一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。本发明脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆，该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能力，采用PRP代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，并且可应用于临床。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物 及其成骨诱导方法。

背景技术

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清 创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。较小的骨缺损(通常指8mm以下)，对于 一个健康的非吸烟者来说，有可能自行愈合；但骨缺损过大，或者是在较小的骨头上的骨缺 损，很难完全愈合。这就需要手术的干预，主要方法包括：骨移植、人工骨和组织工程骨。

骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经 体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解 吸收的细胞支架或称细胞外基质上，这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有 利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上 生长，然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细 胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。因此足够量的成骨细胞在骨组织工程中成 为关键因素。如何通过诱导获得足够量的成骨种子细胞，并在诱导过程中维持种子细胞的 表型特征成为骨组织工程研究中的热点。

脂肪组织是人体储存最大、容易获取和应用的组织，具有很大的临床应用前景。脂 肪间充质干细胞(ADSCs)是一种成体干细胞，具有向血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞等 多向分化的潜能。目前，间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化是骨组织工程研究中的热点， 诱导的成骨细胞可应用于治疗骨头坏死、骨折后骨延迟愈合等骨科疾病。通常采用分离自 体脂肪间充质干细胞在体外扩增并向成骨诱导培养后植入体内。从抽取的脂肪组织中提取 的间充质干细胞作为介质在组织工程应用中取得明显成功。

研究发现，钙粘附蛋白-11(cadherin-11)能够诱导间充质细胞向成骨细胞的分 化。钙粘附蛋白-11为钙粘附蛋白家族成员，参与多种生物学过程，如组织形成、胚胎发育、 骨组织形成等。成骨细胞持续表达cadherin-11，在骨和软骨中优先表达，控制着间充质细 胞向成骨细胞和软骨细胞的分化。但单纯采用钙粘附蛋白-11对间充质干细胞进行诱导时， 诱导分化率较弱。因此，对于能够提高脂肪间充质干细胞向成骨细胞诱导分化能力的技术 仍有需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方 法。该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能 力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，包括钙粘附蛋白-11和富 血小板血浆(PRP)。

本发明发现将钙粘附蛋白-11和富血小板血浆按一定比例联合使用后，可显著提 高脂肪间充质干细胞向成骨细胞的转化效率，增强了成骨诱导分化能力。

作为优选，以μg/mL计，钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为(0.1～1)：(0.05 ～0.1)。

在本发明提供的一些实施例中，以μg/mL计，钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的比 例为0.1：0.1。

在本发明提供的另一些实施例中，以μg/mL计，钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的 比例为0.5：0.08。

在本发明提供的另一些实施例中，以μg/mL计，钙粘附蛋白-11与富血小板血浆的 比例为1：0.05。

作为优选，该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物还包括基础培养基。

作为优选，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为：

钙粘附蛋白-11：0.1～1μg/mL；

富血小板血浆：0.05～0.1mL/mL；

基础培养基：补足。

在本发明提供的一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量 为：

钙粘附蛋白-11：0.1μg/mL；

富血小板血浆：0.1mL/mL；

基础培养基：补足。

在本发明提供的另一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用 量为：

钙粘附蛋白-11：0.5μg/mL；

富血小板血浆：0.08mL/mL；

基础培养基：补足。

在本发明提供的另一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用 量为：

钙粘附蛋白-11：1μg/mL；

富血小板血浆：0.05mL/mL；

基础培养基：补足。

在本发明提供的一些实施例中，富血小板血浆的制备方法为：将静脉血离心，取上 层血浆和白膜层，离心，取下层1/4体积的血浆，得到富血小板血浆。

本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法，采用本发明提供的脂肪间 充质干细胞成骨诱导组合物诱导培养脂肪间充质干细胞，获得成骨细胞。

