非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)生物标志物蛋白

摘要

本发明提供生物标志物蛋白，其浓度或活性水平变化与非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)或用补体抑制剂对aHUS的临床上有意义的治疗相关。本发明还提供用于在生物流体中查询一个或多个所述生物标志物蛋白的浓度和/或活性的组合物和方法。除其他方面外，所述组合物和方法对于评估患上aHUS的风险、诊断aHUS、确定受试者是否在经历aHUS的第一次急性发作、监测aHUS的进展或消除、和/或监测对用补体抑制剂的治疗的响应或是对该种治疗进行优化来说是有用的。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号61/913,180和61/863,299的优先权，其申请日分别为 2013年12月6日和2013年8月7日。上述申请及本说明书全文引用的任何专利、专利申请及参 考文献的全部内容在此通过提述以其整体并入。

技术领域

本发明的领域为医药、免疫学、分子生物学、和蛋白质化学。

发明背景

溶血性尿毒综合征(HUS)的特征为血小板减少、微血管病性溶血性贫血、和急性肾 衰竭。HUS分为两类之一：腹泻相关的(D+HUS；也称为产生志贺毒素的大肠杆菌(STEC)-HUS 或典型HUS)和非腹泻或非典型HUS(aHUS)。D+HUS是最常见的形式，占超过90％的病例，并且 是由具有产生志贺样毒素的(shiga-liketoxin-producing)细菌(例如大肠杆菌O157：H7) 的在先疾病引起的。aHUS是少见的且死亡率高达25％。许多患此种疾病的患者会承受永久 的神经损伤或肾损伤，例如至少50％的aHUS患者进展至晚期肾衰竭(ESRF)。参见例如 Kavanagh等(2006)BritishMedicalBulletin77及78：5-22。

aHUS可以是遗传性的、获得性的、或特发性的。可遗传形式的aHUS可以与一些人补 体成分(包括例如补体因子H(CFH)、膜辅因子蛋白(MCP)、补体因子I(CFI)、C4b结合蛋白 (C4BP)、补体因子B(CFB)、和补体成分3(C3))中的突变相关。参见例如Caprioli等(2006) Blood108：1267-1279。编码CD55的基因中的一些突变虽然不涉及aHUS，但与aHUS的严重程 度有关。参见例如Esparza-Gordillo等(2005)HumMolGenet14：703-712。

直至近期，用于aHUS患者的治疗选择仍是有限的，并且常涉及血浆输注或血浆置 换。在一些情况下，aHUS患者经历单侧或双侧肾切除或肾移植(参见Artz等(2003) Transplantation76：821-826)。然而，接受治疗的患者中疾病常有复发。最近，美国和欧洲 批准了用药物治疗aHUS患者。尽管最终拥有了用于治疗aHUS患者的有用药物，但 仍然存在对于诊断aHUS患者以及监测aHUS的进展及消除的需求。

发明概述

本发明提供(除其他方面以外)多种蛋白，其在罹患aHUS的患者和/或正在接受补 体抑制剂治疗的aHUS患者的生物流体中的活性和/或浓度是异常的。下文中这些蛋白称为 “aHUS相关生物标志物蛋白”或“aHUS生物标志物蛋白”。例如，发明人已观察到aHUS患者的 血液(例如血清和/或血浆)和尿液中一些蛋白的浓度和/或活性是异常的。发明人还观察 到，在对人施用拮抗性抗-C5抗体(依库丽单抗(eculizumab))后，这些蛋白中一个亚组发生 了浓度变化。在一些实例中，一个或多个蛋白的浓度正常化。发明不受任何具体理论或作用 机制的束缚，发明人相信监测用补体抑制剂(如抗-C5抗体)治疗的患者的一个或多个此类 蛋白(aHUS生物标志物蛋白)的浓度变化对于例如诊断患者为患有aHUS或具有患上aHUS的 风险是有用的。监测一个或多个此类生物标志物蛋白的状态对于确定aHUS患者是否对补体 抑制剂的治疗有响应而言也是有用的。此外，评估所述生物标志物的一个或多个的状态对 于鉴定补体抑制剂(如抗-C5抗体)的如下剂量(阈值剂量)而言也是有用的，凭借所述剂量 (阈值剂量)的补体抑制剂对人体中aHUS生物标志物蛋白的一个或多个的浓度的作用足以 对疾病达到临床上有意义的效果(即足以治疗补体相关疾病，如aHUS)。

因此，在一个方面，本发明描述了用于监测或评价受试者(例如哺乳动物，如人)中 非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的状态的方法或用于评估受试者中 至少一个非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的浓度和活性水平的一者 或二者的方法。该方法包括在获取自受试者的生物流体中测量(i)生物流体中至少一个(例 如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)aHUS相关生物标志物蛋 白的浓度的一者或二者，其中所述aHUS相关生物标志物蛋白是表1中所示的生物标志物的 任一种，例如选自下组的一项：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的 C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、 凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补 体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白(clusterin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、 NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL- 6、清蛋白、IL-8、和CCL5。受试者可以是，例如患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的风 险的患者。受试者可以是已接受(或正在接受)补体抑制剂(例如补体成分C5抑制剂，如抗- C5抗体)治疗的受试者。所述治疗可以发生在从受试者获取样品之前少于一个月(例如少于 31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、 4、3、2、或1天)。该方法还可以包括确定受试者是否患有aHUS或具有患上aHUS的风险的步 骤。当已经用或正在用补体抑制剂(例如抗-C5抗体)按照预定的给药方案来治疗受试者时， 该方法还可以包括确定患者是否对补体抑制剂治疗是(治疗上)响应性的。

在另一个方面，发明描述了用于监测或评价受试者(例如哺乳动物，如人)中非典 型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的状态的方法或用于评估受试者中至少 一个非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的浓度和活性水平的一者或二 者的方法。该方法包括：(A)在获取自该受试者的生物流体中测量生物流体中至少一个(例 如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)aHUS相关生物标志物蛋 白的浓度，其中所述HUS相关生物标志物蛋白是表1中所示的生物标志物的任一种，例如选 自下组的一项：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血 调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+ 2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微球 蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP- 1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和CCL5；和(B) 记录(例如在电子患者记录中)测量结果或将所述测量结果传达给受试者、受试者的监护 人、或负责医护该受试者的医学专业人员。受试者可以是，例如患有aHUS、疑患有aHUS、或具 有患上aHUS的风险的人。受试者可以是已接受(或正在接受)补体抑制剂(例如补体成分C5 抑制剂，如抗-C5抗体)治疗的受试者。所述治疗可以发生在从受试者获取样品之前少于一 个月(例如少于31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1天)。该方法还可以包括确定受试者是否患有aHUS或具有患上 aHUS的风险的步骤。当已经用或正在用补体抑制剂(例如抗-C5抗体)按照预定的给药方案 来治疗受试者时，该方法还可以包括确定患者是否对补体抑制剂治疗是(治疗上)响应性 的。

在又一个方面，本发明描述了用于监测或确定患者是否具有患上血栓形成性微血 管病的风险的方法。该方法包括(A)在获取自受试者的生物流体中测量该生物流体中至少 一个(例如至少2、3或4个)与血栓形成或凝固有关的生物标志物蛋白的浓度，其中所述生物 标志物蛋白是表1或表11中所示的这些生物标志物的任一项，例如F1+2或D-二聚体；和(B) 记录(例如在电子患者记录中)测量结果或将所述测量结果传达给受试者、受试者的监护 人、或负责医护该受试者的医学专业人员。受试者可以是，例如患有aHUS、疑患有aHUS、或具 有患上aHUS的风险的人。受试者可以是已接受(或正在接受)补体抑制剂(例如补体成分C5 抑制剂，如抗-C5抗体)治疗的受试者。所述治疗可以发生在从受试者获取样品之前少于一 个月(例如少于31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1天)。该方法还可以包括使用本文所述的任何方法来确定受试者 是否患有aHUS或具有患上aHUS的风险(或证实aHUS的诊断)的步骤。当已经用或正在用补体 抑制剂(例如抗-C5抗体)按照预定的给药方案来治疗受试者时，该方法还可以包括确定患 者是否对补体抑制剂治疗是(治疗上)响应性的，即在用补体抑制剂治疗后发生了血栓形成 或凝固相关的生物标志物的一个或多个的浓度的降低。

在另一个方面，发明描述了用于监测或评价受试者(例如哺乳动物，如人)中非典 型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的状态的方法或用于评估受试者中至少 一个非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)相关生物标志物蛋白的浓度和活性水平的一者或二 者的方法。该方法包括：(A)在获取自受试者的生物流体中测量该生物流体中至少一个(例 如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个)aHUS相关生物标志物蛋白的浓度，其中所述aHUS相 关生物标志物蛋白是表1中所示的生物标志物的任一种，例如选自下组的一项：补体成分因 子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝 血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、 TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)；和(B)记录(例如在电子患者记录中)测量结果或将 所述测量结果传达给受试者、受试者的监护人、或负责医护该受试者的医学专业人员。受试 者可以是，例如患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的风险的人。受试者可以是已接受 (或正在接受)补体抑制剂(例如补体成分C5抑制剂，如抗-C5抗体)治疗的受试者。所述治疗 可以发生在从受试者获取样品之前少于一个月(例如少于31、30、29、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1天)。该方法还可以包 括确定受试者是否患有aHUS或具有患上aHUS的风险的步骤。当已经用或正在用补体抑制剂 (例如抗-C5抗体)按照预定的给药方案来治疗受试者时，该方法还可以包括确定患者是否 对补体抑制剂治疗是(治疗上)响应性的。

在一些实施方案中，本文所述的方法的任一种可以进一步包括确定受试者是否患 有aHUS或具有患上aHUS的风险。在一些实施方案中，与相同类型的正常对照生物流体中的 浓度相比，Ba、sC5b-9、C5a、sCD40L、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、 vWF、FABP-1、β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、清蛋白、NGAL、CXCL10、CXCL9、 IL-18、TNFR1、VCAM-1、MCP-1、VEGF、CCL5、IL-6、IFNγ的至少一项的升高的浓度说明受试者 患有aHUS或具有患上aHUS的风险。

在一些实施方案中，本文所述方法的任一种包括确定受试者是否已对使用补体抑 制剂的治疗有响应。在一些实施方案中，(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物 流体的样品中的浓度相比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、补体成分因子B的蛋白质水解片 段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM- 1、冯维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、sC5b9、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、CXCL10、CXCL9、和KIM-1 的至少一项的降低的浓度；或(b)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样 品中的浓度相比，CCL5的升高的浓度；说明受试者对使用所述抑制剂的治疗是响应性的。

在另一个方面，发明描述了用于监测受试者(例如哺乳动物，如人)对于使用补体 成分C5抑制剂的治疗的响应性的方法。该方法包括：在生物流体中确定至少两个aHUS相关 生物标志物蛋白的浓度，其中所述aHUS相关生物标志物蛋白是表1中所示的任一种，例如选 自下组的一项：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血 调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+ 2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微 球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1 (FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和 CCL5。该生物流体取自如下受试者：(i)患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的风险和 (ii)正在用(或是已经用，例如最近用)补体成分C5抑制剂按照预定的给药方案进行治疗。 按照此类方法，(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中的浓度相 比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的 C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子 (vWF)、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、 NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、CXCL10、CXCL9、和KIM-1的至少一项的降低的浓 度；或(b)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中的浓度相比，CCL5的 升高的浓度；说明受试者对使用所述抑制剂的治疗是响应性的。

在一些实施方案中，本文所述的方法的任一种包括确定受试者是否已对使用补体 抑制剂的治疗有响应。在一些实施方案中，与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物 流体的样品中的浓度相比，补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9 (sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β 2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少一项的 降低的浓度。

在另一个方面，发明描述了用于监测受试者对于使用补体抑制剂的治疗的响应性 的方法，其中所述方法包括：在获取自受试者的生物流体中确定至少两个aHUS相关生物标 志物蛋白的浓度，其中所述aHUS相关生物标志物蛋白选自下组：CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN- γ、IL-6、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原 片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、β2微 球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1 (FABP-1)、清蛋白、CXCL9、KIM-1、和CCL5。受试者患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的 风险，且所述受试者已经接受或正在接受补体抑制剂的治疗。(A)与抑制剂治疗前获取自受 试者的相同类型生物流体的样品中的浓度相比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、IL-6、补体 成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二 聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、 CXCL9、和KIM-1的至少一项的降低的浓度；或(B)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型 生物流体的样品中的浓度相比，CCL5的升高的浓度；说明该受试者对使用所述抑制剂的治 疗是响应性的。

在又一个方面，发明描述了用于减少TMA的数目、频率、或发生、发生可能性、或患 上TMA的风险的方法，其以足以引起至少两个与血栓形成或凝固相关的生物标志物蛋白的 生理变化的方式来使用补体抑制剂。该方法包括：(a)在获取自受试者的生物流体中确定至 少两个生物标志物蛋白的浓度，其中所述生物标志物蛋白选自表1或11并且涉及血栓形成 和/或凝固(例如D-二聚体或F1+2)；及(b)对患有TMA、疑患有TMA、或具有患上TMA的风险的 受试者施用补体抑制剂，其施用量和频率足以引发所述生物标志物蛋白的至少两个(2)的 每一个的生理变化，其中所述生理变化是相对于补体抑制剂治疗前获取自受试者的等同生 物样品中该标志物的浓度，所述至少两个生物标志物蛋白的浓度的降低。该方法可以包括 在治疗之前和之后均测量所述生物标志物的浓度。

在又一个方面，发明描述了一种方法，其用于确定用补体抑制剂按照预定的给药 方案治疗的aHUS患者是否需要：(i)用不同的补体抑制剂的治疗或(ii)用同一补体抑制剂 按照不同的给药方案的治疗。该方法包括：(A)确定aHUS患者是否对按照预定给药方案使用 补体抑制剂的治疗是响应性的，其中所述确定包括：在获取自受试者的生物流体中测量该 生物流体中至少两个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度和活性的一者或二者，其中所述aHUS 相关生物标志物蛋白选自下组：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的 C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、 凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补 体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸 结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、 IL-8、和CCL5，并且其中：(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中 的浓度相比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或 Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布 兰德因子(vWF)、补体成分C5a、sC5b9、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、 NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、CXCL10、CXCL9、和KIM-1的至少一项 的降低的浓度；或(b)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中的浓度 相比，CCL5的升高的浓度；说明受试者对使用所述抑制剂的治疗是响应性的；及(B)如果患 者对使用补体抑制剂的治疗是不响应性的，则对患者施用不同的补体抑制剂或以与预定的 给药方案相比更高剂量或更高频率的给药方案施用相同的补体抑制剂。

在又一个方面，发明描述了一种方法，其用于确定按照预定的给药方案使用补体 抑制剂治疗的aHUS患者是否需要：(i)用不同的补体抑制剂的治疗或(ii)用同一补体抑制 剂按照不同的给药方案的治疗。该方法包括：(A)确定aHUS患者是否对按照预定给药方案使 用补体抑制剂的治疗是响应性的，其中所述确定包括：在获取自受试者的生物流体中测量 该生物流体中至少两个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度和活性的一者或二者，其中所述 aHUS相关生物标志物蛋白选自下组：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶 的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球 蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)，并且 其中：(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中的浓度相比，补体成 分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM- 1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制 剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少一项的降低的浓度说明受试者对使用所 述抑制剂的治疗是响应性的；及(B)如果患者对使用补体抑制剂的治疗不是响应性的，则对 患者施用不同的补体抑制剂或以与预定的给药方案相比更高剂量或更高频率的给药方案 施用相同的补体抑制剂。

可以用例如免疫测定法(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法 (RIA)、Western印迹、或斑点印迹法)或细胞术珠阵列(cytometricbeadarray，CBA；参见 工作实施例)来测量一个或多个蛋白的浓度。本文描述了此类方法以及对实施所述方法有 用的试剂盒。用于测量vWF的活性的合适方法是本领域已知的，并在本文中描述。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量至少五个个体aHUS相关生物 标志物蛋白的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量至少十个个体 aHUS相关生物标志物蛋白的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量至 少15个个体aHUS相关生物标志物蛋白的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案 中，测量至少20个个体aHUS相关生物标志物蛋白的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述生物流体是血液。在一些实 施方案中，所述生物流体是血液级分，例如血清或血浆。在一些实施方案中，所述生物流体 是尿液。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所有测量是对一种生物流体进行 的。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量是对获取自受试者的至少两种不 同的生物流体进行的。在一些实施方案中，测量至少两个个体aHUS相关生物标志物蛋白的 浓度，并在一种类型的生物流体中测量第一个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度，并在第二 种类型的生物流体中测量第二个aHUS生物标志物蛋白的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、和 IL-12p70的至少两项(例如至少三、四或全部项)的浓度。在本文所述的方法的任一种的一 些实施方案中，测量Ba和sC5b9二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案 中，测量C5a和C5b9一种或二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测 量β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、和FABP-1的至少两项(例如至 少三、四、五、六或全部项)的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量 CXCL10、CXCL9、和/或KIM-1的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量D- 二聚体和F1+2一种或二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量 sCD40L、凝血酶原片段F1+2、和D-二聚体的至少两项(例如至少三、四或全部项)的浓度。在 本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量凝血调节蛋白、VCAM-1、和/或vWF的浓 度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量CXCL10、MCP-1、和/或TNFR1的浓 度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、和IL-12 p70的至少两项(例如至少三、四或全部项)的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，在受试者的血清中测量CXCL9、 CXCL10、IL-1β、IL-12p70、IFN-γ、MCP-1、CCL5、sCD40L、和/或sTNFR1的一个或多个的浓 度。在一些实施方案中，在受试者的尿液中测量补体成分C5a、sC5b9、β2微球蛋白(β2M)、簇 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL10、 CXCL9、和/或KIM-1的一个或多个的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中， 在受试者的血浆中测量NGAL、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9 (sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、和/或冯维勒布兰德因子(vWF)的一 个或多个的浓度。

