一种特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体

摘要

本发明提供了一种特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv?Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，Fc指的是恒定区。本发明所述抗体为通过筛选全人单链抗体噬菌体库得到，全人单链抗体库不含有鼠源或其他异源蛋白成分，有利于将获得的单链抗体改造成为全人源IgG抗体，使用抗原为ASICl通道蛋白。所述抗体能够特异性地识别细胞表面的人ASICl通道，并且对通道活性具有抑制作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种抗酸敏感离子通道I型(ASIC1)的单克隆抗体及其制备方法。具体而言本发明公开了一种能够特异识别酸敏感离子通道I型，并能抑制该离子通道活性的单克隆抗体。该抗体通过筛选全人单链抗体噬菌体展示库得到，具有特异的核苷酸和氨基酸序列。所述单克隆抗体可用于治疗疼痛，神经退行性疾病和精神疾病等ASIC1通道相关疾病。

背景技术

酸敏感离子通道(Acidsensingionchannels，ASICs)是质子门控型离子通道，在中枢和外周神经系统中广泛表达^[1]。ASICs在学习记忆和感觉接收中起到重要作用^[2]。在炎症，中风等伴随有局部组织酸中毒的病理情况下，神经元上的ASICs会被激活^[3，4]。ASICs也和一些精神疾病相关。人ASIC家族中有四种亚基ASIC1，ASIC2，ASIC3和ASIC4，它们组成同/异多聚体发挥离子通道的功能^[5]。研究人员提出阻断ASIC1通道作为策略，来治疗疼痛、神经退行性疾病和精神疾病等。因此，研发抗体作为ASIC1抑制剂，能够为以上疾病的治疗提供新手段。

参考文献：

1.Krishtal，O.，TheASICs：Signalingmolecules？Modulators？TrendsinNeurosciences，2003.26(9)：p.477-483.

2.Lingueglia，E.，Acid-sensingionchannelsinsensoryperception.JournalofBiologicalChemistry，2007.282(24)：p.17325-17329.

3.Wemmie，J.A.，M.P.Price，andM.J.Welsh，Acid-sensingionchannels：advances，questionsandtherapeuticopportunities.TrendsinNeurosciences，2006.29(10)：p.578-586.

4.Xiong，Z.G.，etal.，Neuroprotectioninischemia：Blockingcalcium-permeableacid-sensingionchannels.Cell，2004.118(6)：p.687-698.

5.Deval，E.，etal.，Acid-SensinglonChannels(ASICs)：Pharmacologyandimplicationinpain.Pharmacology&Therapeutics，2010.128(3)：p.549-558.

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗酸敏感离子通道ASIC1的单克隆抗体，从而可以用于制备治疗ASIC1通道相关的疾病药物或者ASIC1相关诊断试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：3，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：2，Fc指的是恒定区。

优选地，所述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体的序列为SEQIDNO：4。

优选地，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区。

优选地，所述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体特异识别ASIC1抗原的胞外区部分的70～427氨基酸之间。

本发明还提供了一种基因工程抗体，其特征在于，其与上述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体的单链抗体具有30％以上的同源序列。

优选地，所述的基因工程抗体包含Fab片段，F(ab)‘片段，Fd片段，Fv片段和Fc片段中的一种，上述各片段中两种以上的组合，或上述各片段中的至少一种与其它蛋白或肽链形成的衍生物。

优选地，所述的基因工程抗体的重链CDR3区序列为DSFYGYSKGD，轻链CDR3区序列为SSYTSSSTYV。

本发明还提供了一种编码特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体的核苷酸序列，其序列为SEQIDNO：1。

优选地，所述的核苷酸序列编码上述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体。

本发明还提供了上述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体或基因工程抗体在制备用于治疗与ASIC1相关的疼痛、神经退行性疾病和精神疾病的药物或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗疼痛、神经退行性疾病和精神疾病的药物，其包含上述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体或基因工程抗体作为活性成份。

