人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用

摘要

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）快速联检试剂盒及其制备和应用。本发明所述试剂盒中包括HIV检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，使用多重荧光PCR技术，在单个PCR反应管中同时检测HIV,HBV,HCV三种病毒核酸，检测灵敏度高，特异性好，人工误差率低，实验耗时短；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，降低了样本间交叉污染的风险，适合在大规模血液筛查和临床检验中应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)是艾滋病的病原体。该 病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人 体内生存，至今无有效疗法。2015年统计结果：全球范围内有3500万HIV感染者，中国有近50 万，居全球第12位。HIV根据血清学和病毒核酸序列可分为二型：HIV-1和HIV-2，全球绝大部 分地区流行的是HIV-1型，HIV-2型只在非洲局部地区流行。

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是导致病毒性肝炎的2种主要病毒类 型，中国有9000万乙肝病毒携带者，有超过2500万的丙肝病毒感染者。据不完全统计，在乙 肝携带者中有760万人同时也是丙肝感染者。而在HIV感染者人群中，同时感染有HBV/HCV的 患者也为数众多，而HBV/HCV导致的肝脏疾病也是HIV患者发病和死亡的主要原因。HIV, HBV,HCV这三种病毒之间的混合感染使得患者病情复杂化，给原有的针对性抗病毒治疗造 成了很大挑战。例如：HBV/HCV混合感染中HCV的感染对HBV的复制有抑制作用，因此治疗HCV 过程中要防止HBV病情的反弹；HBV/HIV混合感染中，HBV的基因产物可能促进HIV的复制，加 速HIV的疾病进程等等。因此，对患者进行多重病毒的同时检测非常重要。

目前针对HIV,HBV,HCV病毒的检测和诊断方法还是以血清学方法中对相关抗体的 检测作为判断病毒感染的金标准，病毒核酸和检测为辅助手段。基于血清学反应的检测方 法所检测的是人体对病毒产生的抗体而不是病毒本身，在病毒感染早期，即“窗口期”，人体 内虽有病毒感染但还未产生抗体或者产生的抗体数量未达到抗体反应的最低检测限，此时 血清学抗体检测结果一般为阴性。而HIV,HBV,HCV这三种病毒都有较长的窗口期，不能满足 对于病毒感染“早发现，早诊断，早治疗”的需要。基于聚合酶链式反应(PCR)技术的核酸分 子检测方法的检测对象是病毒自身的遗传物质，以血清中病毒核酸的存在作为病毒感染和 复制的直接标志物，大大缩短了病毒检出的“窗口期”，适用于病毒感染的早期诊断。其中， 实时荧光定量PCR技术不仅可以对病毒进行定性检测，还可以进行定量分析，并且具有较高 的灵敏度、特异性和准确性，越来越多的应用在各种病毒的临床/实验室检测中，并被国家 发布的相关病毒防治指南所承认。

目前，市场上已有多种针对HCV,HBV,HIV的单项核酸检测/分型产品，但对于有混 合感染情况的患者而言，对每种病毒分别进行单次检测的总成本较高，等待检验结果的时 间较长。而对于医院实验室的检验人员来说，由于每种病毒检测使用的基因标志物和扩增 程序不同，单个病毒单次检测的操作繁琐，耗时较长，通量低，不适于临床检验和大规模的 血液筛查。

发明内容

针对传统检测手段中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人免疫缺陷病 毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速 联检试剂盒，包括HIV检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，所述HIV 检测引物包括核苷酸如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的 下游引物，HIV检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述HBV检测引物包括核苷酸如 SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，HBV检测探针 的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述HCV检测引物包括核苷酸如SEQIDNO.7所示的上 游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的下游引物，HCV检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；所述HIV检测探针、HBV检测探针和HCV检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬 灭基团。

优选地，所述HIV检测探针、HBV检测探针和HCV检测探针的5’端标记有荧光报告基 团，3’端标记有荧光淬灭基团。

进一步优选地，所述HIV检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端 标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。

进一步优选地，所述HBV检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端 标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。

进一步优选地，所述HCV检测探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端 标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。

本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行人免疫缺陷病毒、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒检测，根据扩增及检测情况可分析判断人免疫缺陷病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还 可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、逆转录酶、TaqDNA 聚合酶、无菌水(DEPC-ddH₂O)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂 均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根 据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、逆转录酶、TaqDNA聚合 酶、无菌水(DEPC-ddH₂O)均为常见组分，其含量亦为常规。

所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应 液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、逆转录 酶、TaqDNA聚合酶、无菌水(DEPC-ddH₂O)。加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得 PCR反应体系。

所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有HIV特异性扩增片段的假 病毒、含有HBV特异性扩增片段的假病毒和含有HCV特异性扩增片段的假病毒。

优选地，HIV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。

优选地，HBV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。

优选地，HCV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水 (DEPC-ddH₂O)、生理盐水等。