在一些实施方案中，测量补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的 C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋 白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的两个或 更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个)的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量选自下组的至少两项的浓 度：Ba、sC5b-9、和C5a。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量Ba和sC5b9的一 者或二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量C5a和C5b9的一者或 二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量选自下组的至少两个个 体项的浓度：β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、清蛋白、TIMP-1、NGAL、和FABP-1。在本 文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量选自下组的至少两个个体项的浓度： CXCL10、CXCL9、IL-18、MCP-1、TNFR1、VEGF、IL-6、和IFNγ。在本文所述的方法的任一种的一 些实施方案中，测量D-二聚体和F1+2的一者或二者的浓度。在本文所述的方法的任一种的 一些实施方案中，测量选自下组的至少两个个体项的浓度：sCD40L、凝血酶原片段F1+2、和 D-二聚体。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量凝血调节蛋白、VCAM-1、或 vWF的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量TNFR1的浓度。在本文所述 的方法的任一种的一些实施方案中，测量选自下组的至少两个个体项的浓度：IFN-γ、 CXCL10、CXCL9、IL-18、TNFR1、VCAM-1、MCP-1、VEGF、CCL5、和IL-6。在本文所述的方法的任一 种的一些实施方案中，测量选自下组的至少一个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度：IFN-γ、 CXCL10、CXCL9、IL-18、TNFR1、VCAM-1、MCP-1、VEGF、和IL-6。在本文所述的方法的任一种的 一些实施方案中，测量选自下组的至少一个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度：β2微球蛋白 (β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、 CXCL10、CXCL9、清蛋白、和KIM-1。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量选自 下组的至少一个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度：CXCL10、CXCL9、IL-18、MCP-1、TNFR1、 VEGF、IL-6、CCL5、IFNγ、IL-8、ICAM-1、IL-1β、和IL-12p70。在本文所述的方法的任一种的 一些实施方案中，在受试者的血清中测量CXCL9、CXCL10、IL-1β、IL-12p70、IFN-γ、MCP-1、 CCL5、sCD40L、或sTNFR1的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，在受试者 的尿液中测量选自下组的至少一个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度：β2微球蛋白(β2M)、簇 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL10、 CXCL9、清蛋白、和KIM-1。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，在受试者的血浆 中测量NGAL、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶 原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、或冯维勒布兰德因子(vWF)的浓度。在本文所述的方 法的任一种的一些实施方案中，(例如在获取自受试者的血浆样品中)测量Ba的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，该方法需要记录至少一个aHUS生 物标志物蛋白的浓度测量值。记录可以是书面的或是记录于计算机可读的介质上。该方法 还可以包括将至少一个aHUS生物标志物蛋白的浓度测量值传达给受试者和/或负责医护该 受试者的医学从业人员。

在一些实施方案中，本文所述方法的任一种可以包括如下步骤：如果受试者对于 按照预定给药方案使用抑制剂的治疗不是响应性的，则对患者以与预定的给药方案相比更 高剂量或更高频率的给药方案施用所述补体抑制剂。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，按照预定的给药方案对受试者施 用补体抑制剂，所述预定的给药方案是部分地基于受试者体重的。例如，就拮抗性抗-C5抗 体(例如依库丽单抗)而言，对于体重大于或等于40kg的受试者，所述抗体可以按照如下方 案施用于受试者至少7周：至少800mg的抗体，每周一次连续施用四周；至少800mg的抗体，在 第五周期间施用一次；和至少800mg的抗体，其后每两周一次。在一些实施方案中，所述抗体 以如下方案施用于受试者至少7周：至少900mg的抗体，每周一次连续施用四周；至少1200mg 的抗体，在第五周期间施用一次；和至少1200mg的抗体，其后每两周一次。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，对于体重小于40kg但大于或等于 30kg的患者，所述抗体可以按照如下方案施用于受试者至少7周：至少500mg的抗体，每周一 次连续施用两周；至少700mg的抗体，在第三周期间施用一次；和至少700mg的抗体，其后每 两周一次。在一些实施方案中，所述抗体按照如下方案施用于受试者至少5周：至少600mg的 抗体，每周一次连续施用两周；至少900mg的抗体，在第三周期间施用一次；和至少900mg的 抗体，其后每两周一次。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者的体重小于30kg但大于或 等于20kg，且所述抗体以如下方案施用于受试者至少5周：至少500mg的抗体，每周一次连续 施用两周；至少500mg的抗体，在第三周期间施用一次；和至少500mg的抗体，其后每两周一 次。在一些实施方案中，所述抗体以如下方案施用于受试者至少5周：至少600mg的抗体，每 周一次连续施用两周；至少600mg的抗体，在第三周期间施用一次；和至少600mg的抗体，其 后每两周一次。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者的体重小于20kg但大于或 等于10kg，且所述抗体以如下方案施用于受试者至少4周：至少500mg的抗体，每周一次施用 一周；至少200mg的抗体，在第二周期间施用一次；和至少200mg的抗体，其后每两周一次。在 一些实施方案中，所述抗体以如下方案施用于受试者至少4周：至少600mg的抗体，每周一次 施用一周；至少300mg的抗体，在第二周期间施用一次；和至少300mg的抗体，其后每两周一 次。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者的体重小于10kg但大于或 等于5kg，且所述抗体以如下方案施用于受试者至少5周：至少200mg的抗体，每周一次施用 一周；至少200mg的抗体，在第二周期间施用一次；和至少200mg的抗体，其后每三周一次。在 一些实施方案中，所述抗体以如下方案施用于受试者至少5周：至少300mg的抗体，每周一次 施用一周；至少300mg的抗体，在第二周期间施用一次；和至少300mg的抗体，其后每三周一 次。其他的示例性抗-C5抗体用于aHUS的给药方案(例如长期给药方案)描述于国际专利申 请公开文本WO2010/054403(例如WO2010/054403的表1和2)中，该公开在此通过提述以其 整体并入。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述抑制剂是抗体或其抗原结合 片段、小分子、多肽、多肽类似物、肽模拟物、或适配体。在一些实施方案中，所述抑制剂可以 是抑制补体成分C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、因子D、因子B、备解素(properdin)、MBL、 MASP-1、MASP-2、或前述任一项的生物活性片段的一项或多项的抑制剂。在本文所述的方法 的任一种的一些实施方案中，所述补体抑制剂抑制与C5a相关的过敏毒性活性的产生和/或 与C5a相关的膜攻击复合体的组装的一者或二者。

组合物还可以含有天然形成或可溶形式的补体抑制性化合物，如CR1、LEX-CR1、 MCP、DAF、CD59、因子H、眼镜蛇毒因子、FUT-175、补体结合抑制素、和K76COOH。

在一些实施方案中，所述补体抑制剂可以是补体受体2(CR2)-因子H(FH)分子，其 包含：a)包含CR2(例如人CR2)或其片段的CR2部分，和b)包含FH或其片段的FH部分，其中所 述CR2-FH分子或其片段能结合至CR2配体，并且其中所述CR2-FH分子能抑制旁路途径 (alternativepathway)的补体激活。示例性的CR2-FH融合蛋白描述并例示于例如国际专 利申请公开文本WO2007/149567和WO2011/143637中，其每一项的公开在此通过提述以其 整体并入。在一些实施方案中，所述补体抑制剂包含靶向结构域，如CR2或抗-C3d抗体，如， 例如国际专利申请公开文本WO2011/163412中所述，该公开在此通过提述以其整体并入。 靶向结构域与其他补体抑制剂(如CD59、CD55、及因子H样分子)的融合物可作为补体抑制剂 用于本文所述的方法中。参见上述WO2011/163412。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述补体抑制剂是拮抗性抗体或 其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可以选自下组：人源化抗体、重组抗体、双抗 体、嵌合化抗体或嵌合抗体、单克隆抗体、去免疫化的抗体、完全人抗体、单链抗体、Fv片段、 Fd片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)₂片段。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述拮抗性抗体是抗-C5抗体，如 依库丽单抗。在一些实施方案中，所述拮抗性抗体是培克珠单抗(pexelizumab)，抗-C5抗体 的C5结合片段。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述补体抑制剂选自下组：MB12/ 22、MB12/22-RGD、ARC187、ARC1905、SSL7、和OmCI。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，技术人员从如下aHUS相关生物标 志物蛋白的亚组可以确定其一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)的浓度，该 亚组可以是：Ba、凝血调节蛋白、VCAM-1、TNFR1、F1+2、D-二聚体、CXCL10、IL-6、簇蛋白、 TIMP-1、FABP-1、β2m、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。

在又一个方面，发明描述了包含多个结合剂的阵列，其中所述多个结合剂的每一 个在所述阵列上具有唯一地址，其中所述阵列包含不多于500个唯一地址，其中多个结合剂 的每一个结合至不同的生物分析物蛋白，并且其中所述阵列包含结合至四个或更多个表1 中所示分析物蛋白的结合剂，例如所述分析物蛋白选自下组：补体成分因子B的蛋白质水解 片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、 可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、 ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制 剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生 长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和CCL5。该阵列在本文所述方法的任一种中是有用的。 在一些实施方案中，所述阵列是蛋白质芯片。在一些实施方案中，所述阵列的每一个地址是 测定法平板的一个孔。在一些实施方案中，所述阵列的每一个地址是具有固定化于其上的 结合剂的颗粒(例如珠)。

如本文所用，术语“结合剂”包括任何天然形成的、合成的或遗传工程化的与抗原 (例如aHUS生物标志物蛋白)结合的制剂，如蛋白质生物标志物。结合剂可以是或衍生自天 然形成的抗体。通过结合至特定抗原以形成复合体，结合蛋白或结合剂可以起与抗体相似 的作用。结合剂或结合蛋白可以包括分离的抗体的抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述阵列包含抗体，所述抗体结合至分析物蛋白的至少两个 (例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个)。 例如，所述阵列可以包含结合剂/抗体，其结合至补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba 或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、 sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1 (FABP-1)的至少两个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个)。

在一些实施方案中，所述阵列包含不超过200个(例如不超过175、150、125、100、 90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、或20个)唯一地址。

在又一个方面，发明描述了一种诊断试剂盒，其包含本文所述任何阵列的一个或 多个，以及任选地用于(a)获取和/或处理来自受试者的生物样品(例如生物流体)和/或(b) 在来自受试者的生物样品(例如生物流体)中测量一个或多个分析物的说明。

在另一个方面，发明描述了一种诊断试剂盒，其包含：(a)测定法平板和(b)至少三 个结合剂，每个结合剂能结合至不同的生物分析物，其中所述分析物是表1中所示的那些， 例如选自下组：补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血 调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+ 2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微 球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1 (FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和 CCL5。在一些实施方案中，所述诊断试剂盒包含一个或多个用于测量人血浆中的vWF活性的 工具(means)。

在另一个方面，发明描述了用于诊断受试者为患有非典型溶血性尿毒综合征 (aHUS)或具有患上aHUS的风险的方法。该方法包括：在生物流体中确定至少两个aHUS相关 生物标志物蛋白的浓度，所述aHUS相关生物标志物蛋白选自下组：补体成分因子B的蛋白质 水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子 (vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、 IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮 细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和CCL5。所述生物流体是获取自疑患有aHUS或具 有患上aHUS的风险的受试者的生物流体。按照该方法，与相同类型的正常对照生物流体中 的浓度相比，Ba、sC5b-9、C5a、sCD40L、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM- 1、vWF、FABP-1、β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、清蛋白、NGAL、CXCL10、 CXCL9、IL-18、TNFR1、VCAM-1、MCP-1、VEGF、CCL5、IL-6、或IFNγ的至少一项的升高的浓度说 明受试者患有aHUS或具有患上aHUS的风险。在一些实施方案中，所述至少两个aHUS相关生 物标志物可以选自表11，即补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9 (sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β 2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少两个 (例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个)。

如本文所用，术语“正常的”，当用于修饰术语“个体”或“受试者”时，意指未患有且 未疑患有具体疾病或病况(例如aHUS)且没有患上该疾病或病况的风险的个体或个体的组。 术语“正常的”在本文中也用于限定分离自正常或健康个体或受试者(或此类受试者的组) 的生物标本或样品(例如生物流体，例如，“正常对照样品”或“正常对照生物流体”。

在又一个方面，发明描述了用于确定受试者是否正在经历第一次急性非典型溶血 性尿毒综合征(aHUS)表现的方法。该方法包括：测量D-二聚体浓度(例如D-二聚体的血浆浓 度)或脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)浓度(例如FABP-1的尿浓度)的一者或二者，其中相对于正 常对照样品中的D-二聚体浓度，D-二聚体浓度的升高；以及相对于正常对照样品中的FABP- 1浓度，FABP-1浓度的升高；说明受试者正在经历第一次急性aHUS表现。在一些实施方案中， D-二聚体和FABP-1的一者或二者的升高可以是显著升高。

在另一个方面，发明描述了用于治疗非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)的方法，该 方法包括以足以实现至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、或25个)aHUS相关生物标志物蛋白的生理变化的量和频率对患有 aHUS、疑患aHUS、或具有患上aHUS的风险的受试者施用补体抑制剂(例如补体成分C5抑制 剂)，其中所述生理变化选自下组：(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体 的样品中的浓度相比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、补体成分因子B的蛋白质水解片段(例 如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯 维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、sC5b9、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑 制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、CXCL10、CXCL9、和KIM-1的至 少一项的降低的浓度；或(b)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体的样品中 的浓度相比，CCL5的升高的浓度。在一些实施方案中，至少一个aHUS相关生物标志物可以选 自表11，即补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血 调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱 氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少一项(例如2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、或13项)。

在又一个方面，发明描述了用于治疗非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)的方法，其 以足以诱导至少两个aHUS相关生物标志物蛋白的生理变化的方式使用补体抑制剂。该方法 包括：(a)在获取自受试者的生物流体中确定至少两个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度，其 中所述aHUS相关生物标志物蛋白选自下组：CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、IL-6、补体成分 因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚 体、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋 白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、 CXCL9、KIM-1、和CCL5；和(b)对患有aHUS、疑患aHUS、或具有患上aHUS的风险的受试者施用 补体抑制剂，所述施用是以足以引发至少两个(2)aHUS相关生物标志物蛋白每一个的生理 变化的量和频率进行的，其中所述生理变化选自下组：(a)与抑制剂治疗前获取自受试者的 相同类型生物流体的样品中的浓度相比，CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、IL-6、补体成分因 子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、 凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、清蛋白、CXCL9、或 KIM-1的至少一项的降低的浓度；和(b)与抑制剂治疗前获取自受试者的相同类型生物流体 的样品中的浓度相比，获取自受试者的生物流体中CCL5的升高的浓度。该方法可以包括确 定生理变化是否发生。在一些实施方案中，所述至少两个aHUS相关生物标志物可以选自表 11，即补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节 蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸 蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少两项(例如3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、或13项)。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在生物流体中测量至少两个个体 aHUS相关生物标志物蛋白的浓度的步骤，其中所述aHUS相关生物标志物蛋白选自下组：补 体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM- 1、冯维勒布兰德因子(vWF)、可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、 CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、 簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、 KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和CCL5。生物流体获取自 该受试者。在一些实施方案中，所述至少两个aHUS相关生物标志物可以选自表11，即补体成 分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM- 1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制 剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至少两项(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或 13项)。

