放置于4℃解冻，反复进行 冻融2次；待小球完全解冻后，用无机盐培养基洗涤3次后置于-20℃冰箱中备用；

4）活化上述固定化小球：

将上述制得的硝基苯降解细菌小球从冰箱中取出，用无机盐培养基洗涤3次，然后浸泡 在无机盐培养基中，自然曝气约12h以活化固定化小球；

5）溶液中硝基苯降解研究：

将固定化小球投加到含不同浓度的硝基苯的无机盐培养基（380mg/L、450mg/L、570 mg/L、750mg/L、850mg/L）中，摇床转速为60rpm，温度为30℃。定时取样测定残余硝基 苯浓度，并绘制硝基苯降解曲线。如图1所示，随着硝基苯浓度升高，降解时间增长，固定化 菌株可降解硝基苯浓度达到850mg·L^-1，能在100h内完全降解硝基苯。在相同硝基苯浓度 及理化条件下比较固定化菌株与自由菌株对硝基苯降解情况（图2），当硝基苯浓度为200 mg·L^-1时，固定化菌株降解时间比自由菌株降解时间短，完全降解时间为24h，自由菌株完 全降解时间为28h，固定化菌株对硝基苯的降解速率高于自由菌株。

实施例2：

将实施例1中步骤1-4制得等量固定化小球放置于200mg·L^-1硝基苯溶液中，研究在不 同盐度、温度、pH条件下固定化菌株的降解情况，其中温度（10-40℃，间隔为10℃）、盐度 （1%-5%，间隔为2%）、pH（4-10，间隔为1）。分别定时取样，测定溶液中硝基苯的浓度，绘制硝 基苯降解曲线。如图3所示，固定化菌株可在5%盐度的条件下完全降解硝基苯，固定化在一 定程度上提高了菌株对盐度的耐受能力。图4表明固定化菌株在温度10-40℃均降解硝基 苯。图5显示固定化菌株可在pH=5-10的条件下降解硝基苯，固定化后菌株的可降解理化条 件范围得到明显拓宽。

实施例3：

一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法，其步骤是：

1）硝基苯降解菌的扩大培养：将菌株接入液体LB培养基，30℃200rpm条件下进行扩大 培养；

所述的液体LB培养基组成和配比如下：在950ml去离子水中，加入蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10g，至溶质完全溶解，用5molL^-1NaOH调节pH为7.0，用去离子水定容 至1L。在121℃，105kPa高温灭菌20min；

2）硝基苯降解菌菌悬液的制备：

取步骤1）中好氧条件下培养至对数末期的菌液，在8000rpm条件下离心5min，收集菌 体细胞，用无机盐培养基重悬两次后，收集菌体，4℃条件下贮藏备用；

所用无机盐培养基组成如下：将7gNa₂HPO₄·12H₂O、1gKH₂PO₄、10mgCaCl₂· 2H₂O、2mg柠檬酸铁、20mgMgSO₄·7H₂O溶于900ml去离子水中，调节pH为7.0，然后定容 至1L。

3)用海藻酸钠-聚乙烯醇-火山岩包埋获得固定化硝基苯降解菌：

取8g聚乙烯醇、2g海藻酸钠和3g火山岩于100ml去离子水中，加热搅拌使其完全混 匀后于121℃，105kPa灭菌20min，冷却至室温，然后与降解菌悬液充分混合得到固定化载 体与菌株的混合液；将混合液用注射器注入到含4%w/v氯化钙和1%w/v硼酸固定液中，边 滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于室温条件下交联固定16h后， 取出小球用无菌水清洗，然后在-20℃冰箱中放置24h，取出放置于4℃解冻，反复进行冻融 2次；待小球完全解冻后，用无机盐培养基洗涤3次后置于-20℃冰箱中备用；

4）活化上述固定化小球：

将上述制得的硝基苯降解细菌小球从冰箱中取出，用无机盐培养基洗涤3次，然后浸泡 在无机盐培养基中，自然曝气约12h以活化固定化小球；

5）溶液中硝基苯降解研究：

将固定化小球投加到含不同浓度的硝基苯的无机盐培养基（380mg/L、450mg/L、570 mg/L、750mg/L、850mg/L）中，摇床转速为60rpm，温度为30℃，定时取样测定残余硝基苯 浓度，并绘制硝基苯降解曲线。随着硝基苯浓度升高，降解时间增长，固定化菌株可降解硝 基苯浓度达到850mg·L^-1，能在100h内完全降解硝基苯。