一种大米蛋白/阿魏酸复合物或交联物的制备方法

摘要

一种大米蛋白/阿魏酸复合物或交联物的制备方法，包括如下步骤：(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白的质量浓度为8～12mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.05～0.4mg/mL，漆酶的质量浓度为0～0.1mg/mL。(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，再冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物或大米蛋白/阿魏酸交联物。本发明可实现连续化生产，大米蛋白/阿魏酸交联物具有较好的体外抗氧化活性；可应用到一些抗氧化能力强的医疗、食品与高分子领域。

说明书

技术领域

本发明属于谷物蛋白深加工领域，具体是一种大米蛋白/阿魏酸复合物或交联物的制备方 法。

背景技术

人体新陈代谢产生的自由基对机体组织细胞具有很强的杀伤作用，可引起细胞死亡和组 织损伤，如动脉粥样硬化、癌症、肺损伤和衰老等。植物蛋白作为一种，因其具有加工特性 和营养特性而成为近年来研究的热点。大米蛋白(Riceprotein,RP)是一种优质的植物蛋白， 具有氨基酸组成平衡合理，口感温和，低过敏性和降低胆固醇等优点；而且大米蛋白中含有 人体所需的各种氨基酸，配比合理，符合WHO/FAO推荐的理想模式。但是以大米蛋白制备 的富含油脂的食品易发生抗氧化降解，多酚类物质由于其具有天然的抗氧化特性，越来越多 的应用到富含油脂的食品加工中，从而起到抗氧化作用。蛋白与多酚的结合即保留蛋白质的 功能性质，同时又赋予了蛋白质更高的抗氧化特性，这些具有更高活性的产物应用于食品、 化妆品保健、医药领域有很好市场前景。

阿魏酸(Ferulicacid,FA)是谷物中的常见的酚酸类物质，有较强的抑制脂类的氧化降解的 能力和低毒性，广泛使用在食品和药品行业。研究发现自然条件下，阿魏酸与蛋白质会发生 结合反应，阿魏酸与蛋白质能够以非共价键(氢键、疏水或离子的相互作用)或共价键相连。 此外，碱性或者高温的反应条件将会促进蛋白与酚酸更好的交联，可能是由于阿魏酸在碱性 条件下易被氧化成醌，醌可以与蛋白质分子中的氨基和巯基发生交联反应。但是化学法存在 以下不足：反应条件在高温以及碱性条件下可能会产生有毒中间产物，食用性差，颜色深， 反应条件不稳定。一般来说，酶法交联条件比较温和。

漆酶(Laccase,LAC)是一种多酚氧化酶，能结合多个铜离子，属于铜蓝氧化酶。漆酶作为 生物催化剂，不仅具有高效率的催化效果，而且其催化的最终产物是水，因此也是一种绿色 催化剂。漆酶催化酚酸与蛋白质交联有效改善蛋白的功能性质和生理活性(抑菌作用、抗氧 化活性)，可能归因于酚酸经漆酶氧化后能够与蛋白质中氨基、巯基发生反应引起蛋白质的交 联，交联物保留了酚类活性基团，从而提高蛋白质的天然属性，这些产物可以应用到一些抗 氧化能力强的医疗、食品与高分子领域。因此，本文选择阿魏酸与大米蛋白相互结合以期在 获得高抗氧化活性的同时改善其功能性质，这对充分有效地利用大米蛋白资源具有深远的意 义。

发明内容

本发明针对现有大米蛋白与阿魏酸相互作用及其抗氧化机制研究并不完善，制备具有更 高抗氧化活性的阿魏酸/大米蛋白交联物，并且在体系中添加多酚氧化酶，从而获得具有更高 抗氧化活性的功能性大米蛋白配料，提供一种新型的酶法制备功能性米糠蛋白的方法。

本发明的技术方案如下：

一种大米蛋白/阿魏酸复合物或交联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白 的质量浓度为8～12mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.05～0.4mg/mL，漆酶的质量浓度为 0～0.1mg/mL，

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，通过透析除去未与大米蛋白结合 的游离阿魏酸，再冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物或大米蛋白/阿魏酸交联物。