在一些实施方案中，本文所述的方法的任一种可以包括确定是否发生了至少两项 (例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25项)生 理变化。在一些实施方案中，IFN-γ、ICAM-1、IL-1β、和IL-12p70的至少两项的浓度是降低 的。在一些实施方案中，Ba和sC5b9二者的浓度都是降低的。在一些实施方案中，C5a和sC5b9 的每一项的浓度(例如尿浓度)是降低的。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，β 2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、和FABP-1的至少两项(例如至少3、 4、5、6项或全部项)的浓度(例如尿浓度)是降低的。在一些实施方案中，CXCL10、CXCL9、和/ 或KIM-1的浓度(例如尿浓度)是降低的。在一些实施方案中，D-二聚体和F1+2的一者或二者 的浓度(例如血浆浓度)是降低的。在一些实施方案中，sCD40L、凝血酶原片段F1+2、和D-二 聚体的至少两项(例如至少三项，或全部项)的浓度(例如血清和/或血浆浓度)是降低的。在 一些实施方案中，凝血调节蛋白、VCAM-1、和/或vW的浓度是降低的。在一些实施方案中， CXCL10、MCP-1、和TNFR1的浓度(例如血清浓度)是降低的。在一些实施方案中，IFN-γ、 ICAM-1、IL-1β、和IL-12p70的至少两项(例如至少三项、四项，或全部项)的浓度(例如血清 浓度)是降低的。在一些实施方案中，所述至少两个生理变化可以是选自表11的至少两个 aHUS相关生物标志物的浓度的降低，即补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)、可 溶的C5b9(sC5b9)、C5a、凝血调节蛋白、VCAM-1、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、sTNFR1、β2微 球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、TIMP-1、和脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)的至 少两项(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13项)。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，Ba浓度(例如血浆Ba浓度)到开始 治疗后第6周之时降低至少10％。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，Ba浓度 (例如血浆Ba浓度)到开始治疗后第12周之时降低至少30％。在本文所述的方法的任一种的 一些实施方案中，C5a浓度(例如尿C5a浓度)到开始治疗后第3周之时降低至少40％。在本文 所述的方法的任一种的一些实施方案中，C5a浓度(例如尿C5a浓度)到开始治疗后第6周之 时降低至少70％。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，C5b-9浓度(例如尿或血 浆C5b-9浓度)到开始治疗后第3周之时降低至少50％。在本文所述的方法的任一种的一些 实施方案中，F1+2浓度(例如血浆F1+2浓度)到开始治疗后第6周之时降低至少20％。在本文 所述的方法的任一种的一些实施方案中，D-二聚体浓度(例如血浆D-二聚体浓度)到开始治 疗后第6周之时降低至少40％。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，凝血调节蛋 白浓度(例如血清凝血调节蛋白浓度)到开始治疗后第12周之时降低至少20％。在本文所述 的方法的任一种的一些实施方案中，VCAM-1(例如血清VCAM-1浓度)到开始治疗后第12周之 时降低至少20％。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，对受试者施用所述补体抑制剂， 所述施用是以足以实现三个或更多个aHUS相关生物标志物的生理变化的量和频率进行的。 在一些实施方案中，对受试者施用所述补体抑制剂，所述施用是以足以实现至少四个aHUS 相关生物标志物的生理变化的量和频率进行的。在一些实施方案中，对受试者施用所述补 体抑制剂，所述施用是以足以实现至少五个aHUS相关生物标志物的生理变化的量和频率进 行的。在一些实施方案中，对受试者施用所述补体抑制剂，所述施用是以足以实现至少10个 aHUS相关生物标志物的生理变化的量和频率进行的。在一些实施方案中，对受试者施用补 体成分C5抑制剂，所述施用是以足以实现至少15个或更多个aHUS相关生物标志物的生理变 化的量和频率进行的。

在一些实施方案中，至少两个(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、或25个或更多个)aHUS相关生物标志物蛋白的生理变化发生在 将所述抑制剂施用(例如长期施用)2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、6周、2个月、9 周、或3个月或更久之内。

在一些实施方案中，至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个)aHUS相关生物标志物蛋白的浓度在施用所述抑制 剂后降低至少5％(例如至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、或70％)。

在一些实施方案中，至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个)aHUS相关生物标志物蛋白的浓度在施用一个或多 个剂量所述抑制剂后降低至生物标志物蛋白的正常浓度的50％(49、48、47、46、45、44、43、 42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％)内。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，FABP-1(例如尿FABP-1)的浓度在 施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降低至少80％(例如85、90、95、或高达100％)。在本 文所述的方法的任一种的一些实施方案中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(例如尿半胱氨酸蛋 白酶抑制剂-C)的浓度在施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降低至少80％(例如85、90、 95、99或高达100％)。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，簇蛋白(例如尿簇蛋 白)的浓度在施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降低至少80％(例如85、90、95、98或高 达100％)。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，因子B的蛋白质水解片段(例如 Ba)的浓度在施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降低至少10％(例如15、20、25、30、或 40％)。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，sTNFR1的浓度在施用人补体抑制剂 (例如抗-C5抗体)后降低至少80％(例如85、90％或更高)。在本文所述的方法的任一种的一 些实施方案中，凝血调节蛋白或sVCAM-1的浓度在施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降 低至少80％(例如85、90、95、或高达100％)。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案 中，F1+2或D-二聚体的一者或二者的浓度在施用人补体抑制剂(例如抗-C5抗体)后降低至 少80％(例如85、90、95或更高％)。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，aHUS相关生物标志物蛋白的至少 一项(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或 25项)的浓度在施用所述抑制剂后正常化。在一些实施方案中，β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL10、CXCL9、和 KIM-1的至少三项的浓度(例如尿浓度)正常化。

如本文所用，术语“正常化”或类似的用语，当其用于补体抑制剂治疗对于aHUS生 物标志物蛋白浓度或活性的效果的上下文中时，意指生物流体中测得的生物标志物蛋白浓 度或活性，其已进入获取自健康个体(正常个体)组的相同类型生物流体的样品中测得的 aHUS生物标志物蛋白平均浓度或活性范围的50％(例如49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％)之内。例如，用补体抑制剂治疗aHUS患者能使升 高的尿簇蛋白浓度正常化至例如簇蛋白正常平均尿浓度范围的20％内。在一些实施方案 中，补体抑制剂治疗会将簇蛋白尿浓度恢复至簇蛋白的正常平均尿浓度范围内。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者在用抑制剂治疗之前三个 月(例如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1周)内已接受至少一次(例如至少2次、3次、4次、或5次 或更多次)透析。例如，在一些实施方案中，受试者在接受补体抑制剂治疗前两个月接受过 一次透析。在另一个例子中，受试者可以是在即将接受补体抑制剂治疗之前三个月时期内 已接受三次透析的受试者。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，相对于健康受 试者中的浓度，TNFR1、Ba、凝血调节蛋白片段F1+2、和sC5b9的一项或多项的浓度是升高的。 在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，相对于健康人中的浓度(例如尿浓度)，β 2M、sC5b9、C5a、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、簇蛋白、TIMP-1、和NGAL的一项或多项的浓度是升 高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者(例如人受试者)正在经历 第一次急性aHUS表现。例如，在用补体抑制剂治疗前，所述受试者相对于正常浓度可以具有 D-二聚体和FABP-1的一者或二者的升高的浓度。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，受试者(例如人受试者)是患有 aHUS、但被认为处于临床缓解中的受试者(例如受试者是具有正常血小板或其他血液标志 物(如LDH或触珠蛋白)水平的受试者)。在一些实施方案中，这种患者是具有一个或多个本 文所述aHUS生物标志物的升高的水平的患者，所述aHUS生物标志物包括但不限于Ba、D-二 聚体、VCAM-1、和凝血酶原片段1+2的一个或多个。

对于本文所述方法的任一种均理解的是，能够确定一个或多个aHUS生物标志物蛋 白的浓度和/或活性。例如，在一些实施方案中，技术人员可以在获取自所述受试者的生物 样品中测量vWF的活性来代指该样品中vWF(或其他生物标志物蛋白)的浓度。用于评估表1 中所示aHUS生物标志物蛋白的相对活性的方法是本领域已知的。

如本文详细探讨的(例如在工作实施例中)，aHUS是遗传的、威胁生命的疾病，其涉 及慢性的补体调节异常。除其他以外，罹患该疾病的患者患有血栓形成性微血管病(TMA)， 其能导致中风和肾衰竭。依库丽单抗是一种拮抗性抗-C5抗体，已显示其大幅降低TMA，使血 小板水平正常化，并改善aHUS患者的肾功能。但是，即使补体抑制剂治疗对于aHUS患者有清 晰而强大的临床益处，一些患者在面对治疗时仍然经历了一些aHUS生物标志物蛋白的升高 的水平。例如，发明人已发现，在一些患者中补体成分因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或 Bb)水平(例如血浆中的)在用拮抗性抗-C5抗体治疗后未正常化。此外，对于一些患者而言， 凝血酶原片段1+2、D-二聚体、凝血调节蛋白、VCAM-1、TNFR1、和CXCL10的水平是随时间降低 的，但没有正常化。不受任何具体理论或作用机制束缚，这些观察结果提示，对于一些患者 而言，即使用补体抑制剂治疗，低水平的炎症和凝血病可能持续。因此，本发明涵盖如下方 法，其中将补体抑制剂与第二种治疗联合施用，以解决一些aHUS患者中的持续低水平炎症。

因此，在又一个方面，发明描述了用于治疗非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)的方 法。该方法包括对患有aHUS、疑患aHUS、或具有患上aHUS的风险的受试者(例如人受试者)施 用(例如长期施用)治疗有效量的补体抑制剂(例如补体成分C5抑制剂)和治疗有效量的： (i)抗凝血剂；(ii)溶纤维蛋白剂；(iii)抗炎剂；或(iv)IL-6、IL-8、CXCL-9、IL-18、或VEGF 的抑制剂。在一些实施方案中，可以使用两个补体抑制剂(例如C5抑制剂和C3抑制剂，如抗- 因子B抗体、抗-C3抗体、或抗-C3b抗体)。在一些实施方案中，在C5抑制剂治疗中止之时，可 以对受试者施用补体成分C3抑制剂一段时间，所述施用时间足以降低上游旁路途径激活。

在一些实施方案中，所述方法可以包括监测一个或多个aHUS生物标志物的状态并 确定是否开始第二治疗(在补体抑制剂治疗之外的)或对正在施用于aHUS患者的一个或多 个第二治疗的给药方案进行修改。例如，在用补体抑制剂治疗(例如长期治疗)期间，可以在 一个或多个获取自受试者的生物流体中测量一个或多个aHUS相关生物标志物蛋白的浓度。 如果一个或多个所述生物标志物蛋白的浓度没有正常化和/或维持升高，那么医学从业人 员可以选择对受试者施用一个或多个额外的次级制剂(例如抗炎药)来解决升高的生物标 志物所导致的任何病理生理学作用。

补体抑制剂可以是本文所述那些的任一种。在本文所述的方法的任一种的一些实 施方案中，所述抑制剂是抗体或其抗原结合片段、小分子、多肽、多肽类似物、肽模拟物、或 适配体。在一些实施方案中，所述抑制剂可以是抑制补体成分C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、 C9、因子D、因子B、备解素、MBL、MASP-1、MASP-2、或前述任一项的生物活性片段的一个或多 个的抑制剂。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述补体抑制剂抑制与C5a相 关的过敏毒性活性的产生和/或与C5a相关的膜攻击复合体的组装的一者或二者。

组合物还可以含有天然形成的或可溶形式的补体抑制剂性化合物，如CR1、LEX- CR1、MCP、DAF、CD59、因子H、眼镜蛇毒因子、FUT-175、补体结合抑制素、和K76COOH。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，补体抑制剂是拮抗性抗体或其抗 原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可以选自下组：人源化抗体、重组抗体、双抗体、嵌 合化抗体或嵌合抗体、单克隆抗体、去免疫化的抗体、完全人抗体、单链抗体、Fv片段、Fd片 段、Fab片段、Fab’片段、和F(ab’)₂片段。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述拮抗性抗体是抗-C5抗体，如 依库丽单抗。在一些实施方案中，所述拮抗性抗体是培克珠单抗，抗-C5抗体的C5结合片段。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述补体抑制剂选自下组：MB12/ 22、MB12/22-RGD、ARC187、ARC1905、SSL7、和OmCI。

在一些实施方案中，抗凝血剂选自下组：香豆素、肝素、因子Xa抑制剂、和凝血酶抑 制剂。抗凝血剂的例子包括，例如华法林(warfarin)(Coumadin)、阿司匹林、肝素、苯茚二 酮、璜达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、和凝血酶抑制剂(例如阿加曲班 (argatroban)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、或达比加群 (dabigatran))。

在一些实施方案中，溶纤维蛋白剂选自下组：安克洛酶(ancrod)、ε-氨基己酸、抗 纤溶酶-a1、前列环素、和去纤苷。

在一些实施方案中，抗炎剂是抗细胞因子剂，如拮抗性抗体(或其抗原结合片段) 或可溶细胞因子受体，其结合至炎性细胞因子并抑制该细胞因子的活性。所述抗细胞因子 剂可以是例如TNF抑制剂(例如抗-TNF抗体或可溶TNF受体蛋白)或抗-CD20剂。

抗炎剂还包括例如类固醇(例如地塞米松)、非类固醇类抗炎药(NSAID)(例如吲哚 美辛(indomethacin)、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、双氯芬酸(diclofenac)、阿 司匹林、氟比洛芬、奥沙普秦(oxaprozin)、双水杨酯(salsalate)、二氟苯水杨酸 (difunisal)、吡罗昔康(piroxicam)、依托度酸(etodolac)、甲氯芬那酸盐 (meclofenamate)、布洛芬(ibuprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘 丁美酮(nabumetone)、托美丁(tolmetin)、水杨酸胆碱镁、COX-2抑制剂、TNFα拮抗剂(依那 西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、英利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗 (golimumab))、疾病改良的抗风湿药(DMARD)(例如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨蝶呤 (methotrexate))、环孢菌素、类视黄酸和皮质类固醇。

在又一个方面，发明描述了一种方法，其用于在患有非典型溶血性尿毒综合征 (aHUS)、疑患有aHUS、或具有患上aHUS风险的患者中确定一个或多个aHUS相关生物标志物 蛋白的浓度是否是升高的，其中所述方法包括：(i)在获取自患者的生物样品中测量来自表 11(见下文)的至少两个aHUS相关生物标志物的每一个的浓度，即所述aHUS相关生物标志物 选自下组：因子B的蛋白质水解片段、C5a、可溶的C5b-9(sC5b-9)、可溶的TNFR1(sTNFR1)、可 溶的VCAM-1(sVCAM-1)、凝血调节蛋白、凝血酶原片段1和2(F1+2)、D-二聚体、簇蛋白、TIMP- 1、FABP-1、β-2微球蛋白(β2M)、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C，及(ii)与相同的至少两个生物 标志物的正常对照浓度相比，确定该患者是否具有至少两个aHUS相关生物标志物的每一个 的升高的浓度。在一些实施方案中，所述至少两个aHUS相关生物标志物用免疫测定法进行 测量，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)。所述生物流体可以是例如 血液、血液级分(例如血浆或血清)、或尿液。应理解，前述aHUS生物标志物的任意两项或更 多项(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12项)的任意组合可以根据本文所述方法进行测量和分 析。

在另一个方面，发明描述了用于诊断为患有非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)(或 确认aHUS的诊断，例如其中所述患者已经符合两项或更多项下文实施例1中所探讨的入选 标准)的方法，其中所述方法包括：(i)在获取自疑患有aHUS或具有患上aHUS的风险的患者 的生物样品中测量至少两个aHUS相关生物标志物的每一个的浓度，所述aHUS相关生物标志 物选自下组：因子B的蛋白质水解片段、C5a、可溶的C5b-9(sC5b-9)、可溶的TNFR1(sTNFR1)、 可溶的VCAM-1(sVCAM-1)、凝血调节蛋白、凝血酶原片段1和2(F1+2)、D-二聚体、簇蛋白、 TIMP-1、FABP-1、β-2微球蛋白(β2M)、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C，及(ii)如果与相同的至 少两个生物标志物的正常对照浓度相比，至少两个aHUS相关生物标志物的每一个的浓度是 升高的，则将患者诊断为患有aHUS(或确认aHUS的诊断)。在一些实施方案中，至少两个aHUS 相关生物标志物用免疫测定法进行测量，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定 法(RIA)。所述生物流体可以是例如血液、血液级分(例如血浆或血清)、或尿液。应理解，前 述aHUS生物标志物的任意两项或更多项(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12项)的任意组合可 以根据本文所述方法进行测量和分析。

如本文所述方法的任一种中所用的，正常对照浓度可以是(或是可以基于)例如获 取自一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、或40个或更多个)健康个体 的一个或多个生物样品中给定的aHUS相关生物标志物蛋白的浓度。在一些实施方案中，生 物标志物的正常对照浓度可以是(或是可以基于)例如获取自两个或更多个(例如2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、或40个或更多个)健康个体的合并样品中所述生物标志物的 浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，所述合并样品可以来自健康个体，或 至少是未患或未疑患aHUS(也没有患上aHUS的风险)的个体。例如，确定受试者是否是患有 aHUS的受试者可以涉及比较获取自受试者的一种生物样品(或数种不同类型的生物样品) 中一个或多个补体成分蛋白(例如表1或表11)的测得浓度，并将测得的浓度与合并的健康 样品中相同蛋白的平均浓度进行比较。在一些实施方案中，此类健康人对照浓度可以是值 的范围，或从该范围获得的中位值或均值。

在一些实施方案中，在两种或更多种类型的生物流体中测量至少一个aHUS相关生 物标志物的浓度。在一些实施方案中，在一种类型的生物流体中测量所述至少两个aHUS生 物标志物的第一个的浓度，并在第二种类型的流体中测量所述至少两个aHUS生物标志物的 第二个的浓度

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量因子B的蛋白质水解片段的 浓度。例如，该片段可以是Ba。所述生物样品可以是血浆样品。如表11中所述，Ba的正常对照 浓度可以低于1000ng/mL。Ba的正常对照浓度可以低于600ng/mL。Ba的正常对照浓度可以是 300-600ng/mL。