本发明提供的单克隆抗体是一种单链抗体，通过筛选全人单链抗体噬菌体库得到，命名为Anti-ASIC1-scFv，经过检测该单链抗体对ASIC1选择性结合，并可特异性抑制酸敏感离子通道I型的活性。与目前临床应用常见IgG类抗体不同，Anti-ASIC1-scFv为重组单链抗体，因此具有不同于IgG的抗体结构、生化特性和生物学功能。本发明的实验证明，Anti-ASIC1-scFv单链抗体分子量大约100Kd，识别、结合靶抗原表位为ASIC1胞外区结构，特异识别过表达ASIC1蛋白的细胞系，且抗体与ASIC1在细胞表面共定位。功能实验显示Anti-ASIC1-scFv能够抑制ASIC1离子通道的活性。单独使用该抗体的免疫组化染色即可较为准确地诊断各种组织中人源ASIC1蛋白的表达情况。综上Anti-ASIC1-scFv单链抗体在疼痛，神经退行性疾病和精神疾病等的治疗方面和ASIC1诊断试剂方面有潜在的应用价值。

本发明所述抗体为通过筛选全人单链抗体噬菌体库得到，全人单链抗体库不含有鼠源或其他异源蛋白成分，有利于将获得的单链抗体改造成为全人源IgG抗体，使用抗原为ASIC1通道蛋白。所述抗体能够特异性地识别细胞表面的人ASIC1通道，并且对通道活性具有抑制作用。

附图说明

图1.ASIC1磷脂纳米盘噬菌体库筛选结果图；

图2.ASIC1抗体ELISA结果图；

图3.ASIC1抗体免疫荧光结果图；

图4.ASIC1抗体膜片钳实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1、单链抗体库筛选

1、所用材料：

(1)抗原生物素化试剂盒(购自赛默飞公司，货号21955)。(2)Nanodrop(赛默飞公司，型号Nano200)。(3)链霉亲和素化的磁珠购自赛默飞公司。(4)高吸附酶联免疫反应微孔板购自康宁公司。(5)Anti-M13HRP抗体购自赛默飞公司。(6)辅助噬菌体购自LifeTechnologies，货号18311019。(7)XL1-Blue细菌购自AgilentTechnologies，货号200228。(8)显影液ABTS溶液购自赛默飞公司，货号002024。

2、实验方法：

1)对ASIC1磷脂纳米盘(以下简称抗原，由上海维亚生物科技有限公司提供)和空载的磷脂纳米盘(以下简称空载抗原，由上海维亚生物科技有限公司提供)进行生物素标记。具体为将200ug抗原或空载抗原与1ul的生物素化试剂(生物素化试剂盒提供)混合，室温震荡30分，加入离心柱过柱(离心柱由生物素化试剂盒提供)，1000g离心收集流出液，用Nanodrop测定蛋白浓度为0.5微克/微升。

2)表达全人单链抗体的噬菌体展示库200微升(实验室自有，含有噬菌体粒1×10¹²个)与5微克空载抗原混合后室温孵育30分钟，再加入50微升的链霉亲和素化的磁珠。与空载抗原结合的噬菌体被链霉亲和素化的磁珠捕获，未结合的噬菌体保留在上清。再将上清与5微克抗原混合后室温孵育30分钟，再加入50微升的链霉亲和素化的磁珠。与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素化的磁珠捕获，未结合的噬菌体经PBST漂洗后去除。用盐酸甘氨酸(pH2.2)溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。接种XL1-Blue细菌(AgilentTechnologies，货号200228)200毫升，待OD达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体与XL1-Blue细菌37℃静置30分钟，后在30摄氏度条件下过夜扩增，离心收集细菌后，加入30微升辅助噬菌体(含有辅助噬菌体粒1×10¹¹个)扩增后进行下一轮淘选。重复上述筛选步骤3轮，将侵染噬菌体的XL1-Blue菌液经过充分稀释后涂10cm平板，每个板上有100-500个克隆，挑取单克隆，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的各轮噬菌体库进行验证。

