一种具有铁还原能力的新菌种及其应用

摘要

本发明公开了一种具有铁还原能力的新菌种及其应用，菌株名称为Desulfotomaculumsp.？GSS09，保藏编号为CGMCC？No.？11762及其在不溶性铁氧化物还原中的应用。发明人从堆肥样品中分离纯化得到一株Desulfotomaculum属菌株GSS09，多相分类学结果鉴定GSS09是分类学上的新种(Desulfotomaculum？ferrireducens？sp.？nov.？)。菌株GSS09具有在高温厌氧条件下对不溶性铁氧化物的还原作用，且还原率可达到35%；在可溶性电子介体的存在下最高还原率接近50%。由于土壤中含有大量电子中介体，因此该菌在土壤修复方面具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株新菌种及其在环境修复中的应用，具体涉及一株厌氧菌GSS09的分离鉴定，及其在铁还原中的应用，属于微生物系统分类和环境生物技术领域。

背景技术

铁是地壳中含量居第四位的元素，平均含量约为5.6%。在pH中性的自然环境中，铁通常以难溶性的固相矿物的形式存在，如针铁矿、赤铁矿、水铁矿等。在厌氧土壤中，如水浸土壤和深层土壤中，Fe(Ⅲ)为丰度最高的电子受体，这些Fe（Ⅲ）矿物表面带有电荷、具有巨大的比表面积及强烈的反应活性，是土壤和陈济环境中最重要的吸附剂与催化剂，直接影响养分的利用效率及重金属、有机污染物的转化。例如，研究已经证实，铁氧化物的微生物还原过程，常耦联各种含氮染料的降解、有机氯农药(R-Cl,如DDT等)的脱卤还原以及重金属和放射性元素Mn(IV)、Cr(VI)和U(VI)的还原。另外，更重要的是，Fe(Ⅲ)的微生物还原能够通过基底竞争机制抑制产甲烷过程，从而有利于温室气体甲烷的减排。总之Fe（Ⅲ）矿物的微生物还原在环境修复中发挥着重要的作用。

厌氧环境中的嗜热菌由于可以提高生物降解速率，高温杀死病原微生物，提高有机物降解效率而被越来越多研究者所关注。革兰氏阳性菌是十分重要的微生物功能类群，在多种厌氧土壤中占据优势地位，对于土壤污染物处理、重金属解毒等具有巨大作用。因此，对嗜热革兰氏阳性微生物新种进行铁氧化物还原的探讨不仅具有重要的研究价值，而且在土壤修复的实践中也具有指导意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株新菌种：Desulfotomaculumsp.GSS09。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在铁氧化物还原中的应用。

发明人通过筛选得到一株具有铁氧化物还原能力的新菌种：Desulfotomaculumsp.GSS09，并于2015年11月30日将菌株转入中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心于2015年11月30日收到申请人提供的菌株并鉴定存活。保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCCNo.11762，建议的分类命名为Desulfotomaculumsp.GSS09。

本发明的新菌种：Desulfotomaculumsp.GSS09可以在厌氧条件下可利用腐殖质和三价铁为电子受体，加速有机物的降解。使用本发明的新菌株，可以制备得到高效的土壤原位修复微生物制剂。

此外，本发明的新菌种Desulfotomaculumsp.GSS09的最佳生长温度为50℃，接种在堆肥物后进行堆肥处理的过程中，可以有效去除其中的难降解有机污染物。

附图说明

图1为菌株GSS09细胞的透射电镜图；

图2菌株GSS09细胞的超薄切片电镜图

图3采用Neighbor-joining法构建的菌株GSS09的系统发育树；

图4菌株在GSS09对水铁矿的还原情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

一、菌株GSS09的分离和富集

1）将10g堆肥样品加入50mL添加了25mM水铁矿和10mM丙酮酸钠的MSM培养基中，50℃培养4周；转接三次后，将培养液进行梯度稀释，厌氧条件下涂布于25mM水铁矿和10mM丙酮酸钠的MSM培养基固体平板上，在50℃条件下进行培养；

2）挑取单菌落，进一步分离和纯化菌体；

3）重复步聚2），直到获得单克隆菌落GSS09。

二、菌株GSS09的形态特征

1）菌体形态特性

菌株GSS09菌体呈杆状，单生鞭毛，菌体细胞大概0.8-1.1宽，3.5-4.6μm长（如图1所示）。菌株GSS09为革兰氏阳性菌，产芽孢（如图2所示），图2中的CW是指细胞壁（CellWall）。

2）菌落形态特性

菌株GSS09经活化后，50℃厌氧条件下，在含有亚硫酸钠和丙酮酸钠的平板培养7天后形成直径为1mm灰色、不透明的菌落。

三、菌株GSS09的分类地位

提取发明菌株GSS09的总DNA。以提取的DNA为模板，以通用引物27F和1492R扩增细菌的16SrRNA基因，将PCR扩增产物回收纯化后进行测序，所得序列（1537bp）通过EzTaxonserver2.1网站的在线比对工具进行序列相似性计算。将菌株GSS09及其相近菌株的16SrRNA序列通过CLUSTALX.1.8进行多序列比对分析后，利用Mega(Version6.0)软件作系统发育分析，采用Neighbor-joining方法构建系统进化树，进化树用1200次重复取样的bootstrap方法验证。