在一些实施方案中，当所述生物样品中Ba的浓度比Ba的正常对照浓度至少高两倍 时，视为该生物样品中Ba的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中Ba的浓度 比Ba的正常对照浓度至少高五倍时，视为该生物样品中Ba的浓度是升高的。在一些实施方 案中，当所述生物样品中Ba的浓度为至少1500ng/mL时，将其视为是升高的。在一些实施方 案中，当所述生物样品中Ba的浓度为至少2500ng/mL时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量C5a的浓度。用于测量C5a的 生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，C5a的正常对照浓度低于2纳克每毫克 尿肌酐。在一些实施方案中，C5a的正常对照浓度低于1纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方案 中，C5a的正常对照浓度为0-0.7纳克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中C5a的浓度比 C5a的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中C5a的浓度是升高的。在一些实施方 案中，当所述生物样品中C5a的浓度比C5a的正常对照浓度至少高十倍时，视为该生物样品 中C5a的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中C5a的浓度比C5a的正常对照 浓度至少高四十倍时，视为该生物样品中C5a的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述 生物样品中C5a的浓度为至少5纳克每毫克尿肌酐时，将其视为是升高的。在一些实施方案 中，当所述生物样品中C5a的浓度为至少9纳克每毫克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量sC5b-9的浓度。用于测量 sC5b-9的生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，sC5b-9的正常对照浓度低于2 纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方案中，sC5b-9的正常对照浓度低于1纳克每毫克尿肌酐。 在一些实施方案中，sC5b-9的正常对照浓度为0-0.6纳克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中sC5b-9的浓度 比sC5b-9的正常对照浓度至少高十倍时，视为该生物样品中sC5b-9的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中sC5b-9的浓度比sC5b-9的正常对照浓度至少高五十倍 时，视为该生物样品中sC5b-9的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中 sC5b-9的浓度比sC5b-9的正常对照浓度至少高一百倍时，视为该生物样品中sC5b-9的浓度 是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sC5b-9的浓度为至少20纳克每毫克尿肌 酐时，将其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sC5b-9的浓度为至少30纳 克每毫克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量sTNFR1的浓度。用于测量 sTNFR1的生物样品可以是血清样品。并且在一些实施方案中，sTNFR1的正常对照浓度小于 2000pg/mL。在一些实施方案中，sTNFR1的正常对照浓度小于1500pg/mL。在一些实施方案 中，sTNFR1的正常对照浓度为400-1500pg/mL。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中sTNFR1的浓度 比sTNFR1的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中sTNFR1的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中sTNFR1的浓度比sTNFR1的正常对照浓度至少高五倍时， 视为该生物样品中sTNFR1的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sTNFR1 的浓度比sTNFR1的正常对照浓度至少高十五倍时，视为该生物样品中sTNFR1的浓度是升高 的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sTNFR1的浓度为至少10,000pg/mL时，将其视为 是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sTNFR1的浓度为至少15,000pg/mL时，将 其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量sVCAM-1的浓度。用于测量 sVCAM-1的生物样品可以是血清样品。并且在一些实施方案中，sVCAM-1的正常对照浓度小 于500ng/mL。在一些实施方案中，sVCAM-1的正常对照浓度小于300ng/mL。在一些实施方案 中，sVCAM-1的正常对照浓度为100-500ng/mL。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中sVCAM-1的浓 度比sVCAM-1的正常对照浓度至少高10％时，视为该生物样品中sVCAM-1的浓度是升高的。 在一些实施方案中，当所述生物样品中sVCAM-1的浓度比sVCAM-1的正常对照浓度至少高 30％时，视为该生物样品中sVCAM-1的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品 中sVCAM-1的浓度比sVCAM-1的正常对照浓度至少高50％时，视为该生物样品中sVCAM-1的 浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sVCAM-1的浓度为至少550ng/mL时， 将其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中sVCAM-1的浓度为至少650ng/mL 时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量凝血调节蛋白的浓度。用于 测量凝血调节蛋白的生物样品可以是血浆样品。并且在一些实施方案中，凝血调节蛋白的 正常对照浓度小于5ng/mL。在一些实施方案中，凝血调节蛋白的正常对照浓度小于3ng/mL。 在一些实施方案中，凝血调节蛋白的正常对照浓度为2-6ng/mL。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中凝血调节蛋白 的浓度比凝血调节蛋白的正常对照浓度至少高10％时，视为该生物样品中凝血调节蛋白的 浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中凝血调节蛋白的浓度比凝血调节蛋 白的正常对照浓度至少高30％时，视为该生物样品中凝血调节蛋白的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中凝血调节蛋白的浓度比凝血调节蛋白的正常对照浓度至 少高50％时，视为该生物样品中凝血调节蛋白的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述 生物样品中凝血调节蛋白的浓度为至少8ng/mL时，将其视为是升高的。在一些实施方案中， 当所述生物样品中凝血调节蛋白的浓度为至少10ng/mL时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量F1+2的浓度。用于测量F1+2 的生物样品可以是血浆样品。并且在一些实施方案中，F1+2的正常对照浓度小于400pmol/ L。在一些实施方案中，F1+2的正常对照浓度小于300pmol/L。在一些实施方案中，F1+2的正 常对照浓度为50-400pmol/L。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中F1+2的浓度比 F1+2的正常对照浓度至少高30％时，视为该生物样品中F1+2的浓度是升高的。在一些实施 方案中，当所述生物样品中F1+2的浓度比F1+2的正常对照浓度至少高50％时，视为该生物 样品中F1+2的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中F1+2的浓度比F1+2的 正常对照浓度至少高100％时，视为该生物样品中F1+2的浓度是升高的。在一些实施方案 中，当所述生物样品中F1+2的浓度为至少900pmol/L时，将其视为是升高的。在一些实施方 案中，当所述生物样品中F1+2的浓度为至少1000pmol/L时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量D-二聚体的浓度。用于测量 D-二聚体的生物样品可以是血浆样品。并且在一些实施方案中，D-二聚体的正常对照浓度 小于500μg/L。在一些实施方案中，D-二聚体的正常对照浓度小于400μg/L。在一些实施方案 中，D-二聚体的正常对照浓度为100-500μg/L。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中D-二聚体的浓 度比D-二聚体的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中D-二聚体的浓度是升高 的。在一些实施方案中，当所述生物样品中D-二聚体的浓度比D-二聚体的正常对照浓度至 少高五倍时，视为该生物样品中D-二聚体的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物 样品中D-二聚体的浓度比D-二聚体的正常对照浓度至少高十倍时，视为该生物样品中D-二 聚体的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中D-二聚体的浓度为至少1500μ g/L时，将其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中D-二聚体的浓度为至少 2500μg/L时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量簇蛋白的浓度。用于测量簇 蛋白的生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，簇蛋白的正常对照浓度低于500 纳克每毫克尿肌酐。簇蛋白的正常对照浓度可以例如低于400纳克每毫克尿肌酐。在一些实 施方案中，簇蛋白的正常对照浓度为0-500纳克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中簇蛋白的浓度 比簇蛋白的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中簇蛋白的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中簇蛋白的浓度比簇蛋白的正常对照浓度至少高五倍时， 视为该生物样品中簇蛋白的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中簇蛋白 的浓度比簇蛋白的正常对照浓度至少高十倍时，视为该生物样品中簇蛋白的浓度是升高 的。在一些实施方案中，当所述生物样品中簇蛋白的浓度为至少900纳克每毫克尿肌酐时， 将其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中簇蛋白的浓度为至少1200纳克 每毫克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量TIMP-1的浓度。用于测量 TIMP-1的生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，TIMP-1的正常对照浓度低于 10纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方案中，TIMP-1的正常对照浓度低于5纳克每毫克尿肌 酐。在一些实施方案中，TIMP-1的正常对照浓度为0-10纳克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中TIMP-1的浓度 比TIMP-1的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中TIMP-1的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中TIMP-1的浓度比TIMP-1的正常对照浓度至少高十倍时， 视为该生物样品中TIMP-1的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中TIMP-1 的浓度比TIMP-1的正常对照浓度至少高二十倍时，视为该生物样品中TIMP-1的浓度是升高 的。在一些实施方案中，当所述生物样品中TIMP-1的浓度为至少15纳克每毫克尿肌酐时，将 其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中TIMP-1的浓度为至少20纳克每毫 克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量FABP-1(此处也称为L-FABP- 1)的浓度。用于测量FABP-1的生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，FABP-1的 正常对照浓度低于20纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方案中，FABP-1的正常对照浓度低于 15纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方案中，FABP-1的正常对照浓度为0-20纳克每毫克尿肌 酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中FABP-1的浓度 比FABP-1的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中FABP-1的浓度是升高的。在一 些实施方案中，当所述生物样品中FABP-1的浓度比FABP-1的正常对照浓度至少高十倍时， 视为该生物样品中FABP-1的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中FABP-1 的浓度比FABP-1的正常对照浓度至少高二十倍时，视为该生物样品中FABP-1的浓度是升高 的。在一些实施方案中，当所述生物样品中FABP-1的浓度为至少40纳克每毫克尿肌酐时，将 其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中FABP-1的浓度为至少50纳克每毫 克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量β2m的浓度。用于测量β2m的 生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方案中，β2m的正常对照浓度低于5微克每毫克 尿肌酐。在一些实施方案中，β2m的正常对照浓度低于3微克每毫克尿肌酐。在一些实施方案 中，β2m的正常对照浓度为0-5微克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中β2m的浓度比β 2m的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物样品中β2m的浓度是升高的。在本文所述的方 法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中β2m的浓度比β2m的正常对照浓度至少高 十倍时，视为该生物样品中β2m的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中β2m 的浓度比β2m的正常对照浓度至少高二十倍时，视为该生物样品中β2m的浓度是升高的。在 一些实施方案中，当所述生物样品中β2m的浓度为至少15微克每毫克尿肌酐时，将其视为是 升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中β2m的浓度为至少20微克每毫克尿肌酐时， 将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的 浓度。用于测量半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的生物样品可以是尿液样品。并且在一些实施方 案中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓度低于400纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方 案中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓度低于300纳克每毫克尿肌酐。在一些实施方 案中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓度为0-400纳克每毫克尿肌酐。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，当所述生物样品中半胱氨酸蛋白 酶抑制剂-C的浓度比半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓度至少高两倍时，视为该生物 样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中 半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度比半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓度至少高十倍 时，视为该生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度是升高的。在一些实施方案中，当所 述生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度比半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的正常对照浓 度至少高二十倍时，视为该生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度是升高的。在一些 实施方案中，当所述生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度为至少900纳克每毫克尿 肌酐时，将其视为是升高的。在一些实施方案中，当所述生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制 剂-C的浓度为至少1200纳克每毫克尿肌酐时，将其视为是升高的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量因子B的蛋白质水解片段、 C5a、和sC5b-9的两项或更多项的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测 量C5a和sC5b-9的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量sVCAM-1和凝 血调节蛋白的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量F1+2和D-二聚体 的浓度。在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，测量簇蛋白、TIMP-1、β2m、FABP-1、 和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的两项或更多项的浓度。

在又一个方面，发明描述了一种方法，其用于在患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患 上aHUS的风险的患者中评估补体抑制剂(如抗-C5抗体)治疗之前、之中或之后的旁路途径 激活水平。该方法包括：在获取自用补体抑制剂(例如人补体成分C5抑制剂，如抗-C5抗体) 治疗的受试者的生物样品中测量因子B的蛋白质水解片段(例如Ba或Bb)的浓度。

在又一个方面，发明描述了用于确定患者是否对使用补体抑制剂的治疗有响应 (例如患上血栓形成的风险降低或血栓形成性微血管病的数目、频率、或发病的降低)的方 法，该方法包括在获取自患者的生物样品中测量一个或多个表1或11中所示血栓形成或凝 固的生物标志物(例如F1+2、D-二聚体、vWF、或凝血调节蛋白)的浓度，所述患者具有升高的 血栓形成性微血管病(TMA)的风险、或罹患或疑患有血栓形成性微血管病(TMA)，并且是用 补体抑制剂治疗的；以及与补体抑制剂治疗前获取自患者的相同类型生物样品中一个或多 个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品中一个或多个生物标志物的浓度是降低的，那 么确定患者对治疗有响应，或与补体抑制剂治疗前获取自患者的相同类型生物样品中一个 或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品中一个或多个生物标志物的浓度不是降低 的，那么确定患者对治疗没有响应。在一些实施方案中，所述患者患有aHUS、疑患有aHUS、或 具有患上aHUS的风险。

在另一个方面，发明公开了用于确定aHUS患者是否对使用补体抑制剂的治疗有响 应的方法，该方法包括在获取自患者的生物样品中测量一个或多个表1或11中所示的末端 补体激活的生物标志物(例如C5a和/或sC5b-9)的浓度，所述患者患有aHUS、疑患有aHUS、或 具有患上aHUS的风险，并且是用补体抑制剂(例如抗-C5抗体)治疗的；以及与补体抑制剂治 疗前获取自患者的相同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样 品中一个或多个生物标志物的浓度是降低的，那么确定患者对治疗有响应，或与补体抑制 剂治疗前获取自患者的相同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生 物样品中一个或多个生物标志物的浓度不是降低的，那么确定患者对治疗没有响应。因此， 该方法可用于评估或监测使用补体抑制剂治疗的aHUS患者中的末端补体阻断(terminal complementblockade)。在患者对于治疗是不响应性的、或较低响应性的实施方案中，该方 法还可包括改变补体抑制剂的给药量或给药频率或选择不同的补体抑制剂(例如C3激活抑 制剂)，用于治疗患者。

在另一个方面，发明描述了用于确定aHUS患者是否对使用补体抑制剂的治疗有响 应的方法，该方法包括在获取自患者的生物样品中测量一个或多个表1或11中所示的血管 炎症或内皮激活的生物标志物(例如sTNFR1、sVCAM-1、或凝血调节蛋白)的浓度，所述患者 患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的风险；以及与补体抑制剂治疗前获取自患者的相 同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品中一个或多个生物 标志物的浓度是降低的，那么确定患者对治疗有响应，或与补体抑制剂治疗前获取自患者 的相同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品中一个或多个 生物标志物的浓度不是降低的，那么确定患者对治疗没有响应。因此，该方法可用于评估或 监测使用补体抑制剂治疗的aHUS患者中的血管炎症。在患者对于治疗是不响应性的、或较 低响应性的实施方案中，该方法还可包括改变补体抑制剂的剂量或给药频率或选择不同的 补体抑制剂(例如C3激活抑制剂)，用于治疗患者。

在另一个方面，发明描述了用于确定aHUS患者是否对使用补体抑制剂的治疗有响 应的方法，该方法包括在获取自患者的生物样品中测量一个或多个表1或11中所示的肾损 伤的生物标志物(例如簇蛋白、TIMP-1、FABP-1、β2M、和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C)的浓 度，所述患者患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS的风险；以及与补体抑制剂治疗前获 取自患者的相同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品中一 个或多个生物标志物的浓度是降低的，那么确定患者对治疗有响应，或与补体抑制剂治疗 前获取自患者的相同类型生物样品中一个或多个生物标志物的浓度相比，如果该生物样品 中一个或多个生物标志物的浓度不是降低的，那么确定患者对治疗没有响应。因此，该方法 可用于评估或监测使用补体抑制剂治疗的aHUS患者中的肾损伤。在患者对于治疗是不响应 性的、或较低响应性的实施方案中，该方法还可包括改变补体抑制剂的剂量或给药频率或 选择不同的补体抑制剂(例如C3激活抑制剂)，用于治疗患者。

发明人还发现，在aHUS患者中，末端补体激活标志物C5a和sC5b-9浓度(例如尿浓 度)的相对升高比这些患者中补体旁路途径激活标志物(例如Ba)水平的相对升高要高得 多。换言之，aHUS患者中C5a和sC5b-9的中位浓度比这些标志物在正常健康人中的中位浓度 分别高45和305倍，然而Ba的中位浓度仅比正常健康人中Ba的中位浓度约高5倍。不受任何 具体理论或作用机制的束缚，发明人相信末端补体激活与旁路途径激活的比对于aHUS是一 种有用的诊断工具。因此，在另一个方面，发明描述了诊断aHUS或确认aHUS的诊断的方法， 该方法包括将末端补体激活(例如sC5b-9或C5a)的水平与上游旁路途径激活(例如Ba或Bb) 的水平(相对于正常健康人)进行比较，其中相对于旁路途径激活更高程度的末端激活说明 患者患有aHUS。例如，说明aHUS的比率可以是例如大约45∶5或305∶5，末端补体激活诱导倍 数比旁路途径激活诱导倍数。此外，发明人认为该比率可用于将aHUS从其他补体相关疾病 (如血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP))区分出来，后者可能不展现出末端补体和上游旁 路途径激活水平的此类差异。

“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换地使用，并且意指任何肽连接的氨基酸链，无论其长 度或翻译后修饰如何。本文所述的蛋白可以含有野生型蛋白或是野生型蛋白，或者可以是 具有不超过50个(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50个)保 守氨基酸取代的变体。保守取代通常包括如下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮 氨酸、和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸 和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

如本文所用，百分比(％)氨基酸序列同一性定义为在比对序列并在必要时引入缺 口(gap)以达到最大百分比序列同一性后，候选序列中与参考序列中氨基酸相同的氨基酸 的百分比。出于确定百分比序列同一性目的的比对可以通过多种本领域已知方式完成，例 如用公众可获得的计算机软件如BLAST软件来完成。可以通过已知方法来确定用于测量比 对的合适的参数，包括在所比较的序列全长上达到最大化比对所需的任何算法。

如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体和完整抗体的抗原结合片段二者。完整抗 体包括不同的抗体同种型，包括IgM、IgG、IgA、IgD、和IgE抗体。术语“抗体”包括多克隆抗 体、单克隆抗体、嵌合化抗体或嵌合抗体、人源化抗体、灵长类来源化(primatized)抗体、去 免疫化的抗体、和完全人抗体。所述抗体可以产生自或来源于多种物种的任一种，例如哺乳 动物如人、非人的灵长类(例如猩猩、狒狒、或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、家兔、 豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠、和小鼠。抗体可以是纯化抗体或重组抗体。