所述大米蛋白的制备方法如下，

(1)将脱脂的大米粉按1:10(w/v)的料液比分散于水中，搅拌均匀得到大米粉分散液，

(2)将大米粉分散液的pH调节至10.0，室温25℃搅拌2h，再离心得到上清液，

(3)将上清液pH调节至4.8得到蛋白质沉淀，蛋白质沉淀加水得到蛋白液，蛋白液经 中和、透析、冷冻干燥后获得大米蛋白。

所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液配制方法如下：

(1)将大米蛋白溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到 大米蛋白分散液；

(2)将阿魏酸溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，水浴加热促进其完全溶解， 得到阿魏酸溶液；

(3)将大米蛋白分散液和阿魏酸溶液混合均匀，再加入漆酶搅拌均匀，得到大米蛋白/ 阿魏酸/漆酶混合液。

步骤(2)中，大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液的反应工艺条件如下：反应温度为25～30℃， 反应时间为0.5～4h。

步骤(2)中，当大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中漆酶的质量浓度不为零时，反应工艺条 件如下：反应温度为25～30℃，反应时间为3～4h。

步骤(2)中，所述透析的工艺条件如下：透析温度为4℃，透析时间为24h。

步骤(1)中，阿魏酸与漆酶的质量浓度之比为4:1。

上述大米蛋白/阿魏酸复合物或交联物的制备方法，当漆酶的添加量为零时，得到的是大 米蛋白/阿魏酸复合物，当漆酶的添加量不为零时，由于发生了酶法接枝反应，得到的是大米 蛋白/阿魏酸交联物。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明可实现连续化生产，大米蛋白/阿魏酸交联物具有较好的体外抗氧化活性；可 应用到一些抗氧化能力强的医疗、食品与高分子领域。

(2)本发明方法为一种酶法手段，温和、安全；实验操作简单。

具体实施方式

实施例1

一种大米蛋白/阿魏酸复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白 的质量浓度为10mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.4mg/mL，漆酶的质量浓度为0mg/mL。

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，反应温度为25℃，反应时间为4 h，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，透析温度为4℃，透析时间为24h，再 冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物。

所述大米蛋白的制备方法如下，

(1)将脱脂的大米粉按1:10(w/v)的料液比分散于水中，搅拌均匀得到大米粉分散液，

(2)将大米粉分散液的pH调节至10.0，室温25℃搅拌2h，再离心得到上清液，

(3)将上清液pH调节至4.8得到蛋白质沉淀，蛋白质沉淀加水得到蛋白液，蛋白液经 中和、透析、冷冻干燥后获得大米蛋白。

所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液配制方法如下：

(1)将大米蛋白溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到 大米蛋白分散液；

(2)将阿魏酸溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，水浴加热促进其完全溶解， 得到阿魏酸溶液；

(3)将大米蛋白分散液和阿魏酸溶液混合均匀，再加入漆酶搅拌均匀，得到大米蛋白/ 阿魏酸/漆酶混合液。

表1实施例1的指标

从表1可以看出，相比较大米蛋白清除DPPH自由基能力(32.305％)，大米蛋白与阿魏 酸结合后清除DPPH自由基能力增加到46.578％，总抗氧化能力指标(清除ABTS自由基能 力和氧自由基吸收能力ORAC)同样高于未处理的大米蛋白，说明大米蛋白/阿魏酸在自然条 件下形成的大米蛋白/阿魏酸的复合改善大米蛋白的抗氧化活性。

实施例2

一种大米蛋白/阿魏酸交联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白 的质量浓度为10mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.4mg/mL，漆酶的质量浓度为0.1mg/mL。

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，反应温度为25℃，反应时间为4 h，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，透析温度为4℃，透析时间为24h，再 冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸交联物。

所述大米蛋白的制备方法如下，

(1)将脱脂的大米粉按1:10(w/v)的料液比分散于水中，搅拌均匀得到大米粉分散液，

(2)将大米粉分散液的pH调节至10.0，室温25℃搅拌2h，再离心得到上清液，

(3)将上清液pH调节至4.8得到蛋白质沉淀，蛋白质沉淀加水得到蛋白液，蛋白液经 中和、透析、冷冻干燥后获得大米蛋白。

所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液配制方法如下：

(1)将大米蛋白溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到 大米蛋白分散液；

(2)将阿魏酸溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，水浴加热促进其完全溶解， 得到阿魏酸溶液；

