全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

摘要

目的:我们应用噬茵体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库,本文目的在于对该抗体库进行鉴定,筛选食管癌抗体,同时对抗体的活性进行检测.方法:PCR鉴定TGl中食管癌单链抗体scFv的插入率;1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和Not I双酶切质粒的结果;先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选;将阳性重组噬茵体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化;用SDS-PAGE测定该抗体的相对分子量;用Western blot鉴定该抗体;用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性.结果:scFv基因插入率为91.7%;酶切后检测到目的基因片段.在亲和筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色;在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达.免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织,而肝癌组织和胃癌组织不染色.免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色.ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合.结论:利用噬茵体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性.