作为优选，脂肪间充质干细胞为P3～P5代脂肪间充质干细胞。

在本发明提供的一些实施例中，脂肪间充质干细胞为P3代脂肪间充质干细胞。

作为优选，诱导培养的时间为14～20天。

在本发明提供的一些实施例中，诱导培养的时间为14天。

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。该组合 物包括钙粘附蛋白-11和富血小板血浆。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细 胞的成骨诱导分化能力；

2、本发明采用PRP代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，并且可应用于 临床。

附图说明

图1示P3代脂肪干细胞的细胞形态图片；其中图1-1为放大40倍的图片，图1-2为放 大100倍的图片；

图2示P3代脂肪干细胞的流式鉴定图片；其中图2-1、2-2、2-3为对照组流式鉴定结 果，2-1示空白对照，2-2示CD73、HLA-DR的表达情况，2-3示CD90、CD45的表达情况；图2-4、2- 5、2-6为样品组流式鉴定结果，2-4示空白对照，2-5示CD73、HLA-DR的表达情况，2-6示CD90、 CD45的表达情况；

图3示各组脂肪干细胞成骨分化诱导情况，其中，3-1示脂肪干细胞诱导前茜素红 染色情况(40×)，3-2示对照组1脂肪干细胞采用普通培养基诱导后的茜素红染色情况(40 ×)，3-3示对照组2脂肪干细胞采用商品化培养基诱导后的茜素红染色情况(40×)，3-4示 实验组1脂肪干细胞采用cadherin-11诱导后的茜素红染色情况(40×)，3-5示实验组2脂肪 干细胞采用PRP诱导后的茜素红染色情况(40×)，3-6示实验组3脂肪干细胞采用cadherin- 11和PRP联合诱导后的茜素红染色情况(40×)。

具体实施方式

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范 围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法中所用生物 材料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、脂肪干细胞原代分离

待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体，加入等体积的生理盐水清洗脂肪 组织2次，吸弃下方溶液；将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，每管中加入等体积的 0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消 化50min；消化完成后离心，1500rpm离心10min；弃去离心后的脂肪和脂肪油，每管加入40mL 生理盐水重悬细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，用普通培养基(DMEM/F12+10％FBS)重悬 细胞，并接种至培养皿中，待细胞汇合度达到80-90％时，进行传代处理。

2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定

取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的 消化液进行消化，之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗 涤细胞2次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵-10⁶个/mL。取2个上样管，每管加入500μL的单 细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面 分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温，避光，孵育20min；PBS洗两遍，以去除未结合 的抗体，500μL1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴定表面标记。结果见图2。

由图2所示，扩增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表 达，符合干细胞的特性。

3、富血小板血浆的制备

加抗凝剂的静脉血低温高速离心，第一次离心3000转4min，吸取上层血浆、白膜层 至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min，吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP)，余下1/4即为 富血小板血浆(PRP)。分装后-80℃保存。

4、脂肪干细胞成骨分化诱导

1)实验分组：

对照组1：脂肪干细胞普通培养基组；

对照组2：商品化培养基诱导组；

实验组1：基础培养基+0.1μg/mLcadherin-11组；

实验组2：基础培养基+10％(体积百分比)PRP组；

实验组3：基础培养基+0.1μg/mLcadherin-11+10％PRP组。

2)取第3代的ADSCs，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进 行消化，之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密 度为1x10⁴/mL，接种于6孔板中，每孔2mL。

当细胞达到40％-50％融合时，分别应用实验分组所示培养基，同样环境下诱导培 养，每3天更换诱导培养基，培养14天后，部分细胞采用茜素红进行染色，观察形成钙结节的 情况；部分细胞用于抽提RNA，逆转录成cDNA，以此cDNA为模板，以上游引物: TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP)；上游引物: TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫 荧光定量PCR，其中beta-actin作为内参，检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。 最后根据根据得到的C(t)值，以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目 的基因相对于诱导前的表达量。