本发明的第二方面，提供了前述人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快 速联检试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品核酸；

(2)加样：将样品核酸、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管 中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述HIV检 测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

步骤(1)中，提取样品核酸为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)45℃10min；(b)95℃15min；(c)95 ℃15sec；(d)60℃60sec；步骤(c)-(d)循环45次。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒快速联检产品中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

使用多重荧光PCR技术，在单个PCR反应管中通过一次反应同时检测HIV,HBV,HCV 这三种病毒的感染情况，检测灵敏度高，特异性好，由仪器直接检测和读取荧光信号，减少 了人工误差，缩短了实验周期；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进 行，降低了样本间交叉污染的风险。

附图说明

图1：待检阳性对照品中HIV检测灵敏度评价，样品V1-V4的浓度依次为1×10⁷IU/ ml、1×10⁶IU/ml、1×10⁵IU/ml、1×10⁴IU/ml，HIV检测结果均为阳性，表明在此范围内试剂 盒检测HIV的效果很好，灵敏度在1×10⁴IU/ml。

图2：待测阳性对照品中HBV检测灵敏度评价，样品V1-V4的浓度依次为1×10⁷IU/ ml、1×10⁶IU/ml、1×10⁵IU/ml、1×10⁴IU/ml，HBV检测结果均为阳性，表明在此范围内试剂 盒检测HBV的效果很好，灵敏度在1×10⁴IU/ml。

图3：待检阳性对照品中HCV检测灵敏度评价，样品V1-V4的浓度依次为1×10⁷IU/ ml、1×10⁶IU/ml、1×10⁵IU/ml、1×10⁴IU/ml，HCV检测结果均为阳性，表明在此范围内试剂 盒检测HCV的效果很好，灵敏度在1×10⁴IU/ml。

图4-1：实施例3中1号样品检测结果。

图4-2：实施例3中2号样品检测结果。

图4-3：实施例3中3号样品检测结果。

图4-4：实施例3中4号样品检测结果。

图4-5：实施例3中5号样品检测结果。

图4-6：实施例3中6号样品检测结果。

图4-7：实施例3中7号样品检测结果。

图4-8：实施例3中8号样品检测结果。

图4-9：实施例3中9号样品检测结果。

图4-10：实施例3中10号样品检测结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。

实施例1试剂盒的制备

分别合成HIV检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，其核苷 酸序列如下表1所示：

表1

上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合配成多重荧光PCR检测混合液。所 述多重荧光PCR检测混合液中，上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规 用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可 以是含有配置好的含有各组引物对及探针的多重荧光PCR检测混合液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、逆转录酶、TaqDNA聚 合酶、、无菌水(DEPC-ddH₂O)、样品基因组DNA/RNA提取试剂等。

实施例2试剂盒的灵敏度评价

实验目的：确定本发明(实施例1)多重荧光PCR试剂盒的检出限(最低检测浓度)

实验方法：

1.阳性对照品的准备：

构建含有HIV、HBV和HCV特异性扩增片段的假病毒作为阳性对照品，构建方法参考 文献《耐核糖核酸酶内含长片段嵌合体RNA的病毒样颗粒的构建和表达(2008)》进行。

所构建的假病毒的核酸序列经过Sanger法测序验证，含有实施例1中HIV、HBV和 HCV3组检测引物对的扩增子片段，可以被前述的3种引物和探针识别。

其中，HIV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，具体为：

GGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGATACAGTGCAGGGGAGAGAATAATAGACATAA TAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGAC AGCAGAGACCCTATTTGGAA。

HBV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，具体为：

CGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTAT GTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG。

HCV特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，具体为：

CTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGA GAGCCATAGTGGTCTG。

取上述构建好的3种假病毒混合后进行浓度校准至混合液中含有每种假病毒的浓 度均为1×10⁷IU/ml，分为4份，分别按1：1、1：10、1：100、1：1000、的比例用ddH₂O做梯度稀释， 最终获得待检阳性对照样品V1、V2、V3、V4，浓度分别为1×10⁷IU/ml、1×10⁶IU/ml、1× 10⁵IU/ml、1×10⁴IU/ml。

2.PCR扩增反应

首先，配置多重荧光PCR检测混合液，具体组成成分及含量可如下表2所示：

表2

然后，配制PCR反应体系，如下表3所示：

表3

成分 用量 多重荧光PCR检测混合液 19μl 逆转录酶+Taq DNA聚合酶(体积比4:6) 1μl 待检样品 5μl 共 25μl

此次灵敏度检测共设4个浓度梯度，对应上述待检阳性对照样品V1、V2、V3、V4，加 阴性对照(DEPC-ddH₂O)一管，共进行5个PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR 检测混合液5×19μl，逆转录酶+TaqDNA聚合酶(4:6)5×1μl，振荡混匀并瞬时离心后取混 合液20μl分置于5个PCR反应管中。然后向1～4号管中分别加入5μl浓度依次为浓度分别为 浓度分别为1×10⁷IU/ml、1×10⁶IU/ml、1×10⁵IU/ml、1×10⁴IU/m的待检阳性对照样品V1、 V2、V3、V4，再向5号管中加入5μlDEPC-ddH₂O作为阴性对照。盖紧管盖，立即进行PCR扩增反 应。