(3)将大米蛋白分散液和阿魏酸溶液混合均匀，再加入漆酶搅拌均匀，得到大米蛋白/ 阿魏酸/漆酶混合液。

表2实施例2的指标

从表2可以看出，漆酶催化氧化阿魏酸接枝到大米蛋白微粒后，大米蛋白/阿魏酸交联物 清除DPPH自由基能力为71.431％，显著高于大米蛋白(32.305％)和大米蛋白/阿魏酸复合物 (46.578％)，说明漆酶催化大米蛋白/阿魏酸交联具有更高的抗氧化活性，可能是由于大米蛋 白/阿魏酸交联绑定了更多的阿魏酸的羟基基团。清除ABTS自由基能力和氧自由基吸收能力 ORAC结果趋势与清除DPPH自由基能力一致，因此，添加漆酶催化大米蛋白与阿魏酸的结 合得到的交联物具有更高的抗氧化活性。

实施例3

一种大米蛋白/阿魏酸交联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，本实施例进行五个梯度的对比试验，各个试验 的大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白的质量浓度均为10mg/mL，阿魏酸的质量浓度 分别为0mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL以及0.4mg/mL，各个试验中漆酶的质 量浓度为对应阿魏酸的质量浓度的四分之一。

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，反应温度为25℃，反应时间为4 h，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，透析温度为4℃，透析时间为24h，再 冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物或大米蛋白/阿魏酸交联物。

所述大米蛋白的制备方法如下，

(1)将脱脂的大米粉按1:10(w/v)的料液比分散于水中，搅拌均匀得到大米粉分散液，

(2)将大米粉分散液的pH调节至10.0，室温25℃搅拌2h，再离心得到上清液，

(3)将上清液pH调节至4.8得到蛋白质沉淀，蛋白质沉淀加水得到蛋白液，蛋白液经 中和、透析、冷冻干燥后获得大米蛋白。

所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液配制方法如下：

(1)将大米蛋白溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到 大米蛋白分散液；

(2)将阿魏酸溶解在pH＝7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，水浴加热促进其完全溶解， 得到阿魏酸溶液；

(3)将大米蛋白分散液和阿魏酸溶液混合均匀，再加入漆酶搅拌均匀，得到大米蛋白/ 阿魏酸/漆酶混合液。

表3实施例3的指标

从表3可以看出，大米蛋白清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、ORAC值 分别为和32.305％，3.342％和0.695μMtrolox/g，随着阿魏酸浓度的增加，大米蛋白(RP) 与阿魏酸(FA)混合液的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、氧自由基吸收能 力ORAC值都显著提高，主要是由于混合液中游离的阿魏酸具有显著的抗氧化能力。漆酶催 化阿魏酸与大米蛋白共价结合后抗氧化能力较混合液中的抗氧化能力有所下降，这是由于 DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法测定的主要是体系中由游离多酚决定的抗氧化能 力，阿魏酸易被漆酶催化氧化，因此蛋白/多酚的共价相互作用明显是这些能力消弱。但是， 大米蛋白/阿魏酸交联物的抗氧化活性高于未处理的大米蛋白(RP)，可能的原因是阿魏酸的 氧化产物能够与大米蛋白中氨基和巯基发生反应，从而接枝到大米蛋白分子上，同时保留了 阿魏酸的抗氧化活性基团。最后，当阿魏酸的添加量达到0.4mg/mL时，抗氧化活性值达到 最大，采用此条件制备的大米蛋白/阿魏酸交联物具有更高的抗氧化活性。

实施例4

一种大米蛋白/阿魏酸交联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白 的质量浓度为8mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.1mg/mL，漆酶的质量浓度为0.025mg/mL。

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，反应温度为25℃，反应时间为4 h，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，透析温度为4℃，透析时间为24h，再 冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物或大米蛋白/阿魏酸交联物。

实施例5

一种大米蛋白/阿魏酸复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液，所述大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液中，大米蛋白 的质量浓度为12mg/mL，阿魏酸的质量浓度为0.2mg/mL。

(2)大米蛋白/阿魏酸/漆酶混合液经搅拌充分反应后，反应温度为25℃，反应时间为4 h，通过透析除去未与大米蛋白结合的游离阿魏酸，透析温度为4℃，透析时间为24h，再 冷冻干燥得到大米蛋白/阿魏酸复合物或大米蛋白/阿魏酸交联物。