3)茜素红染色结果如下：

由图3可知，对照组1和诱导前细胞形态并无差别，细胞未被茜素红染色，说明脂肪 干细胞并未向成骨细胞诱导分化；对照组2、实验组1、实验组2和实验组3中各有一部分细胞 被茜素红染成红色，说明细胞诱导分化过程中形成钙结节；而形成钙结节的多少顺序分别 为：实验组3、实验组1、对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加入cadherin-11和 PRP的诱导液更易使细胞诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两者联合使用既可 提高诱导分化能力，又代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性。

4)荧光定量PCR分析结果如下：

表1荧光定量PCR分析结果

其中：*表示和诱导前相比较，P<0.05；**表示和诱导前相比较，P<0.01。

由表1可知，对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化，而对照组2、 实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高，说明脂肪干细 胞成功向成骨细胞分化；而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为：实验组3、实验组1、 对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞 诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两者联合使用既可提高诱导分化能力，又代 替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，和染色结果一致。

实施例2

1、脂肪干细胞原代分离

待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体，加入等体积的生理盐水清洗脂肪 组织2次，吸弃下方溶液；将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，每管中加入等体积的 0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R 消化50min；消化完成后离心，1500rpm离心10min；弃去离心后的脂肪和脂肪油，每管加入 40mL生理盐水重悬细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，用普通培养基(DMEM/F12+10％FBS) 重悬细胞，并接种至培养皿中，待细胞汇合度达到80-90％时，进行传代处理。

2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定

取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的 消化液进行消化，之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗 涤细胞2次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵-10⁶个/mL。取2个上样管，每管加入500μL的单 细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面 分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温，避光，孵育20min；PBS洗两遍，以去除未结合 的抗体，500μL1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴定表面标记。结果与图2相近。可见，扩 增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表达，符合干细胞的特性。

3、富血小板血浆的制备

加抗凝剂的静脉血低温高速离心，第一次离心3000转4min，吸取上层血浆、白膜层 至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min，吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP)，余下1/4即为 富血小板血浆。分装后-80℃保存。

4、脂肪干细胞成骨分化诱导

1)实验分组：

对照组1：脂肪干细胞普通培养基组；

对照组2：商品化培养基诱导组；

实验组1：基础培养基+0.5μg/mLcadherin-11组；

实验组2：基础培养基+8％PRP组；

实验组3：基础培养基+0.5μg/mLcadherin-11+8％PRP组。

2)取第3代的ADSCs，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进 行消化，之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密 度为1×10⁴/mL，接种于6孔板中，每孔2mL。

当细胞达到40％-50％融合时，分别应用实验分组所示培养基，同样环境下诱导培 养，每3天更换诱导培养基，培养14天后，部分细胞采用茜素红进行染色，观察形成钙结节的 情况；部分细胞用于抽提RNA，逆转录成cDNA，以此cDNA为模板，以上游引物: TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP)；上游引物: TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫 荧光定量PCR，其中beta-actin作为内参，检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。 最后根据根据得到的C(t)值，以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目 的基因相对于诱导前的表达量。

3)茜素红染色结果与图3相似，对照组1和诱导前细胞形态并无差别，细胞未被茜 素红染色，说明脂肪干细胞并未向成骨细胞诱导分化；对照组2、实验组1、实验组2和实验组 3中各有一部分细胞被茜素红染成红色，说明细胞诱导分化过程中形成钙结节；而形成钙结 节的多少顺序分别为：实验组3、实验组1、对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加 入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两 者联合使用既可提高诱导分化能力，又代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性。

4)荧光定量PCR分析结果如下：

表2荧光定量PCR分析结果

组别 ALP相对表达量 runx2相对表达量 诱导前 1 1 对照组1 1.0 1.0 对照组2 7.4** 15.2** 实验组1 8.4** 15.3** 实验组2 1.6** 2.2** 实验组3 9.6** 18.3**

其中：*表示和诱导前相比较，P<0.05；**表示和诱导前相比较，P<0.01。

由表2可知，对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化，而对照组2、 实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高，说明脂肪干细 胞成功向成骨细胞分化；而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为：实验组3、实验组1、 对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞 诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两者联合使用既可提高诱导分化能力，又代 替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，和染色结果一致。