如本文所用，“抗体片段”、“抗原结合片段”、或类似术语意指保留了与靶抗原(例 如人C5)结合和抑制靶抗原活性的能力的抗体片段。此类片段包括例如单链抗体、单链Fv片 段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段、或F(ab’)₂片段。scFv片段是单条多肽链，其包含 scFv的来源抗体的重链和轻链可变区二者。此外，胞内抗体(intrabodies)、微抗体 (minibodies)、三抗体(triabodies)、和双抗体也涵盖在抗体的定义内，并且对于在本文所 述的方法中使用是相容的。参见例如Todorovska等(2001)JImmunolMethods248(1)：47- 66；Hudson和Kortt(1999)JImmunolMethods231(1)：177-189；Poljak(1994)Structure2 (12)：1121-1123；及Rondon和Marasco(1997)AnnualReviewofMicrobiology51：257- 283，其各自的公开内容在此通过提述以其整体并入。术语“抗体”还涵盖双特异性抗体(包 括DVD-Ig抗体；见下文)。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗 体(优选为人抗体或人源化抗体)。

如本文所用，术语“抗体”还包括，例如单域抗体如骆驼来源化的单域抗体。参见例 如Muyldermans等(2001)TrendsBiochemSci26：230-235；Nuttall等(2000)CurrPharm Biotech1：253-263；Riechmann等(1999)JImmunolMeth231：25-38；PCT申请公开文本WO 94/04678和WO94/25591；及美国专利No.6,005,079，其全部在此通过提述以其整体并入。 在一些实施方案中，发明提供包含两个具有修饰的VH域的单域抗体，从而形成单域抗体。

除另有说明外，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人 员所公知的相同含义。优选的方法和材料如下文所述，但与本文所述相似或等同的方法和 材料也可以用于实施或测试本发明公开的方法和组合物。本文提及的所有出版物、专利申 请、专利、及其他文献通过提述以其整体并入。

本发明的其他特征和优点(例如用于在受试者中治疗补体相关病症的方法)会从 下文的描述、实施例、及所附权利要求书变得明显。

附图说明

图1A是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中C5a的浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。还从正常、健康个体的尿 液中测量尿C5a浓度(正常)。

图1B是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中sC5b-9的浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。还从正常、健康个体 的尿液中测量尿sC5b-9浓度(正常)。

图1C是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中补体成分Ba的浓度(以ng/mL为单位)。还从正常、健康个体的血浆中 测量Ba浓度(正常)。

图1D是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者(N＝26)中随时间的 尿C5a水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行评估的 周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图1E是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者(N＝23)中随时间的 尿sC5b-9水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行评估 的周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图1F是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者(N＝35)中随时间的 血浆Ba水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行评估的 周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图2A-2C是柱状图，其描绘了在基线处(用依库丽单抗治疗前)和开始用依库丽单 抗治疗后多周时达到尿C5a(图2A)、尿sC5b9(图2B)、和血浆Ba(图2C)正常化浓度的aHUS患 者的百分比。

图3A是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血浆中凝血酶原片段1+2的浓度(以pmol/L为单位)。还从正常、健康个体的血 浆中测量血浆F1+2浓度(正常)。

图3B是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血浆中D-二聚体的浓度(以μg/L为单位)。还从正常、健康个体的血浆中测量 血浆D-二聚体浓度(正常)。

图3C是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者中随时间的血浆凝血 酶原片段F1+2水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行 评估的周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图3D是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者中随时间的血浆D-二 聚体水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行评估的 周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图4A和4B是柱状图，其描绘了在基线处(用依库丽单抗治疗前)和开始用依库丽单 抗治疗后多周时达到血浆凝血酶原片段1+2(图4A)和血浆D-二聚体(图4B)正常化浓度的 aHUS患者的百分比。

图5A是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血浆(经EDTA处理的血浆)中凝血调节蛋白的浓度(以ng/mL为单位)。还从正 常、健康个体的血浆中测量血浆凝血调节蛋白浓度(正常)。EOS表示在“研究结束”时获取的 样品的分析结果。

图5B是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血清中VCAM-1的浓度(以ng/mL为单位)。还从正常、健康个体的血清中测量血 清VCAM-1浓度(正常合并液)。EOS表示在“研究结束”时获取的样品的分析结果。

图5C是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血浆(经EDTA处理的血浆)中vWF的活性(以mU/mL为单位)。还从正常、健康个 体的血浆中测量vWF活性(正常)。EOS表示在“研究结束”时获取的样品的分析结果。

图6A和6B是柱状图，其描绘了在基线处(用依库丽单抗治疗前)和开始用依库丽单 抗治疗后多周时达到正常化的血浆凝血调节蛋白浓度(图6A)和血浆vWF活性水平(图6B)的 aHUS患者的百分比。

图6C是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者(N＝33)中随时间的 血浆凝血调节蛋白水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访 进行评估的周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图6D是柱状图，其描绘了开始用依库丽单抗治疗后aHUS患者(N＝36)中随时间的 血清VCAM-1水平的均值百分比(％)降低(Y轴)。x轴表示开始治疗后对aHUS患者拜访进行评 估的周，例如V3是在开始治疗后第3周拜访患者进行评估。

图7A是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者血清中TNFR1的浓度(以pg/mL为单位)。还从正常、健康个体的血清中测量血 清TNFR1浓度(正常合并液)。EOS表示在“研究结束”时获取的样品的分析结果。

图7B是柱状图，其描绘了在基线处(用依库丽单抗治疗前)和开始用依库丽单抗治 疗后多周时达到正常化的血清TNFR1浓度的aHUS患者的百分比。

图8A是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单 位)。还从正常、健康个体的尿液中测量尿CysC浓度(正常)。

图8B是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中的β2M浓度(以微克每毫克尿肌酐为单位)。还从正常、健康个体的尿 液中测量尿β2M浓度(正常)。

图8C是点图，其描绘了用依库丽单抗治疗前(Pre-Tx)和开始用依库丽单抗治疗后 多周aHUS患者的尿液中的NGAL浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。还从正常、健康个体的 尿液中测量尿NGAL浓度(正常)。

图9A-9E是一系列柱状图，其描绘了与那些在招募入本文所述研究之前未经历过 透析的aHUS患者(无透析)相比，经历过透析的aHUS患者(透析)中一些aHUS生物标志物蛋白 的平均水平。图9A描绘了血清TNFR1的平均浓度(以pg/mL为单位)；图9B描绘了尿β2M的平均 浓度(以微克每毫克尿肌酐为单位)；图9C描绘了血浆Ba的浓度(以ng/mL为单位)；图9D描绘 了尿sC5b9的浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)；而图9E描绘了尿C5a的浓度(以ng/mL为单 位)。

图10A是点图，其描绘了在基线处和在开始用依库丽单抗治疗后1-2.5周处二者， 表现出稳定临床参数(临床缓解)的aHUS患者(无TMA)和那些继续经历升高的触珠蛋白和 LDH水平(以及降低的血小板计数)的aHUS患者(其他)中血清TNFR1的浓度(以pg/mL为单 位)。还显示了来自正常、健康个体的血清TNFR1的浓度(正常)。

图10B-10E是一系列柱状图，其各自描绘了具有正常血液学标志物LDH和触珠蛋白 的患者(“正常患者”或视为处于临床缓解中的患者)、具有异常(升高的)血液学标志物的患 者(“异常患者”或具有活跃aHUS发作的患者)、和健康受试者(“正常”)中给定的生物标志物 的浓度。图10B描绘了这些受试者群体中的血浆Ba水平(ng/mL)。图10C描绘了受试者群体中 的血清VCAM-1水平(ng/mL)。图10E描绘了群体中的血浆凝血酶原片段1+2水平(pmol/L)，而 图10D描绘了血浆D-二聚体水平(以μg/L为单位)。图中显示了各组比较的P值。

图10F-10I是一系列柱状图，其各自描绘了具有正常血小板水平的患者(“正常患 者”)、具有异常(降低的)血小板水平(“异常患者”)、和健康受试者(“正常”)中给定的生物 标志物的浓度。图10F描绘了这些受试者群体中的血浆Ba水平(ng/mL)。图10G描绘了受试者 群体中的血清VCAM-1水平(ng/mL)。图10I描绘了群体中的血浆凝血酶原片段1+2水平 (pmol/L)，而图10H描绘了血浆D-二聚体水平(以μg/L为单位)。图中显示了各组比较的P值。

图11是柱状图，其描绘了那些达到完全TMA响应的aHUS患者和那些仍经历TMA事件 的aHUS患者(不完全响应)中血清TNFR1和尿簇蛋白、C5a、和C5b9水平的均值百分比变化。 (如工作实施例中记载并详细说明的那样，完全TMA响应意指血液学参数的正常化和肾功能 的保持。)

图12是柱状图，其描绘了用依库丽单抗治疗且经历完全TMA响应的aHUS患者和那 些用依库丽单抗治疗且未经历完全TMA响应的患者(其他)中血浆Ba水平的均值百分比变 化。

图13是柱状图，其描绘了在具有正常化的血浆Ba水平的aHUS患者中对比持续升高 的血浆Ba水平的患者中，在开始用依库丽单抗治疗后第12-17周和第26周处血小板计数 (10⁹/L)从基线(初始拜访，在用依库丽单抗治疗前)的均值变化。图中还提供了每个观察结 果的p值。

图14A-14D是一系列柱状图，其描绘了在基线处具有异常TMA标志物的aHUS患者中 一些aHUS相关生物标志物升高的观察结果。图14A描绘了与具有降低的血小板计数(每微升 血液＜150,000)的患者相比，具有正常血小板计数(每微升血液＞150,000)的aHUS患者尿 液中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)的浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。图14B描绘了与 具有降低的血小板计数(每微升血液＜150,000)的患者相比，具有正常血小板计数(每微升 血液＞150,000)的aHUS患者尿液中簇蛋白的浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。图14C描 绘了与具有升高的LDH水平的患者相比，具有正常LDH水平的aHUS患者的血清中VCAM-1的浓 度。图14D描绘了与具有升高的LDH水平的患者相比，具有正常LDH水平的aHUS患者的血浆中 D-二聚体的浓度(以μg/L为单位)。图中指出了每个观察结果的p值。

图15是柱状图，其描绘了在基线处具有重复的血浆治疗的aHUS患者(重复的PT；N ＝23)、无血浆治疗的aHUS患者(无PT；N＝3)、或正常患者(N＝9)的尿液中半胱氨酸蛋白酶 抑制剂C的水平(纳克每毫克尿肌酐)。

图16是一系列柱状图，其描绘了用依库丽单抗治疗后达到多个生物标志物(血浆 Ba、血清VCAM-1、血浆F1+2、血浆D-二聚体、和尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)正常化水平的 aHUS患者中基线eGFR的均值变化(mL/min/1.73m²)，所述变化是与这些生物标志物的浓度 维持升高的aHUS患者相比。

图17A-E是一系列柱状图，其描绘了在用补体抑制剂治疗前，aHUS患者中一些aHUS 相关生物标志物升高的观察结果，无论该患者是否接受了血浆置换(PE)或血浆输注(PI)治 疗。图17A描绘了正常健康志愿者(NHV)、接受PE或PI治疗的aHUS患者(PE/PI)、或未接受PE 或PI治疗的aHUS患者(无PE/PI)的血浆中因子B蛋白质水解片段Ba的浓度(以ng/mL为单 位)。图17B描绘了正常健康志愿者(NHV)、接受PE或PI治疗的aHUS患者(PE/PI)、或未接受PE 或PI治疗的aHUS患者(无PE/PI)的血清中sTNFR1浓度(以pg/mL为单位)。图17C描绘了正常 健康志愿者(NHV)、接受PE或PI治疗的aHUS患者(PE/PI)、或未接受PE或PI治疗的aHUS患者 (无PE/PI)的血清中sVCAM-1浓度(以ng/mL为单位)。图17D描绘了正常健康志愿者(NHV)、接 受PE或PI治疗的aHUS患者(PE/PI)、或未接受PE或PI治疗的aHUS患者(无PE/PI)的血浆中D- 二聚体浓度(以μg/L为单位)。图17E描绘了正常健康志愿者(NHV)、接受PE或PI治疗的aHUS 患者(PE/PI)、或未接受PE或PI治疗的aHUS患者(无PE/PI)的尿液中半胱氨酸蛋白酶抑制 剂-C浓度(以纳克每毫克尿肌酐为单位)。图中说明了每个观察结果的p值。

图18A-E是一系列柱状图，其描绘了在用补体抑制剂治疗前，aHUS患者中一些aHUS 相关生物标志物升高的观察结果，无论该患者的血小板水平如何。图18A描述了正常健康志 愿者(NHV)、具有正常血小板水平(＞150x10⁹)的aHUS患者、或具有降低的血小板计数(＜ 150x10⁹)的aHUS患者的血浆中因子B蛋白质水解片段Ba的浓度(以ng/mL为单位)。图18B描 述了正常健康志愿者(NHV)、具有正常血小板水平(＞150x10⁹)的aHUS患者、或具有降低的 血小板计数(＜150x10⁹)的aHUS患者的血清中TNFR1的浓度(以pg/mL为单位)。图18C描述了 正常健康志愿者(NHV)、具有正常血小板水平(＞150x10⁹)的aHUS患者、或具有降低的血小 板计数(＜150x10⁹)的aHUS患者的血清中sVCAM-1的浓度(以ng/mL为单位)。图18D描述了正 常健康志愿者(NHV)、具有正常血小板水平(＞150x10⁹)的aHUS患者、或具有降低的血小板 计数(＜150x10⁹)的aHUS患者的血浆中D-二聚体的浓度(以μg/L为单位)。图18E描述了正常 健康志愿者(NHV)、具有正常血小板水平(＞150x10⁹)的aHUS患者、或具有降低的血小板计 数(＜150x10⁹)的aHUS患者的尿液中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度(以纳克每毫克尿肌 酐为单位)。图中说明了每个观察结果的p值。

图19A-E是一系列柱状图，其描绘了在用补体抑制剂治疗前，aHUS患者中一些aHUS 相关生物标志物升高的观察结果，无论该患者的触珠蛋白(Hp)或乳酸脱氢酶(LDH)水平如 何。图19A描绘了正常健康志愿者(NHV)、具有正常Hp和LDH水平的aHUS患者、或具有升高的 (异常的)Hp/LDH的aHUS患者的血浆中因子B蛋白质水解片段Ba的浓度(以ng/mL为单位)。图 19B描绘了正常健康志愿者(NHV)、具有正常Up和LDH水平的aHUS患者、或具有升高的(异常 的)Hp/LDH的aHUS患者的血清中sTNFR1的浓度(以pg/mL为单位)。图19C描绘了正常健康志 愿者(NHV)、具有正常Hp和LDH水平的aHUS患者、或具有升高的(异常的)Hp/LDH的aHUS患者 的血清中sVCAM-1的浓度(以ng/mL为单位)。图19D描绘了正常健康志愿者(NHV)、具有正常 Hp和LDH水平的aHUS患者、或具有升高的(异常的)Hp/LDH的aHUS患者的血浆中D-二聚体的 浓度(以μg/L为单位)。图19E描绘了正常健康志愿者(NHV)、具有正常Hp和LDH水平的aHUS患 者、或具有升高的(异常的)Hp/LDH的aHUS患者的血浆中半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的浓度 (以纳克每毫克尿肌酐为单位)。图中说明了每个观察结果的p值。

图20A-B是箱须图(Box-Whiskerplot)，其描绘了持续的依库丽单抗治疗对aHUS 患者中末端补体活化的纵向效果。图20A描绘了与正常健康志愿者(NHV)的尿液中的尿C5a 浓度相比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者随时间的尿C5a浓度(纳克每毫克尿肌酐)的变化。 图20B描绘了与正常健康志愿者(NHV)的尿液中的尿sC5b-9浓度相比，在依库丽单抗治疗后 aHUS患者随时间的尿sC5b-9浓度(纳克每毫克尿肌酐)的变化。箱须图显示了中值、第25、和 第75百分位数值以及范围。*第一时间点，在该时间点处对比基线(BL)的水平显著降低；在 每个时间点处对比基线的P值用基于约束最大似然法(restrictedmaximumlikelihood) 的重复测量手段(混合模型)来计算。与NHV相比的P值用Wilcoxon秩和检验(WilcoxonRank Sumtest)来计算。

图21A-C是箱须图，其描绘了持续的依库丽单抗治疗对aHUS患者中肾损伤相关生 物标志物蛋白浓度的纵向效果。图21A描绘了与正常健康志愿者(NHV)的尿液中的尿FABP-1 浓度相比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者随时间的尿FABP-1浓度(纳克每毫克尿肌酐)的变 化。图21B描绘了与正常健康志愿者(NHV)的尿液中的尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C浓度相 比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者随时间的尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C浓度(纳克每毫克 尿肌酐)的变化。图21C描绘了与正常健康志愿者(NHV)的尿液中的尿簇蛋白浓度相比，在依 库丽单抗治疗后aHUS患者随时间的尿簇蛋白(纳克每毫克尿肌酐)的变化。箱须图显示了中 值、第25、和第75百分位数值以及范围。*第一时间点，在该时间点处对比基线(BL)的水平显 著降低；在每个时间点处对比基线的P值用基于约束最大似然法的重复测量手段(混合模 型)来计算。与NHV相比的P值用Wilcoxon秩和检验来计算。

图22是箱须图，其描绘了持续的依库丽单抗治疗对aHUS患者中补体旁路途径的纵 向效果。在依库丽单抗治疗后aHUS患者血浆中Ba的浓度(ng/mL)随时间的变化与正常健康 志愿者(NHV)中的血浆Ba浓度一起显示。箱须图显示了中值、第25、和第75百分位数值以及 范围。*第一时间点，在该时间点处对比基线(BL)的水平显著降低；在每个时间点处对比基 线的P值用基于约束最大似然法的重复测量手段(混合模型)来计算。与NHV相比的P值用 Wilcoxon秩和检验来计算。