3)噬菌体酶联免疫反应步骤为，将侵染噬菌体的XL1-Blue单克隆菌接种进200微升的96孔板中，200rpm37℃摇4-6小时，检测OD接近0.6后，加入1微升的辅助噬菌体，继续30℃摇过夜。第二天3000g离心取上清待用。取96低透平底微孔板，包被抗原过夜，同时设定对照板，对照板包被空载抗原、非相关抗原(AcroBiosystems公司，货号CD0-H82F2)。第二天加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2小时，再加入Anti-M13HRP抗体孵育30分钟，后用PBST洗3次，加入50微升显影液ABTS。

结果：

由抗原的噬菌体酶联免疫反应结果可以看出随着淘选的进行，抗原组酶联免疫反应的信号不断升高，而空载抗原组和非相关对照组的信号仍然比较低，在第四轮淘选后，抗原的信号强度是对照抗原的多倍，说明经过4轮淘选，能够表达与抗原特异性结合抗体的噬菌体不断的被富集(如图1所示)。从淘选后的第四轮库中挑取单克隆，最后确定酶联免疫反应读值是对照两倍以上的克隆作为阳性克隆，阳性克隆测序分析，经过比对分析，确定6个不同的抗体序列有富集。如图2所示，其中得到的Ab6序列为本专利申请保护的抗体DNA序列(SEQIDNO：1)。

实施例2、单链抗体蛋白表达纯化

1、所用材料：

(1)SyproOrange染料购自赛默飞公司。(2)pFUSE表达载体pFUSE-hIGg1-FC2购自Invivogen公司，货号pfuse-hg1fc2。(3)HiTrapProteinAHPcolumns购自GE公司。(4)蛋白纯化仪购自GE公司。(5)实时定量PCR仪购自BioRad公司。(6)质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。(7)BCA蛋白定量试剂盒(Pierce^TMBCAProteinAssaykit，Pierce#23253)。(8)BamH1和BglII限制性内切酶购自NEB公司。

2、实验方法：

将实施例1得到的阳性序列(即SEQIDNO：1)由全基因合成(南京金斯瑞生物公司)并在序列两端加入BamH1和BglII酶切位点，将得到的核酸序列经过参照NEB说明书在BamH1和BglII酶切后插入pFUSE-hIGg1-FC2表达载体(Invivogen公司，操作步骤请参照说明书)，将获得具有Fc段的单链抗体Anti-ASIC1-Fc的真核抗体表达质粒。利用293Fectin转染试剂(Invitrogen公司，货号12347500)与上述获得的真核抗体表达载体质粒按照体积质量比30微升：15微克的比例混合后加入30毫升的293Freestyle悬浮细胞(购自赛默飞公司)后，37℃1200rpm摇过夜，离心后收集上清，采用HiTrapProteinAHPcolumns在蛋白纯化仪上进行抗体蛋白纯化(Anti-ASIC1-Fc)，最后用BCA法蛋白定量试剂盒(Pierce，货号23252)参照说明书检测抗体浓度。

3、实验结果：

将实施例1得到的抗体的核酸序列(SEQIDNO：1)经过酶切插入pFUSE-hIGg1-FC2表达载体，得到含有Fc段的Anti-ASIC1-Fc序列(SEQIDNO：4)，其能够编码特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人单链抗体(Anti-ASIC1-Fc)，即所述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体，为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：2，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：3，其轻链CDRL3区序列为SSYTSSSTYV，重链CDRH3区序列为DSFYGYSKGD，Fc指的是恒定区，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区，所述的特异性抑制酸敏感离子通道I型的全人抗体的全序列为SEQIDNO：4。

实施例3、酶联免疫反应检测单链抗体与ASIC1的结合

1、所用材料：

(1)CBS抗原固定溶液购自赛默飞公司。(2)Anti-HumanFcHRP二抗购自赛默飞公司。(3)显影底物ABST溶液购自Roche公司。(4)检测用96孔底透板购自康宁公司。