实施例3

1、脂肪干细胞原代分离

待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体，加入等体积的生理盐水清洗脂肪 组织2次，吸弃下方溶液；将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，每管中加入等体积的 0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消 化50min；消化完成后离心，1500rpm离心10min；弃去离心后的脂肪和脂肪油，每管加入40mL 生理盐水重悬细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，用普通培养基(DMEM/F12+10％FBS)重悬 细胞，并接种至培养皿中，待细胞汇合度达到80-90％时，进行传代处理。

2、人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定

取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的 消化液进行消化，之后用适量血清终止消化1000rpm离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗 涤细胞2次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵-10⁶个/ml。取2个上样管，每管加入500μL的单 细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各加入2μLFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面 分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。室温，避光，孵育20min；PBS洗两遍，以去除未结合 的抗体，500μL1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴定表面标记。结果与图2相近。可见，扩 增第3代的ADSCsCD73、CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表达，符合干细胞的特性。

3、富血小板血浆的制备

加抗凝剂的静脉血低温高速离心，第一次离心3000转4min，吸取上层血浆、白膜层 至另一抗凝剂采血管中。3000转离心15min，吸去上层3/4贫血小板血浆(PPP)，余下1/4即为 富血小板血浆。分装后-80℃保存。

4、脂肪干细胞成骨分化诱导

1)实验分组：

对照组1：脂肪干细胞普通培养基组；

对照组2：商品化培养基诱导组；

实验组1：基础培养基+1μg/mLcadherin-11组；

实验组2：基础培养基+5％PRP组；

实验组3：基础培养基+1μg/mLcadherin-11+5％PRP组。

2)取第3代的ADSCs，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进 行消化，之后用适量血清终止消化。1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密 度为1×10⁴/mL，接种于6孔板中，每孔2mL。

当细胞达到40％-50％融合时，分别应用实验分组所示培养基，同样环境下诱导培 养，每3天更换诱导培养基，培养14天后，部分细胞采用茜素红进行染色，观察形成钙结节的 情况；部分细胞用于抽提RNA，逆转录成cDNA，以此cDNA为模板，以上游引物: TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物:TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP)；上游引物: TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物:TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)为引物进行免疫 荧光定量PCR，其中beta-actin作为内参，检测成骨细胞标志蛋白ALP、runx2的基因表达量。 最后根据根据得到的C(t)值，以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目 的基因相对于诱导前的表达量。

3)茜素红染色结果与图3相似，对照组1和诱导前细胞形态并无差别，细胞未被茜 素红染色，说明脂肪干细胞并未向成骨细胞诱导分化；对照组2、实验组1、实验组2和实验组 3中各有一部分细胞被茜素红染成红色，说明细胞诱导分化过程中形成钙结节；而形成钙结 节的多少顺序分别为：实验组3、实验组1、对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加 入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两 者联合使用既可提高诱导分化能力，又代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性。

4)荧光定量PCR分析结果如下：

表3荧光定量PCR分析结果

组别 ALP相对表达量 runx2相对表达量 诱导前 1 1 对照组1 1.0 1.1 对照组2 7.0** 14.9** 实验组1 7.9** 15.0** 实验组2 1.4** 1.9** 实验组3 9.8** 19.6**

其中：*表示和诱导前相比较，P<0.05；**表示和诱导前相比较，P<0.01。

由表3可知，对照组1和诱导前相比ALP和runx2基因表达无明显变化，而对照组2、 实验组1、实验组2和实验组3中细胞的cadherin和runx2基因表达量均升高，说明脂肪干细 胞成功向成骨细胞分化；而ALP和runx2基因表达量升高的顺序分别为：实验组3、实验组1、 对照组2、实验组2，说明和商品诱导液相比较，加入cadherin-11和PRP的诱导液更易使细胞 诱导分化，但是PRP单独的诱导分化能力较弱，两者联合使用既可提高诱导分化能力，又代 替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，和染色结果一致。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。