图23A-C是箱须图，其描绘了持续的依库丽单抗治疗对aHUS患者中炎症、内皮细胞 活化、和组织损伤相关生物标志物蛋白浓度的纵向效果。图23A描绘了与正常健康志愿者 (NHV)的血清中的sTNFR1浓度相比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者血清中sTNFR1浓度(pg/ mL)随时间的变化。图23B描绘了与正常健康志愿者(NHV)的血清中的该分析物浓度相比，在 依库丽单抗治疗后aHUS患者血清中sVCAM-1浓度(ng/mL)随时间的变化。图23C描绘了与正 常健康志愿者(NHV)的血浆中的该分析物浓度相比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者血浆中 凝血调节蛋白浓度(ng/mL)随时间的变化。箱须图显示了中值、第25、和第75百分位数值以 及范围。*第一时间点，在该时间点处对比基线(BL)的水平显著降低；在每个时间点处对比 基线的P值用基于约束最大似然法的重复测量手段(混合模型)来计算。与NHV相比的P值用 Wilcoxon秩和检验来计算。

图24A-B是箱须图，其描绘了持续的依库丽单抗治疗对aHUS患者中血栓形成和凝 固相关生物标志物蛋白浓度的纵向效果。图24A描绘了与正常健康志愿者(NHV)的血浆中的 该分析物浓度相比，在依库丽单抗治疗后aHUS患者血浆中F1+2浓度(pmol/L)随时间的变 化。图24B描绘了与正常健康志愿者(NHV)的血浆中的该分析物浓度相比，在依库丽单抗治 疗后aHUS患者血浆中D-二聚体(μg/L)随时间的变化。箱须图显示了中值、第25、和第75百分 位数值以及范围。*第一时间点，在该时间点处对比基线(BL)的水平显著降低；在每个时间 点处对比基线的P值用基于约束最大似然法的重复测量手段(混合模型)来计算。与NHV相比 的P值用Wilcoxon秩和检验来计算。

补体系统综述

补体系统与身体的其他免疫系统一起发挥作用来防御细胞和病毒病原体的入侵。 至少存在25种补体蛋白，其作为血浆蛋白和膜辅因子的复杂集合而被发现。血浆蛋白占脊 椎动物血清中球蛋白的约10％。补体成分通过在一系列复杂而精准的酶切和膜结合事件中 相互作用来达到其免疫防御功能。所得的补体级联导致具有调理功能、免疫调节功能、和裂 解功能的产物的产生。在例如TheMerckManual第16版中，提供了与补体激活相关的生物 学活性的准确概括。

补体级联通过经典途径、旁路途径或凝集素途径而进展。这些途径共享很多成分， 但它们在起始步骤上不同，它们汇聚于并共享“末端补体”成分(C5至C9)，其负责靶细胞的 激活和破坏。

经典途径(CP)通常由针对靶细胞上抗原位点的抗体识别和与之结合而起始。旁路 途径(AP)可以是不依赖于抗体的，并且可以通过病原体表面上某些分子起始。此外，凝集素 途径通常通过甘露糖结合凝集素(MBL)与高甘露糖底物的结合而起始。这些途径在活性蛋 白酶切割补体成分C3产生C3a和C3b的点处汇聚。其他激活补体攻击的途径可随后在事件顺 序中起作用，产生补体功能的各种方面。C3a是过敏毒素。C3b与细菌及其他细胞，以及与某 些病毒和免疫复合体结合，且对其进行标记以将其从循环去除。通常将C3b的调理功能视为 补体系统的最重要的抗感染活动。C3b也与每种途径特有的其他成分形成复合体以形成经 典的或旁路的C5转化酶，其使补体成分C5(以下简称“C5”)切割为C5a和C5b。

对C5的切割释放生物活性种类，如例如C5a，其是强效的过敏毒素及趋化因子，以 及C5b，其通过一系列蛋白质相互作用引起溶胞性末端补体复合体C5b-9的形成。C5a和C5b- 9通过扩大下游炎性因子(如水解酶、反应性氧种类、二十碳四烯酸代谢物及各种细胞因子) 的释放而还具有多效的细胞激活特性。

C5b与C6、C7和C8在靶细胞表面组合形成C5b-8复合体。在结合一些C9分子时形成 膜攻击复合体(MAC、C5b-9、末端补体复合体--TCC)。当将足够数目的MAC插入靶细胞膜中 时，其产生的开口(MAC孔)介导靶细胞的快速渗透性裂解。较低的非溶胞性浓度的MAC可以 产生其他作用。具体而言，少数C5b-9复合体插入内皮细胞和血小板中的膜插入可引起有害 的细胞激活。在一些情况下，激活可以在细胞裂解之前发生。

如上文所提及，C3a和C5a是激活的补体成分。它们可引起肥大细胞脱粒，其自嗜碱 性粒细胞及肥大细胞释放组胺，及其他炎症介质，导致平滑肌收缩、血管通透性增加、白血 球激活及其他发炎性现象，包括引起细胞过多的细胞增殖。C5a还充当趋化肽，其用于将促 炎性粒细胞吸引至补体激活位点。在支气管及肺泡上皮细胞及支气管平滑肌细胞的表面上 发现了C5a受体。在嗜曙红粒细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞及激活的淋巴细胞上 也发现了C5a受体。

发明详述

如本文所述及工作实施例中所例示的，发明人鉴定了用于aHUS的生物标志物。例 如，已发现某些蛋白的升高的或在一些情况下降低的浓度与aHUS的存在有关。类似地，在获 取自用补体抑制剂治疗的aHUS患者的生物流体中某些蛋白的降低或升高的浓度(或活性) 说明该患者对抑制剂治疗有响应。因而，可以采用对此类蛋白的浓度和/或活性水平进行分 析，以评估aHUS的风险、诊断aHUS、监测aHUS的进展或消除、和/或监测对补体抑制剂的治疗 响应(除其他以外)。

aHUS生物标志物蛋白及应用

aHUS生物标志物蛋白(以及在其中发现所述蛋白的示例性的生物流体)在表1中示 出。到本申请的提交日为止可从GenBank(美国国立生物技术信息中心(NationalCenter forBiotechnologyInformation，NCBI))获得的、与表1中所列生物标志物的每一个的名 字相关的蛋白序列在此通过提述并入。

表1

*为表中所述每个生物标志物蛋白给出了示例性的人序列的NCBI登录号。

**可溶形式的受体通过对膜结合形式的受体的蛋白水解加工而产生。

***UniProtKB(联盟：欧洲生物信息协会(EuropeanBioinformatics Institute)，Cambridge，UK；瑞士生物信息协会(SwissInstituteofBioinformatics)， Geneva，Switzerland；和蛋白质信息资源中心(ProteinInformationResource)， Washington，D.C.)名称，其用于人纤维蛋白原α，其由凝血酶切割而形成纤维蛋白。D-二聚 体是纤维蛋白的降解产物。关于纤维蛋白原至纤维蛋白至D-二聚体的基于切割的转换的描 述见于Soheir等(2009)Blood113(13)：2878-2887，其至少涉及D-二聚体形成的公开内容在 此以其整体并入。

本文提供的生物标志物可以单独使用或组合使用，作为指示剂，例如来评估患上 aHUS的风险、诊断aHUS、确定受试者是否正在经历aHUS的第一次急性发作、监测aHUS的进展 或消除、和/或监测对于补体抑制剂治疗的响应或是对这种治疗进行优化。在一些实施方案 中，可以使用本文所述的单个aHUS生物标志物蛋白。在一些实施方案中，可以将选自表1的 至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个或更多 个aHUS生物标志物蛋白组合作为小组使用。

在一些实施方案中，所述aHUS生物标志物蛋白选自补体成分因子B的蛋白质水解 片段(例如Ba或Bb)、可溶的C5b9(sC5b9)、凝血调节蛋白、VCAM-1、冯维勒布兰德因子(vWF)、 可溶的CD40配体(sCD40L)、凝血酶原片段F1+2、D-二聚体、CXCL10、MCP-1、TNFR1、IFN-γ、 ICAM-1、IL-1β、IL-12p70、补体成分C5a、β2微球蛋白(β2M)、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制 剂C、NAG、TIMP-1、NGAL、脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)、CXCL9、KIM-1、IL-18、血管内皮细胞生 长因子(VEGF)、IL-6、清蛋白、IL-8、和CCL5。可以测量表1中的一个或多个生物标志物(或本 文提及的生物标志物亚组的任一个)的浓度和/或活性。

在一些实施方案中，相对于正常对照样品中的D-二聚体浓度，D-二聚体浓度的升 高；及相对于正常对照样品中的FABP-1浓度，FABP-1浓度的升高；说明该aHUS患者正在经历 第一次急性aHUS表现。在一些实例中，这些aHUS生物标志物蛋白的一者或二者的升高是与 正常对照相比显著的升高。

在一些实施方案中，相对于分析物(其获取自例如来自未接受重复透析的aHUS患 者的样品的合并液)的对照浓度，获取自aHUS患者的生物样品中TNFR1、Ba、C5b-9、F1+2、β 2M、簇蛋白、TIMP-1、NGAL、CysC、和C5a的一个或多个(参见表7)的浓度升高，说明该患者是 接受过重复透析的患者。

在一些实施方案中，相对于分析物(其获取自例如来自未接受肾移植的aHUS患者 的样品的合并液)的对照浓度，获取自aHUS患者的生物样品中C5a和FABP-1(例如尿C5a和 FABP-1)的一者或二者的浓度升高，说明该患者是接受过肾移植的患者。

在一些实施方案中，相对于分析物(其获取自例如来自未接受重复血浆治疗的 aHUS患者的样品的合并液)的对照浓度，获取自aHUS患者的生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑 制剂C(例如尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)的浓度升高，说明该患者是接受过重复血浆治疗的 患者。

在一些实施方案中，相对于在治疗前获取自受试者的生物流体的相同类型的样品 中的Ba浓度，Ba浓度(例如血浆Ba浓度)至少10％(例如至少15、20、25、30、35、40、45、或 50％)的治疗后降低，说明该受试者具有或可能达到完全血栓形成性微血管病(TMA)响应 (即TMA事件终止)。在一些实施方案中，所述降低到第一次用补体抑制剂治疗后第12周发 生。在一些实施方案中，所述降低在第一次用补体抑制剂治疗后第12-17周之内发生。在一 些实施方案中，所述降低发生到第一次用补体抑制剂治疗后第26周发生。

在一些实施方案中，相对于在治疗前获取自受试者的生物流体的相同类型的样品 中的各自浓度，CCL5和sCD40L的一者或二者至少10％(例如至少15、20、25、30、35、40、45、或 50％)的治疗后降低，说明该受试者具有或可能达到增加的血小板计数(即血小板恢复)。在 一些实施方案中，相对于在治疗前获取自受试者的生物流体的相同类型的样品中的Ba浓 度，Ba浓度(例如血浆Ba浓度)至少10％(例如至少15、20、25、30、35、40、45、或50％)的治疗 后降低，说明该受试者具有或可能达到完全血栓形成性微血管病(TMA)响应(即TMA事件终 止)。

在一些实施方案中，本文所述aHUS生物标志物的一个或多个的状态可以预测为用 补体抑制剂治疗的aHUS患者评估的肾小球滤过率(eGFR)的改善。例如，凝血酶原F1+2(例如 在长期治疗方案中的初始治疗后4、5或6周内)和/或D-二聚体(例如在长期治疗方案中的初 始治疗后12、13、14、15、16、或17周内)浓度的降低说明用补体抑制剂治疗的aHUS患者在 eGFR方面已经达到或很可能达到有临床意义的改善。IL-6和IFN-γ浓度的正常化(例如在 长期治疗方案中的补体抑制剂初始治疗后4、5或6周内)，也表明在eGFR方面达到或很有可 能达到有临床意义的改善。Ba、CXCL9、CXCL10、和vWF浓度的正常化(例如在长期治疗方案中 的补体抑制剂初始治疗后12、13、14、15、16、或17周内)，也表明在eGFR方面达到或很有可能 达到有临床意义的改善。在一些实施方案中，Ba、CXCL9、CXCL10、β2M(例如在尿液中)、CysC (例如在尿液中)、vWF、D-二聚体、簇蛋白(例如在尿液中)、和/或FABP-1(例如在尿液中)浓 度的正常化(例如在长期治疗方案中的补体抑制剂初始治疗后26周内)，也表明在eGFR方面 达到或很有可能达到有临床意义的改善。

用于在受试者(例如哺乳动物，例如人)中监测或评估一个或多个非典型溶血性尿 毒综合征(aHUS)相关的生物标志物蛋白的状态的方法包括：在获取自受试者的生物流体中 测量(i)生物流体中至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、或20个)aHUS相关生物标志物蛋白的浓度的一者或二者。

在生物样品中测量或确定蛋白表达水平可以通过合适的方法进行(参见例如： Harlow和Lane(1988)“Antibodies：ALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor Laboratory：ColdSpringHarbor，NY)。通常来说，蛋白水平通过如下步骤来确定：将获取 自受试者的生物样品与针对一个或多个aHUS生物标志物蛋白的结合剂接触；在样品(例如 生物流体)中检测与所述结合剂结合的aHUS生物标志物蛋白的一个或多个的水平；以及将 该样品中aHUS生物标志物蛋白的一个或多个的水平与对照样品(例如正常样品)中相应蛋 白生物标志物的水平进行比较。在一些实施方案中，合适的结合剂是核糖体(有或没有肽成 分)、RNA分子、或多肽(例如包含蛋白标记物的多肽序列的多肽、其肽变体、或这种序列的非 肽模拟物)。

合适的结合剂还包括对本文所述aHUS生物标志物蛋白特异性的抗体(例如对表1 中所列任何标志物特异性的抗体)。用于在本发明的方法中使用的合适的抗体包括单克隆 抗体和多克隆抗体和抗体的抗原结合片段(例如Fab片段或scFv)。抗体(包括单克隆抗体和 多克隆抗体)、片段和嵌合体可以用本领域已知的方法来制备(参见例如Kohler和Milstein (1975)Nature256：495-497；Kozbor等(1985)JImmunolMethods81：31-42；Cote等 (1983)ProcNatlAcadSciUSA80：2026-203；及Zhang等(2002)JBiolChem277： 39379-39387)。用于本发明的方法的抗体可以通过本领域所熟知的方法进行纯化。抗体还 可以获取自商业来源。

在一些实施方案中，结合剂直接或间接地用可检测模块进行标记。可检测剂的作 用是通过使结合剂与蛋白标志物(或其片段)结合形成的复合体可视化，从而推动诊断方法 的检测步骤。可以对所述可检测剂进行选择，以使其产生能测量的信号，并且其强度与所分 析的样品中存在的蛋白标志物的量相关(优选为成比例的)。用于标记生物分子(如多肽和 抗体)的方法是本领域所熟知的。可以使用大量的各种可检测剂的任一种用于实施本发明。 合适的可检测剂包括但不限于：各种配体、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、微粒(如，例 如量子点、纳米晶体、磷光体等)、酶(如，例如用于ELISA的酶，即辣根过氧化物酶、β-半乳糖 苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记物、磁性标记物、和生物素、地高辛配基或其他抗血 清或单克隆抗可得的半抗原和蛋白。

在一些实施方案中，可以将所述结合剂(例如抗体)固定化在载体或支持物(例如 珠、磁性颗粒、乳胶颗粒、微量滴定板孔、杯(cuvette)、或其他反应容器)上。合适的载体或 支持物材料的例子包括琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素、葡聚糖、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、辉长岩、滤纸、磁铁矿、离子交换树脂、塑料 膜、塑料管、玻璃、聚胺-甲基乙烯基-醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚 物、尼龙、丝绸等等。结合剂可以用对第一结合剂特异性的第二结合剂来间接地固定化(例 如对蛋白标志物特异性的小鼠抗体可以用包被在载体或支持物上的绵羊抗小鼠IgGFc片 段特异性抗体来固定化)。

生物样品中的蛋白表达水平可以用免疫测定法来确定。此类测定法的例子是时间 分辨荧光免疫测定法(TR-FIA)、放射免疫测定法、酶免疫测定法(例如ELISA)、免疫荧光免 疫沉淀法、乳胶凝集法(latexagglutination)、血细胞凝集法、Western印迹法、和组织化 学测试，其为本领域熟知的常规方法。对结合剂与蛋白标志物结合形成的复合体产生的信 号检测和定量方法取决于测定法的性质和可检测模块(例如荧光模块)的性质。

在一个例子中，基因(例如表1中所示的aHUS生物标志物蛋白)的蛋白表达的存在 或量可以用Western印迹技术来确定。例如，可以从生物样品制备裂解物，或可以将生物样 品(例如生物流体)本身与Laemmli缓冲液接触并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)。用SDS-PAGE分辨的蛋白根据大小而分离开来，然后可以将其转移至滤膜 (例如硝酸纤维素)并用可检测标记的对目的蛋白特异性的抗体对其进行免疫印迹技术处 理。结合的可检测标记的抗体的存在或量说明生物样品中蛋白的存在或量。