2、实验方法：

96孔底透板每孔加入50微升CBS抗原固定溶液稀释的抗原多肽，抗原每孔0.05微克，4℃过夜孵育，室温震荡孵育30分钟，PBS漂洗三次，含5％牛奶的PBST溶液，37℃条件下封闭60分钟。PBS漂洗三次，加入50微升(终浓度1微克/毫升)实施例2所得的Anti-ASIC1-Fc抗体，37℃条件下孵育60分钟。漂洗干燥后，加入Anti-HumanFc二抗，室温震荡孵育30分钟，PBS漂洗三次，最后加底物显色，酶标仪读值。

3、实验结果：

如图2所示，阴性对照孔酶联免疫反应读值OD值在0.2以下，而阳性孔OD值在0.4以上。根据结果Ab6抗体与抗原结合阳性。

实施例4、免疫荧光实验

1、所用材料：

(1)CHO-K1细胞株购自赛默飞公司。(2)IRES-DsRed报告基因质粒购买自Addgene公司。(3)荧光二抗AlexaFluor488goatanti-human购自赛默飞公司。(4)DAPI细胞核染料购自赛默飞公司。(5)荧光共聚焦显微镜购自徕卡公司。

2、实验方法：

CHO-K1细胞用Lipofectin3000试剂(赛默飞)参照说明书步骤转染质粒ASIC1-IRES-DsRed，该质粒可在细胞膜上表达人源ASIC1蛋白。培养48小时后，用2％甲醛固定细胞，室温条件下放置10分钟。漂洗后，加入含2％BSA的PBS溶液封闭细胞30分钟，1毫克/毫升实施例2获得的Anti-ASIC1-Fc抗体溶液用1％BSA/PBS以稀释比1∶500稀释后孵育细胞4～5小时，漂洗后，加入荧光AlexaFluor488goatanti-human二抗在溶液1％BSA/PBS中以1∶1000浓度稀释，室温条件下孵育60分钟后，加入DAPI(1微克/毫升)孵育5分钟，漂洗后，封片，激光共聚焦显微镜观察及拍照。

3、实验结果：

如图3所示，为ASIC1抗体免疫荧光结果图，结果显示抗体特异性识别ASIC1过表达细胞株。

实施例5、膜片钳技术检测抗体抑制ASIC1通道活性

1、所用材料：

(1)CHO-K1细胞株购自赛默飞公司(细胞培养方法请参照说明书)。(2)IRES-DsRed报告基因质粒购买自Addgene公司。(3)全自动膜片钳系统购自美国MDC公司。

2、实验步骤：

CHO-K1细胞用Lipofectin3000试剂(赛默飞)参照说明书步骤转染质粒ASIC1-IRES-DsRed，该质粒可在细胞膜上表达人源ASIC1蛋白，将所得的转染ASIC1的CHO-K1细胞以10⁴个每平方厘米的密度种在圆形玻片上，37度过夜培养。第二天用于全细胞膜片钳实验。胞内液(浓度为毫摩尔)为30mMNaCl，120mMKCl，0.5mMCaCl₂，1mMMgCl2，5mMEGTA，2mMATP，10mMHEPES(pH＝7.2)。胞外液(浓度为毫摩尔)为150mMNaCl，5mMKCl，2mMCaCl2，1mMMgCl2，10mM葡萄糖，10mMHEPES(pH＝7.4/6.0)。细胞在中性胞外液(pH＝7.4)中经过15分钟实施例2获得的Anti-ASIC1-Fc抗体孵育(抗体浓度200nM)后，切换到pH6.0酸性胞外液开始刺激，记录电流信号。

3、实验结果：

如图4所示，为抗体膜片钳实验结果图，结果显示200nM的抗体可以部分抑制ASIC1离子通道的活性。