结果显示，与GSS09的16srRNA序列相似性最高菌株为DesulfotomaculumhydrothermaleLam5^T(94.5%)，与Desulfotomaculum属的其他种相似性均低于94%。在进化树里(图3)，GSS09与Desulfotomaculum属Ia分支中的Desulfotomaculumaeronauticum,Desulfotomaculumdefulvii,和Desulfotomaculumruminis聚在一起。总而言之，菌株GSS09可归属于Desulfotomaculum属，但与该属所有已知菌种的同源性较低。

四、菌株GSS09的生理生化分析

为了进一步了解菌株GSS09，根据标准程序测试该菌株相关生理生化特征。

在以亚硫酸钠为电子受体、丙酮酸钠为电子供体的液体培养基中，GSS09能够在30-55℃的温度条件下生长，最适生长温度为50℃，该菌能够在6.5-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为7.5。对NaCl的耐受生长范围为0-3%NaCl，最适生长盐浓度为1%。GSS09厌氧下的电子供体/受体谱见表1；菌株GSS09与其近缘菌株的生理生化比较见表2。

表1电子供体/受体谱实验

表2菌株GSS09与其近缘菌种的生理生化比较

+，阳性；-，阴性。

五、菌株GSS09的细胞化学分析

菌株GSS09的G+C含量为49.1mol%；GSS09在50℃条件下培养时所含有的主要脂肪酸为C16:0(32.9%)和C_16:1ω7cand/orC_16:1ω6c（13.8%）。

表3菌株GSS09与近缘菌株的脂肪酸比较

基于GSS0916srRNA相似性的系统发育分析，以及生理生化特征等系列鉴定实验表明，GSS09与最相近的模式菌有着许多重要区别：1.具有革兰氏阳性菌细胞壁特征；2.生长温度区间及最适生长温度不同；3.C16:0作为主要的脂肪酸。结合GSS09在16srRNA基因序列与最近菌株低的相似度(94.5%)，多相分类学结果鉴定GSS09代表分类学上Desulfotomaculum属的一个新种，将本发明菌种GSS09命名为Desulfotomaculumferrireducenssp.nov.GSS09。

六、菌株GSS09特征的总述

综合上述菌株GSS09与现有菌株间的各种区别特征，以及菌株GSS09在其他方面的检测结果，对菌株GSS09的特征总结如下：

形态特征：革兰氏阳性杆菌，有运动性，单生鞭毛。菌体直或稍弯，0.8-1.1μm宽，3.5-4.6μm长。在含有亚硫酸钠和丙酮酸钠的平板上形成白色、小而圆的菌落。

生长特征：厌氧生长，可以利用不同电子供体和电子受体。生长范围为：30-55℃(最适50℃)，pH6.5-9.0(最适pH7.5)，0-3%(w/v)NaCl盐度(最适1%)。

电子供体/受体：50℃条件下，可以利用水铁矿、硫酸钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠为电子受体，可以利用葡萄糖、木糖、乳糖、果糖、甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠、丙酮酸钠、乙醇、蔗糖为电子供体。

化学特征：DNAG+C组分为50.5mol%，主要脂肪酸为C16:0和C_16:1ω7cand/orC_16:1ω6c。

七、菌株GSS09对水铁矿的还原

①材料和方法

1)采用液体培养基配方：每升去离子水中0.25gNH4Cl、0.678gNaH2PO4·2H2O、0.1gKCl、2.94gNaHCO3、1.59gNa2CO3，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同分离培养基)；灭菌后，体系中添加20mM的丙酮酸钠作为电子供体，并添加50mM的水铁矿作为电子受体。添加0.2mM的AQDS为可溶性介体，同时设置不添加AQDS的对比处理。培养基冲氮气：二氧化碳（80：20）混合气以除去氧气。

2)于亚硫酸钠为电子受体、丙酮酸钠为电子供体的培养基中，于50℃，静置培养48小时，使细菌数量达到指数生长期；

3)6000rpm离心10min，去上清液，碳酸缓冲液重新悬浮，重复上述操作2次，最终悬浮液的浓度达到OD600约1.2；

4)加入1ml菌体悬浮液作为处理，同时分别设置使用未添加菌株GSS09的培养基作为对照，于50℃，厌氧静置培养

5)前5天每天取样，后面每隔5天取样。取混合均匀的4ml培养液于16ml0.5mol/lHCl溶液中180转/分振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。

②结果和讨论

菌株GSS09对不溶性的水铁矿具有较高的还原能力，在培养10天后达到最高还原效率35%。添加可溶性电子中介体AQDS之后可以加快菌株GSS09对水铁矿的还原速度，并且可增加最大还原量（接近50%）。