在另一个例子中，可以用免疫测定法来检测和/或测量aHUS生物标志物蛋白(例如 表1中所述的一项)的蛋白表达。如上所述，出于检测目的，可以用带有检测模块(例如荧光 剂或酶)的抗体来进行免疫测定法。可以将来自生物样品的蛋白直接缀合至固相基质(例如 多孔测定板、硝酸纤维素、琼脂糖、编码的颗粒(encodedparticles)、或磁 珠)，或它在结合至特定结合对的第二成员(例如链霉亲合素或生物素)之时，可以缀合至附 接至固相基质的，该特定结合对的第一成员(例如生物素或链霉亲合素)。这种对固相基质 的附接允许蛋白从生物样品的其他干扰性的或不相关的成分纯化出来，之后与检测抗体接 触，并且还允许随后对未结合的抗体的洗涤。在此，如上所述，结合的可检测标记的抗体的 存在或量说明生物样品中蛋白的存在或量。

或者，蛋白表达水平可以用本领域已知用于检测蛋白的基于质谱术的方法或基于 成像的方法来确定。其他适合的方法包括2D-凝胶电泳、基于蛋白质组学的方法(如鉴定从 凝胶回收的个体蛋白(例如通过质谱术或N-末端测序))和/或生物信息学。

用于检测或测量蛋白表达的方法可以任选地以允许快速制备、加工、和分析多样 品的形式来进行。例如，其可以在多孔测定板(例如96孔或386孔)或阵列(例如蛋白质芯片) 中。用于多种试剂的储液可以手动或机械化地提供，并且随后的样品制备、移液、稀释、混 合、分配、洗涤、温育(例如杂交)、样品读出、数据收集(光学数据)和/或分析(计算机辅助图 像分析)可以用市售的能够检测由测定法产生的信号的分析软件、机器设备(robotics)、和 检测仪器来机械化地完成。此类检测器的例子包括但不限于分光光度计、发光计、荧光计、 和测量放射性同位素衰减的装置。示例性的高通量的基于细胞的测定法(例如检测细胞中 靶蛋白的存在或水平的)可以利用VTIHCSReader或HCS Reader技术(CellomicsInc.，Pittsburg，PA)。

用于检测vWF的活性的方法也是本领域已知的，且描述于本文中(例如工作实施 例)。也参见，例如Horvath等(2004)ExpClinCardiol9(10)：31-34。商品试剂盒也是可获 得的-InstrumentationLaboratory(Bedford，MA；产品编号：0020004700)和Quest Diagnostics(Madison，NJ)。

在一些实施方案中，可以评估和/或测量至少两个aHUS生物标志物蛋白(例如至少 3个蛋白、至少4个蛋白、至少5个蛋白、至少6个蛋白、至少7个蛋白、至少8个蛋白、至少9个蛋 白、至少10个蛋白、至少11个蛋白、至少12个蛋白、至少13个蛋白、至少14个蛋白、至少15个 蛋白、至少16个蛋白、至少17个蛋白、至少18个蛋白、至少19个蛋白、至少20个蛋白、至少21 个蛋白、至少22个蛋白、至少23个蛋白、或至少24个蛋白或更多)的蛋白表达水平(或活性)。

在一些实施方案中，用于测量aHUS生物标志物蛋白的生物流体是血液。在一些实 施方案中，所述生物流体是血液级分，例如血清或血浆。在一些实施方案中，所述生物流体 是尿液。在一些实施方案中，所有的测量是在一种生物流体样品(例如血清样品)上进行的。 在一些实施方案中，测量是在获取自受试者的至少两种不同的生物流体上进行的。例如，在 一些实施方案中，在获取自患者的血清样品中测量一个或多个aHUS生物标志物蛋白的浓度 或活性。在一些实施方案中，血液样品和尿液样品是可得到的，从而允许在两种不同样品基 质中测试不同的分析物。

受试者可以是，例如患有aHUS、疑患有aHUS、或具有患上aHUS风险的人。所述受试 者可以是已接受(或正在接受)补体抑制剂(例如补体成分C5抑制剂，如抗-C5抗体)治疗的 受试者。治疗可以发生在从所述受试者获取样品前少于一个月(例如少于31、30、29、28、27、 26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1天)。

该方法还可以包括确定受试者是否患有aHUS或具有患上aHUS的风险的步骤。当所 述受试者已接受或正在接受按照预定给药方案的补体抑制剂(例如抗-C5抗体)治疗时，该 方法还可以包括确定所述患者是否对补体抑制剂治疗是(治疗上)响应性的。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，该方法需要记录至少一个aHUS生 物标志物蛋白的浓度测量值。所述记录可以是书面的或记录于计算机可读的介质上。该方 法还可以包括将所述至少一个aHUS生物标志物蛋白的浓度测量值传达给受试者和/或负责 医护该受试者的医疗人员。

在一些实施方案中，本文所述方法的任一种可以包括如下步骤：如果受试者对按 照预定的给药方案用该抑制剂的治疗不是响应性的，则以相对于预定的给药方案更高的剂 量或更高的频率对受试者施用所述补体抑制剂。

本文所述方法的一些涉及将aHUS生物标志物蛋白的测量浓度或活性(在获取自受 试者的生物样品中测得)与对照样品进行比较。在一些实施方案中，在对受试者施用补体抑 制剂(例如C5抑制剂，如依库丽单抗)之前从受试者获取对照样品。在一些实施方案中，对照 样品可以是(或是可以基于)例如获取自一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、或40个或更多个)未施用过变体拮抗剂的健康个体的样品集。在一些实施方案中，对 照样品可以是(或是可以基于)例如获取自两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25、30、35、或40个或更多个)个体的合并的样品。在本文所述的方法的任一种的一些实 施方案中，合并的样品可以来自健康个体，或至少是未患有或未疑患aHUS(也没有患上aHUS 的风险)的个体。例如，确定受试者是否患有aHUS，可以涉及比较受试者中一个或多个血清 生物标志物的测量浓度，以及将所述测量浓度与合并的健康样品中相同生物标志物的平均 浓度进行比较。类似地，确定aHUS相关生物标志物的浓度或活性是否已随着使用补体抑制 剂治疗而降低，可以涉及将补体抑制剂治疗前从受试者获取的生物流体中蛋白的浓度或活 性与所述抑制剂治疗后(例如用所述抑制剂治疗(例如长期治疗中的一系列治疗的第一个) 后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、6周、两个月、或三个月)从患者获取的 相同生物流体的样品中蛋白的浓度或水平进行比较。

在一些实施方案中，确定补体抑制剂是否在人中产生了想要的效果(例如aHUS生 物标志物蛋白的浓度或活性的降低)，可以通过如下方法来进行：查询所述蛋白的治疗后浓 度是否落在了说明人对于补体抑制剂的响应性的预定范围内。在一些实施方案中，确定补 体抑制剂是否在人中产生了想要的效果，可以包括查询一个或多个aHUS生物标志物蛋白的 治疗后浓度或活性是否落在预定的截止值(cut-offvalue)之上或之下。截止值通常是给 定生物流体中给定蛋白的浓度或活性，如果在其之上或之下则认为说明了某种表型——例 如对于补体抑制剂治疗的响应性。

在本文所述的方法的任一种的一些实施方案中，同一从业人员可以在确定一个或 多个aHUS生物标志物蛋白的浓度是否发生了变化之前对受试者施用补体抑制剂，然而在一 些实施方案中，对受试者施用抑制剂的从业人员与确定受试者中是否发生响应的从业人员 不是同一人。在一些实施方案中，从业人员可以在施用抑制剂之前从受试者获取生物样品 (例如血液样品)。在一些实施方案中，从业人员可以在对受试者施用抑制剂之后从受试者 获取生物样品(例如血液样品)。在一些实施方案中，治疗后的样品可以在对受试者施用抑 制剂后少于48小时(例如少于47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、 30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、 2小时、或甚至少于1小时)从受试者获取。在一些实施方案中，所述治疗后样品可以在对受 试者施用抑制剂后少于20天(例如少于19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、或1天)从受试者获取。在一些实施方案中，生物样品在对受试者施用抑制剂后不超过20 天(例如不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1天)从受试者获 取。

在一些实施方案中，本文所述方法的多种步骤可由多于一名从业人员来进行。例 如，一名从业人员可以分析(例如测量其中一个或多个aHUS生物标志物蛋白的浓度或活性) 治疗之前或之后获取自受试者的样品。另一名从业人员可以接收关于第一名从业人员进行 的样品分析的信息，由此确定例如受试者是否对补体抑制剂治疗有响应。在一些实施方案 中，又一名从业人员可以从患者获取治疗前的生物样品，而第四名从业人员可以从受试者 获取治疗后的生物样品。在一些实施方案中，所有步骤是由同一名从业人员实施的。

生物样品和样品收集

用于在本文所述方法中使用的合适的生物样品包括：例如任何生物流体。生物样 品可以是，例如获取自受试者(例如哺乳动物，如人)的样本，或可以是来源于该种受试者。 生物样品还可以是生物流体，如尿液、全血或其级分(例如血浆或血清)、唾液、精液、痰、脑 脊髓液、泪液、或粘液。如果需要，生物样品还可以进一步分级化为含有具体的目的分析物 (例如蛋白)的级分。例如，全血样品可以分级化为血清或分级化为含有具体类型的蛋白的 级分。如果需要的话，生物样品可以是来自受试者的不同生物样品的组合，如两种不同流体 的组合。

适于本发明的生物样品可以是从受试者收集的新鲜的或冷冻的样品，或具有已知 的诊断、治疗和/或结果历史的存档样品。生物样品可以获取自受试者，例如患有、疑患有、 或具有患上补体相关病症(如aHUS)的风险的受试者。可以采用任何合适的用于获取生物样 品的方法，虽然示例性的方法包括例如放血术、拭子(例如口腔拭子)、灌洗、或细针抽出活 检程序。生物样品还可以获取自骨髓。

在一些实施方案中，可以从生物样品制备蛋白提取物。在一些实施方案中，蛋白提 取物含有总蛋白含量。蛋白提取的方法是本领域所熟知的。参见例如Roe(2001)“Protein PurificationTechniques：APracticalApproach”，第二版，OxfordUniversityPress。 许多不同的和多用的试剂盒可用于从体液和组织提取蛋白，并且可商购自例如BioRad Laboratories(Hercules，CA)、BDBiosciencesClontech(MountainView，CA)、Chemicon International，Inc.(Temecula，CA)、Calbiochem(SanDiego，CA)、PierceBiotechnology (Rockford，IL)、和InvitrogenCorp.(Carlsbad，CA)。

用于获取和/或储存样品同时保有生物样品中细胞活性或完整性的方法是本领域 技术人员所熟知的。例如，可以进一步将生物样品与一个或多个额外的制剂(如合适的缓冲 剂和/或抑制剂，包括蛋白酶抑制剂)接触，所述制剂意在保留蛋白结构，或将其变化(例如 摩尔渗透压浓度或pH的变化)最小化。此类抑制剂包括，例如螯合剂如乙二胺四乙酸 (EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、和亮抑肽酶。 用于储存或其它方面操作全细胞的合适的缓冲液和条件，见于例如Pollard和Walker (1997)，“BasicCellCultureProtocols，”Methodsinmolecularbiology之卷75， HumanaPress；Masters(2000)“Animalcellculture：apracticalapproach，” Practicalapproachseries之卷232，OxfordUniversityPress；以及Jones(1996) “Humancellcultureprotocols，”Methodsinmolecularmedicine之卷2，Humana Press。

还可以对样品进行加工以清除存在的干扰物质，或使其减至最少。例如，可以对生 物样品进行分级化或纯化，以去除一种或多种不感兴趣的材料(例如细胞)。分级化或纯化 生物样品的方法包括但不限于：流式细胞术、荧光激活细胞分选术、和沉降。

补体抑制剂

任何结合并抑制(或以其他方式抑制)任何人补体成分的产生和/或活性的化合物 可以根据本公开内容来加以利用。例如，补体抑制剂可以是例如小分子、核酸或核酸类似 物、肽模拟物、或非核酸非蛋白的大分子。这些制剂包括但不限于：有机小分子、RNA适配体、 L-RNA适配体、镜像寡核苷酸(Spiegelmer)、反义化合物、双链RNA、小干扰RNA、锁定核酸 (lockednucleicacid)抑制剂、和肽核酸抑制剂。在一些实施方案中，补体抑制剂可以是 蛋白或蛋白片段。

在一些实施方案中，组合物含有特异性针对人补体成分的抗体。一些化合物包含 针对补体成分C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、因子D、因子B、因子P、MBL、MASP-1、MASP-2、备 解素、或前述任一项的生物活性片段的抗体，从而预防C5a相关的过敏毒素活性的产生和/ 或预防膜攻击复合体C5b-9的组装。

组合物还可以含有天然形成的或可溶形式的补体抑制性化合物，如CR1、LEX-CR1、 MCP、DAF、CD59、因子H、眼镜蛇毒因子、FUT-175、补体结合抑制素、和K76COOH。其他能利用来 结合或以其他方式阻断人补体成分的任一种的产生和/或活性的化合物包括但不限于：蛋 白、蛋白片段、肽、小分子、RNA适配体，包括ARC187(其可商购自ArchemixCorporation， Cambridge，MA)、L-RNA适配体、镜像寡核苷酸、反义化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂、可用于 RNA干扰(RNAi)中的分子如双链RNA，包括小干扰RNA(siRNA)、锁定核酸(LNA)抑制剂、和肽 核酸(PNA)抑制剂，等等。

在一些实施方案中补体抑制剂抑制补体的活化。例如，补体抑制剂能结合C1(例如 C1q、C1r、或C1s)并抑制其补体活化活性，或者补体抑制剂能结合并抑制C2、C3、或C4(例如 抑制其切割)。在一些实施方案中，抑制剂抑制旁路和/或经典补体途径的C3转化酶和/或C5 转化酶的形成或组装。在一些实施方案中，补体抑制剂抑制末端补体形成，例如C5b-9膜攻 击复合体的形成。例如，抗体补体抑制剂可以包括抗-C5抗体。此类抗-C5抗体可以直接与C5 和/或C5b相互作用，从而抑制C5b的形成和/或生理功能。

在一些实施方案中，本文所述组合物可以含有人补体成分C5的抑制剂(例如结合 至人补体成分C5蛋白或其生物活性片段(如C5a或C5b)的抗体或其抗原结合片段)。如本文 所用，“补体成分C5的抑制剂”是抑制如下项的任意试剂：(i)补体成分C5蛋白的表达或适当 的细胞内运输或细胞分泌；(ii)C5切割片段C5a或C5b的活性(例如C5a与其关联胞内受体的 结合或C5b与C6和/或其他末端补体复合体成分的结合；见上文)；(iii)人C5蛋白被切割形 成C5a和C5b；(iv)补体成分C5蛋白的适当细胞内运输或细胞分泌；或(v)C5蛋白或编码C5蛋 白的mRNA的稳定性。对补体成分C5蛋白表达的抑制包括：对编码人C5蛋白的基因转录的抑 制；编码人C5蛋白的mRNA的降解增加；对编码人C5蛋白的mRNA翻译的抑制；人C5蛋白的降解 增加；对前体人C5蛋白原(pre-prohumanC5protein)的适当加工的抑制；或对人C5蛋白 的适当运输或细胞分泌的抑制。用于确定候选制剂是否是人补体成分C5抑制剂的方法是本 领域已知的且在本文中描述。

人补体成分C5抑制剂可以是，例如小分子、多肽、多肽类似物、核酸、或核酸类似 物。

如本文所用，“小分子”意指分子量优选为低于约6kDa、最优选为低于约2.5kDa的 制剂。许多制药公司具有丰富的化学和/或生物混合物文库，包括小分子阵列，通常是真菌、 细菌、或藻类提取物，其可以用本申请的测定法的任一个筛选。本申请涵盖使用(除其他以 外)小分子文库、肽文库、或天然产物集合。Tan等描述了具有超过两百万合成化合物的文 库，所述文库与小型化的基于细胞的测定法相容(JAmChemSoc(1998)120：8565-8566)。 此种文库可用于筛选结合至目的靶抗原(例如补体成分C5)的制剂，这是在本申请的范围内 的。有许多市售的化合物文库，如ChembridgeDIVERSet。文库还可从学术研究者处获取，例 如获取自NCI发展治疗剂项目(NCIdevelopmentaltherapeuticsprogram)的Diversity 套组。可以采用合理药物设计。例如，合理药物设计可以使用人补体成分C5蛋白的晶体或溶 液结构信息。参见例如Hagemann等(2008)JBiolChem283(12)：7763-75及Zuiderweg等 (1989)Biochemistry28(1)：172-85中所述的结构。合理药物设计还可以基于已知化合物 而完成，例如已知的C5抑制剂(例如结合至人补体成分C5蛋白的抗体，或其抗原结合片段)。

肽模拟物可以是化合物，其中至少受试多肽的一部分是经修饰的，并且所述肽模 拟物的三维结构保持与受试多肽基本相同。肽模拟物可以是本公开内容的受试多肽的类似 物，所述类似物其本身是在所述受试多肽序列内含有一个或多个替代或其他修饰的多肽。 或者，受试多肽序列的至少一部分可以用非肽结构来替换，从而基本保留受试多肽的三维 结构。换言之，受试多肽序列内一个、两个或三个氨基酸残基可以用非肽结构来替换。此外， 受试多肽的其他肽部分可以(但无需)用非肽结构来替换。肽模拟物(肽和非肽基类似物二 者)可以具有改进的特性(例如降低的蛋白水解作用、增加的保留或增加的生物利用度)。肽 模拟物通常具有改进的口服利用度，这使其尤其适于治疗人或动物中的病症。应当注意的 是，肽模拟物可以具有或可以不具有相似的二维化学结构，但分享三维结构特征和几何学 特征。每个肽模拟物还可以具有一个或多个独特的额外结合元件。

