水稻土中铁还原菌的分离纯化及铁还原能力鉴定

摘要

异化Fe(Ⅲ)还原菌(Dissimilatory Iron Reducing Microorganisms，DIRM)是具有异化Fe(Ⅲ)还原功能的一类微生物的总称，能够以Fe(Ⅲ)作为惟一的电子受体氧化有机物质，并从中获得能量支持生长。由于Fe(Ⅲ)的地球化学丰度比较高，因此在自然界中只要有厌氧环境，几乎都会发现异化Fe(Ⅲ)还原现象，同样只要有厌氧环境几乎都可发现异化Fe(Ⅲ)还原微生物。迄今，研究人员已经从各种厌氧环境中分离得到了种类不同的异化Fe(Ⅲ)还原微生物。这些厌氧环境包括淡水、地下水、海湾沉积物、湖泊沉积物、底层土壤、地层深处的地芯、热泉、金矿矿井深处的地下水、酸性废水、活性污泥等。现在人们已经认识到Fe(Ⅲ)氧化物的厌氧还原主要是微生物介导的异化还原过程，即微生物利用Fe(Ⅲ)氧化物作为最终电子受体所进行的厌氧呼吸过程，而且研究发现异化Fe(Ⅲ)还原呼吸可能是地球上最早的呼吸形式之一。因此，加强异化Fe(Ⅲ)还原研究对于揭示地球早期生命的能量代谢特征和生命进化具有重要的理论意义。水稻土作为一种研究氧化还原过程的模式系统一直受到人们的重视，其中铁的氧化还原占有重要地位。因而系统开展Fe(Ⅲ)还原微生物特性的研究，对于阐明土壤中氧化铁的微生物还原机理、认识异化铁还原在稻田生态系统中的重要作用，促进水稻土中污染物的转化与修复具有重要的理论和实际意义。 本文以四川和江西水稻土为供试样品，采用厌氧培养的方法，初步从水稻土中分离纯化出部分具有铁还原功能的微生物，并对部分菌株进行菌体、菌落形态特征、生理功能鉴定和16S rDNA序列分析。试验得出以下主要结论： (1)通过对四川和江西两地的典型水稻土样品中铁还原菌的分离试验，得到了一些具有高效还原Fe(Ⅲ)的菌株。其中，兼性厌氧铁还原菌株的菌落特征为：菌落表面粘滑，边缘不规则有毛刺，隆起，呈浅棕色，透光性差，直径3mm左右，染色后做镜检为革兰氏阴性芽孢杆菌；严格厌氧铁还原菌的菌落特征为：菌落白色，粘滑，隆起，透光性差，边缘光滑，直径2mm左右，革兰氏阳性，有芽孢，属梭状杆菌。 (2)初步确立了从水稻土中分离纯化铁还原微生物的方法。采用充氮保护的柠檬酸铁(固体斜面)选择性培养基进行铁还原功能初步筛选，为分离高效铁还原菌提供了快捷的方法。 (3)比较了不同铁还原菌在以葡萄糖为唯一碳源条件下，对人工合成Fe(OH)3(ferrihydrite)和柠檬酸铁的还原特征。对于可溶的柠檬酸铁，兼性厌氧和严格厌氧铁还原菌株均表现出较高的利用效率，体系中三价铁的还原率在84.3％～93.8％之间。对于难溶于水的Fe(OH)3，严格厌氧铁还原菌有着较高的还原率，体系中的三价铁的还原率可以达到90％以上，兼性厌氧菌对氢氧化铁的还原率也在80％以上，但反应速率低于严格厌氧铁还原菌。 (4)从江西和四川水稻土中分离的6株严格厌氧铁还原菌对不同碳源的利用特征研究结果表明，葡萄糖和丙酮酸钠可作为这6个菌株的优势碳源。这6个菌株在利用葡萄糖时的Fe(Ⅲ)还原量最大，反应速率(Vmax)最高。不同菌株利用葡萄糖的Fe(Ⅲ)还原最大潜势大小顺序为：菌株SC-a18>JX-a20>JX-a3>SC-a13>JX-a10>SC-a19。由计算出的铁还原率比较可知，菌株SC-a18的Fe(Ⅲ)还原率最高，高达92.11％，最低的菌株SC-a19只有24.52％。 (5)不同菌株在传代过程中的稳定性分析及菌种保存方法的研究表明，严格厌氧铁还原菌株在传代过程中的稳定性高于兼性厌氧菌株。严格厌氧铁还原菌有80％的菌株可以稳定传代，而兼性厌氧菌株可稳定传代的则不足50％。在柠檬酸铁培养基中扩繁的菌种可在4℃下稳定保藏6个月以上。 (6)各菌株复壮时在LB培养基中停滞期比较短，30℃培养10h左右菌株的生长曲线可进入对数期；在柠檬酸铁液体培养基中，需培养15h左右生长曲线才能进入对数期。但是，在柠檬酸铁培养基中微生物进入对数期后，生长速率则明显快于LB培养基，最终体系中微生物生物量也远大于LB培养基中的微生物生物量。 (7)在厌氧条件下以人工合成的Fe(OH)，3为唯一电子受体，葡萄糖为电子供体，测定兼性厌氧及严格厌氧铁还原菌的铁还原特征曲线，兼性厌氧菌株在培养24h后Fe(Ⅲ)还原进入快速增长期，108h后Fe(Ⅲ)还原率基本达到稳定。除JX-o6菌株的氢氧化铁的还原率在80％左右外，其他3个菌株均达到90％以上。严格厌氧菌株的铁还原过程中，JX-a10和JX-a8在培养36h后铁还原率迅速增大，比SC-a15和SC-a17菌株提前12h，培养72h后的氢氧化铁的还原率均达到90％以上，在对数增长期严格厌氧菌在12h里就使80％的Fe(Ⅲ)还原了，反应非常迅速。与此同时培养体系中pH值迅速降低。而在培养体系中，对照的铁还原率几乎为一条直线，说明没有微生物的参与及微生物的生长受到限制时，Fe(OH)3的还原反应几乎不会发生。 (8)通过16S rDNA序列分析及同源性比对发现，菌株JX-a20、SC-a13、SC-a18及SC-a19之间的进化关系比较接近，都与来自热溪的亚坤酸盐氧化菌(Uneulturedbacterium Hot Creek)在进化关系处于一个分支，而菌株SC-a17的与前者的差异较大。铁还原菌株JX-a20、SC-a13、SC-a17及SC-a18和多种丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)菌株的有较高的同源性，且在进化关系上亲缘性接近，菌株SC-a19与典型的铁还原菌株Clostridium sp.FRBl的同源性最大。