3.PCR反应

此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，反应条件设置为：

步骤(3)-(4)循环45次；在循环中的60℃反应阶段进行单点荧光检测。

4.结果分析

本次实验的荧光扩增曲线分别如图1～3所示。

各样品的CT值如下表4所示：

表4

该实验结果表明：不同浓度的待检阳性对照样品V1～V4在荧光检测过程中均为阳 性，表明在样品浓度1×10⁴IU/ml～1×10⁷IU/ml范围内，试剂盒检测HIV-1、HBV、HCV的效果 都很好，最低检出限均在1×10⁴IU/ml之下。

实施例3试剂盒检测效果评价

实验方法：

1.样本处理：

所用样本包括：HIV、HBV、HCV病人血清样本各2例，健康人血清样本2例。

上述血清样本均使用上海之江生物科技股份有限公司生产的核糖核酸(RNA)抽提 试剂盒(磁珠柱提取法)进行RNA提取。

磁珠法抽提病毒RNA试剂盒的组成成分如下表5：

表5

成分 体积/人份 1 亲和柱 1管 2 结合缓冲液 500μl 3 洗涤液A 1ml 4 洗涤液W 1ml 5 洗脱液 50μl 6 磁珠 20μl 7 RNA助沉剂 6μl

磁珠法抽提病毒RNA试剂盒的使用方法具体为：

①准备试剂：洗涤液首次使用前，按瓶身说明加入乙醇并混匀，做好标记；磁珠使 用前振荡混匀，RNA助沉剂使用前振荡混匀；

②按上表所述用量，将n人份的RNA助沉剂、磁珠、加入结合缓冲液，混匀；

③从2中混匀的液体取526μl于1.5ml离心管中，每管加入140μl血清样品，混合后， 涡旋振荡10sec后静置3min；

④将3中混匀静置好的体系转置于亲和株中，13000rpm离心40sec，弃去收集管废 液；

⑤洗涤液A洗涤2次：加入500μl洗涤液A，13000rpm离心40sec，弃去收集管废液，再 重复一次；

⑥洗涤液W洗涤2次：加入500μl洗涤液W，13000rpm离心15sec，弃去收集管废液，再 重复一次；

⑦亲和柱放入干净的1.5ml离心管，13000rpm离心2min，充分干燥

⑧亲和柱放入RNAnasefree的1.5ml离心管中，50μl洗脱液(预热至65℃)，室温静 置2min，然后13000rpm离心2min洗脱核酸于离心管中，-20℃保存备用。

2.配制PCR反应体系，如下表6所示：

表6

成分 用量 多重荧光PCR检测混合液(同实施例2) 19μl 逆转录酶+Taq DNA聚合酶(体积比4:6) 1μl 核酸提取液 5μl 总体积 25μl

此次选取不同类型的样本共8个，加阴性对照/阳性对照反应各一，共需进行10管 PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液10×19μl，逆转录酶+Taq DNA聚合酶(4:6)10×1μl，振荡混匀并瞬时离心后取混合液20μl分置于10个PCR反应管中， 最后向1～8号反应管中分别加入5μl待检样品的核酸提取液，9号管中加入5μl1×10⁶IU/ ml假病毒阳性对照样品，10号反应管中加入5μlDEPC-ddH₂O作为阴性对照。加样完成后迅 速盖好管盖，进行PCR扩增反应。

3.PCR扩增

此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，反应条件设置为：

步骤(3)-(4)循环45次；在循环中的60℃反应阶段进行单点荧光检测。

阈值设定原则为：阈值线刚好超过阴性对照(DEPC-ddH₂O)的最高点。

4.结果分析：

各样本的扩增曲线如图4-1到图4-10所示。

实验结果如下表7所示：

表7

如表中所示，在此次检测的样本中：1号为HIV,HBV混合感染，2号为HIV单阳性，3号 为HBV单阳性，4号为HBV,HCV混合感染，5号、6号均为HCV单阳性，7号、8号为健康人，各项检 测均为阴性，9号是阳性对照品，三个检测结果均为阳性，证明此次PCR扩增反应正常，荧光 检测系统正常；10号为阴性对照，三个检测结果均为阴性，证明此次PCR扩增反应无污染。上 述所有检测结果为阳性的样本均经过Sanger法测序验证无误，阳性结果准确率100％。可见 本试剂盒的检测结果具有很好的特异性和准确度。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。