目录

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第一章绪论

1.1异化Fe(Ⅲ)还原微生物的多样性

1.2铁还原微生物的还原代谢机理

1.2.1通过电子穿梭体进行的不溶性Fe(Ⅲ)还原

1.2.2通过Fe(Ⅲ)络合剂的螯合溶解

1.2.3直接和不溶性Fe(Ⅲ)氧化物接触的Fe(Ⅲ)还原

1.3影响异化Fe(Ⅲ)还原的因素

1.3.1 Fe(Ⅲ)的形态及其它电子受体

1.3.2异化Fe(Ⅲ)还原微生物的种类

1.3.3生长基质或电子供体

1.3.4培养温度

1.3.5培养体系pH值

1.3.6气体环境

1.3.7其它物质的影响

1.4水稻土中异化铁还原过程的意义

1.4.1水稻土中的氧化铁及其转化

1.4.2氧化铁转化对水稻土的意义

1.5土壤中异化铁还原的环境及生态学意义

1.6本研究的目的及意义

第二章研究方法

2.1供试土壤

2.2培养基养分组成

2.2.1 5％PTYG固体培养基组成

2.2.2氢氧化铁液体培养基组成

2.2.3柠檬酸铁固体培养基组成：

2.2.4柠檬酸铁液体培养基组成

2.3铁还原微生物的分离与纯化

2.3.1水稻土中厌氧微生物恢复培养

2.3.2兼性厌氧铁还原菌株的分离纯化

2.3.3严格厌氧铁还原菌株的分离纯化

2.4铁还原特征曲线与铁还原率测定

2.5铁还原菌生长曲线的测定

2.5.1不同菌株在LB液体培养基中的生长曲线

2.5.2不同菌株在柠檬酸铁液体培养基中的生长曲线

2.6菌株的碳源利用特征试验

2.7菌株的稳定性试验

2.7.1菌株传代过程中的稳定性

2.7.2菌株保存过程中的稳定性

2.8 Logistic方程拟合分析及参数的意义

2.9采样及测定方法

2.10 16S rDNA的PCR和序列测定

2.10.1酚—氯仿法提取菌体16S rDNA

2.10.2 16S rDNA的PGR扩增及序列测定

第三章试验结果与分析

3.1铁还原微生物的分离筛选

3.2不同菌株铁还率比较

3.2不同菌株传代稳定性分析

3.3菌株的复壮和保存

3.4不同铁还原菌株的生长曲线比较

3.5不同铁还原菌株的铁还原特征分析

3.5.1兼性厌氧菌株的铁还原特征曲线

3.5.2严格厌氧菌株的铁还原特征曲线

3.5.3用Logistic方程拟和不同铁还原菌株对氢氧化铁的还原特征参数

3.6不同菌株的生长曲线和铁还原特征曲线的耦合

3.7不同铁还原菌株利用不同碳源的Fe(OH)3还原特征分析

3.7.1不同铁还原菌株对Fe(OH)3的还原能力

3.7.2不同铁还原菌株利用不同碳源的Fe(OH)3还原特征分析

3.8 16S rDNA序列测定及聚类分析

第四章讨论

4.1铁还原微生物分离纯化方法选择

4.2不同碳源对铁还原菌株Fe(OH)3还原过程的影响

4.3不同菌株在传代过程中的稳定性分析及菌种保存方法的比较

4.4铁还原菌在LB培养基及柠檬酸铁液体培养基中复壮的生长曲线

4.5 16S rDNA序列测定及聚类分析

第五章结论与展望

5.1本论文的主要结论

5.2研究特色及新见解

5.3不足之处

5.4研究展望

参考文献

致谢

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