核酸抑制剂可用于结合并抑制目的靶抗原。核酸拮抗剂可以是例如适配体。适配 体是短的寡核苷酸序列，其能用于识别和特异性地结合几乎任意分子，包括细胞表面蛋白。 通过指数富集的配体的系统演化(SELEX)方法是强大的，并且能用其容易地鉴定此类适配 体。可以为广泛的对于治疗和诊断重要的蛋白(如生长因子和细胞表面抗原)制作适配体。 这些寡核苷酸以与抗体相似的亲和力和特异性结合其靶标(参见例如Ulrich(2006)Handb ExpPharmacol.173：305-326)。

在一些实施方案中，补体抑制剂是非抗体支架蛋白。这些蛋白通常通过对现有抗 原结合蛋白的基于组合化学的适配调整而获得。例如，人转铁蛋白针对人转铁蛋白受体的 结合位点可以用组合化学进行修饰，以生成转铁蛋白变体的多样性文库，其中一些已获得 针对不同抗原的亲和性。Ali等(1999)JBiolChem274：24066-24073。人转铁蛋白不参与 结合受体的部分保持不变，并充当支架，如同抗体的框架区，以呈现变异结合位点。然后像 筛选抗体文库那样针对目的靶抗原筛选该文库，以鉴定那些对于靶抗原具有最佳选择性和 亲和力的变体。非抗体支架蛋白虽然在功能上与抗体相似，但被认为与抗体相比具有一些 优势，该优势包括(除其他以外)：增强的可溶性和组织穿透性、制造成本较低、以及易于与 其他目的分子缀合。Hey等(2005)TRENDSBiotechnol23(10)：514-522。

本领域技术人员会理解，非抗体支架蛋白的支架部分可以包括例如：金黄色葡萄 球菌(S.aureus)蛋白A的Z结构域、人转铁蛋白、人第十纤连蛋白III型结构域、人胰蛋白酶 抑制剂的kunitz结构域、人CTLA-4、锚蛋白重复蛋白、人脂笼蛋白、人晶状体蛋白、人泛素、 或来自E.elaterium的胰蛋白酶抑制剂的全部或部分。同上。

在一些实施方案中，补体抑制剂是抗体，或其抗原结合片段，其结合至人补体成分 C5蛋白(下文中，所述抗体有时可称为“抗-C5抗体”)。

在一些实施方案中，抗-C5抗体能结合至人补体成分C5蛋白的α链中的表位。结合 至C5的α链的抗体描述于例如PCT申请公开号WO2010/015608和美国专利号6,355,245中。 在一些实施方案中，抗-C5抗体能结合至人补体成分C5蛋白的β链中的表位。结合至C5β链的 抗体描述于例如Moongkarndi等(1982)Immunobiol162：397；Moongkarndi等(1983) Immunobiol165：323；及Mollnes等(1988)ScandJImmunol28：307-312中。

另外的示例性的人补体成分C5抗原片段在例如美国专利号6,355,245中公开，其 公开内容在此通过提述并入。

适于用于本文所述的融合蛋白中的其他抗-C5抗体及其抗原结合片段，描述于例 如PCT申请公开号WO2010/015608中，其公开内容在此通过提述以其整体并入。

在一些实施方案中，抗-C5抗体特异性地结合至人补体成分C5蛋白(例如具有SEQ IDNO：1中所示氨基酸序列的人C5蛋白)。术语“特异性结合”或“特异性地结合”意指两个分 子形成在生理条件下相对稳定的复合体(例如抗体和补体成分C5蛋白之间的复合体)。通 常，当缔合常数(K_a)高于10⁶M^-1时，认为结合是特异性的。因此，抗体能以至少为(或大于)10⁶(例如至少或大于10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、或10¹⁵或更高)M^-1的K_a特异性地结 合C5蛋白。特异性地结合至人补体成分C5蛋白的抗体的例子描述于例如美国专利号6,355, 245中，其公开内容在此通过提述以其整体并入。

本文所述的抗-C5抗体能在阻断补体成分C5蛋白(例如人C5蛋白)的C5a和/或C5b 活性片段的产生或活性方面具有活性。通过这种阻断效果，所述抗-C5抗体抑制例如C5a的 促炎性效果和在细胞表面处C5b-9膜攻击复合体(MAC)的产生。具有阻断C5a产生的能力的 抗-C5抗体描述于例如Moongkarndi等(1982)Immunobiol162：397和Moongkarndi等(1983) Immunobiol165：323中。

在一些实施方案中，抗-C5抗体或其抗原结合片段，能将C5蛋白结合至人补体成分 C3b(例如AP或CPC5转化酶复合体中存在的C3b)的能力降低大于50％(例如大于55、60、65、 70、75、80、85、90、或95％或更多)。在一些实施方案中，在结合至C5蛋白时，抗-C5抗体或其 抗原结合片段能将C5蛋白结合至人补体成分C4b(例如CPC5转化酶中存在的C4b)的能力降 低大于50％(例如大于55、60、65、70、75、80、85、90、或95％或更多)。用于确定抗体是否能阻 断补体成分C5蛋白的C5a和/或C5b活性片段的产生或活性或对补体成分C4b或C3b的结合的 方法是本领域已知的，且描述于例如美国专利号6,355,245和Wurzner等(1991)Complement Inflamm8：328-340。

在一些实施方案中，所述组合物包含，和/或所述抗体是依库丽单抗(AlexionPharmaceuticals，Inc.，Cheshire，CT)(参见例如Kaplan(2002)CurrOpin InvestigDrugs3(7)：1017-23；Hill(2005)ClinAdvHematolOncol3(11)：849-50；及 Rother等(2007)NatureBiotechnology25(11)：1256-1488)。在一些实施方案中，所述组 合物包含，和/或所述抗体是培克珠单抗(AlexionPharmaceuticals，Inc.，Cheshire，CT) (参见例如Whiss(2002)CurrOpinInvestigDrugs3(6)：870-7；Patel等(2005)Drugs Today(Barc)41(3)：165-70；及Thomas等(1996)MolImmunol33(17-18)：1389-401)。

在一些实施方案中，C5抑制剂是与C5a结合的抗体(在本文中有时称为“抗-C5a抗 体”)。在一些实施方案中，所述抗体结合至C5a，但不结合至全长C5。在一些实施方案中，抗 体与C5a的结合能抑制C5a的生物活性。用于测量C5a活性的方法包括例如趋化性测定法、 RIA、或ELISA(参见例如Ward和Zvaifler(1971)JClinInvest50(3)：606-16及Wurzner等 (1991)ComplementInflamm8：328-340)。在一些实施方案中，抗体与C5a的结合能抑制C5a 和C5aR1之间的相互作用。用于检测和/或测量C5a和C5aR1之间的相互作用(在存在和不存 在抗体的情况下)的合适的方法是本领域已知的，且描述于例如Mary和Boulay(1993)EurJ Haematol51(5)：282-287；Kaneko等(1995)Immunology86(1)：149-154；Giannini等 (1995)JBiolChem270(32)：19166-19172；及美国专利申请公开号20060160726中。例如， 可检测标记(例如放射性标记)的C5a与表达C5aR1的外周血单个核细胞的结合可以在存在 或不存在抗体的情况下进行评价。与不存在抗体的情况下的结合量相比，存在抗体的情况 下与C5aR1结合的可检测标记的C5a的量的降低，说明该抗体抑制C5a和C5aR1之间的相互作 用。在一些实施方案中，抗体与C5a的结合能抑制C5a和C5L2之间的相互作用(见下文)。用于 检测和/或测量C5a和C5L2之间的相互作用的方法是本领域已知的，且描述于例如Ward (2009)JMolMed87(4)：375-378和Chen等(2007)Nature446(7132)：203-207中(见下 文)。

在一些实施方案中，C5抑制剂是与C5b结合的抗体(在本文中有时称为“抗-C5b抗 体”)。在一些实施方案中，所述抗体结合至C5b，但不结合至全长C5。C5b的结构描述于例如M üller-Eberhard(1985)BiochemSocSymp50：235-246；及Yamamoto和Gewurz(1978)J Immunol120(6)：2008-2015中。如上文所述，C5b联合C6、C7、和C8，在靶细胞表面形成C5b-8 复合体。在一系列联合期间形成的蛋白复合中间体包括C5b-6(包括C5b和C6)、C5b-7(包括 C5b、C6、和C7)、和C5b-8(包括C5b、C6、C7、和C8)。在一些C9分子结合之时，形成膜攻击复合 体(MAC，C5b-9末端补体复合体(TCC))。当足够数目的MAC插入至靶细胞膜中时，它们产生的 开口(MAC孔)介导靶细胞的快速渗透性裂解。

在一些实施方案中，抗体与C5b的结合能抑制C5b和C6之间的相互作用。在一些实 施方案中，抗体与C5b的结合能抑制C5b-9MAC-TCC的组装或活性。在一些实施方案中，抗体 与C5b的结合能抑制补体依赖性的细胞裂解(例如体外的和/或体内的)。用于评估抗体是否 抑制补体依赖性的裂解的合适的方法包括，例如用于检测可溶的C5b-9的活性的溶血测定 法或其他功能性测定法。例如，在存在抗体情况下补体的细胞裂解能力的降低可以通过 Kabat和Mayer(编)，“ExperimentalImmunochemistry，第2版，”135-240，Springfield，IL， CCThomas(1961)，第135-139页所述的溶血测定法来来测量，或通过此种测定法的常规变 体如鸡红细胞溶血方法来测量，如例如Hillmen等(2004)NEnglJMed350(6)：552中所 述。

与C5b结合的抗体以及用于制造此类抗体的方法是本领域已知的。市售的抗-C5b 抗体可从一些供应商处获取，包括例如HycultBiotechnology(产品编号：HM2080；克隆 568)和Abcam^TM(ab46151或ab46168)。

用于确定具体的制剂是否是人补体成分C5抑制剂的方法描述于本文中，并且是本 领域已知的。例如，C5a和C5b在体液中的浓度和/或生理活性可以通过本领域所熟知的方法 来测量。用于测量C5a浓度或活性的方法包括例如趋化性测定法、RIA、或ELISA(参见例如 Ward和Zvaifler(1971)JClinInvest.50(3)：606-16及Wurzner等(1991)Complement Inflamm.8：328-340)。对于C5b，可以使用如本文所讨论的溶血测定法或用于可溶的C5b-9 的测定法。也可以使用本领域已知的其他测定法。使用这些或其他合适的类型的测定法，可 以筛选出能抑制人补体成分C5的候选制剂(如抗-C5抗体)，从而例如鉴定对于本文所述方 法有用的化合物和确定此类化合物的合适剂量水平。

用于确定候选化合物是否抑制人C5切割为C5a和C5b形式的方法是本领域已知的， 并描述于例如Moongkarndi等(1982)Immunobiol162：397；Moongkarndi等(1983) Immunobiol165：323；Isenman等(1980)JImmunol124(1)：326-31；Thomas等(1996) Mol.Immunol33(17-18)：1389-401；及Evans等(1995)Mol.Immunol32(16)：1183-95中。

对人补体成分C5的抑制还能降低受试者体液中补体的细胞裂解能力。存在的补体 的细胞裂解能力的这种降低可以通过本领域熟知的方法来测量，如，例如通过常规的溶血 测定法如Kabat和Mayer(编)，“ExperimentalImmunochemistry，第2版，”135-240， Springfield，IL，CCThomas(1961)，第135-139页中所述的溶血测定法，或通过此种测定法 的常规变体如鸡红细胞溶血方法来测量，如例如Hillmen等(2004)NEnglJMed350(6)： 552中所述。

与C3b结合且例如抑制C3b转化酶的抗体也是本领域所熟知的。参见例如PCT申请 公开号WO2010/136311、WO2009/056631、和WO2008/154251，其各自的公开内容在此通过 提述以其整体并入。拮抗性的抗-C6和抗-C7抗体在例如Brauer等(1996)Transplantation 61(4)：588-594和美国专利号5,679,345中已有描述。

在一些实施方案中，所述抗体是抗-因子B抗体(如由ATCC保藏号PTA-6230产生的 单克隆抗体1379)。抗-因子B抗体还描述于例如Ueda等(1987)JImmunol138(4)：1143-9； Tanhehco等(1999)TransplantProc31(5)：2168-71；美国专利号7,999,082和7,964,705； 及PCT公开号WO09/029669中。

在一些实施方案中，所述抗体是抗-因子D抗体，例如Pascual等(1990)JImmunol Methods127：263-269；Sahu等(1993)MolImmunol30(7)：679-684；Pascual等(1993)Eur JImmunol23：1389-1392；Niemann等(1984)JImmunol132(2)：809-815；美国专利号7, 439,331；或美国专利申请公开号20080118506中所述的抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是抗-备解素抗体。合适的抗-备解素抗体也是本领 域熟知的，且包括例如美国专利申请公开号20110014614和PCT申请公开号WO2009110918。

治疗方法

本文还提供用于在受试者(例如人)中治疗或预防aHUS的组合物和方法。可以用多 种方法将所述组合物(例如补体抑制剂和/或二级制剂)施用于受试者，例如人受试者，所述 方法部分取决于施用途径。所述途径可以是例如静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹 膜内(IP)注射、或肌内注射。

施用可以通过例如局部输注、注射、或通过植入物的方法来达到。植入物可以是多 孔的、无孔的、或凝胶状的材料，包括膜，如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。可以将所述植入 物配置用于持续的或周期性地释放组合物于受试者。参见例如美国专利公开号 20080241223；美国专利号5,501,856；4,863,457；和3,710,795；及欧洲专利号EP488401和 EP430539，其各自的公开内容在此通过提述以其整体并入。所述组合物可以通过可移植装 置递送至受试者，所述装置例如扩散性的(diffusive)、可侵蚀性的(erodible)、对流性 (convective)的系统，例如渗透泵、生物可降解植入物、电扩散系统、电渗透系统、蒸汽压力 泵、电解泵、泡腾性(effervescent)泵、压电泵、基于侵蚀的系统、或机电系统。

补体抑制剂(例如抗-C5抗体或其片段)的合适剂量(该剂量能在受试者中治疗或 预防aHUS)会取决于多种因素，包括例如要治疗的受试者的年龄、性别、和体重，以及具体使 用的抑制剂化合物。例如，与治疗患有aHUS的受试者所需的抗-C5抗体剂量相比，可能需要 不同剂量的特异性针对人C5的siRNA来治疗同一患者。其他影响对受试者施用剂量的因素 包括例如aHUS的类型或严重程度。例如，患有CFH相关aHUS的受试者可能需要施用与患有 MCP相关aHUS的受试者不同剂量的抑制剂。其他因素可以包括例如并行或既往影响受试者 的其他医学病症、受试者的总体健康状况、受试者的遗传特性、饮食、施用时间、排泄率、药 物组合、以及对受试者施用的任何其他额外的治疗剂。应当理解的是，针对任何具体受试者 的具体剂量和治疗方案取决于实施治疗的医疗人员(例如医生或护士)的判断。

可以以固定剂量或以毫克每千克“mg/kg”的剂量施用抑制剂。在一些实施方案中， 还可以选择剂量来降低或避免产生针对组合物中一个或多个活性剂的抗体或其他宿主免 疫反应。在不出于限制目的情况下，示例性的抑制剂(如抗-C5抗体)剂量包括：例如1- 100mg/kg、0.5-50mg/kg、0.1-100mg/kg、0.5-25mg/kg、1-20mg/kg、及1-10mg/kg的体重。

在一些实施方案中，可以以约900mg的剂量对人约每12天(例如约每10、11、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、28、30、42、或49天或更多天)静脉内施用抗-C5抗体(例如依库丽单 抗)。参见例如Hill等(2005)Blood106(7)：2559。

在一些实施方案中，可以以约600mg(例如约625、650、700、725、750、800、825、850、 875、900、925、950、或1,000mg或更多)的剂量对人每周(任选持续两周或更多周(例如3、4、 5、6、7、或8周或更多周))静脉内施用抗-C5抗体(例如依库丽单抗)。在初始治疗后，可以以 约900mg的剂量对人约每14天(例如约每11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、30、42、 或49天或更多天)对人施用所述抗体，例如以维持剂量施用。参见例如Hillmen等(2004)N EnglJMed.350(6)：552-9及Dmytrijuk等(2008)TheOncologist13(9)：993。

在一些实施方案中，可以以约900mg(例如925、950、975、1000、1100、或1200mg或更 多)的剂量对人每周(任选持续两周或更多周(例如3、4、5、6、7、或8周或更多周))静脉内施 用抗-C5抗体(例如依库丽单抗)。在初始治疗后，可以以约1200mg的剂量对人约每14天(例 如约每11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、30、42、或49天或更多天)对人施用所述抗 体，例如以维持剂量施用。参见例如国际专利申请公开号WO2010/054403。

如本文所用，“长期施用”、“长期治疗”、“长期地治疗”或其类似的语法变化形式意 指这样的治疗方案，其用于将患者血液中的治疗剂维持在某个阈浓度，从而在患者中在延 长的时期完全地或基本地抑制全身性补体活性。因而，可以将用补体抑制剂长期治疗的患 者用抑制剂治疗大于或等于2周(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、或52周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月；或1、1.5、2、2.5、3、 3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、或12年或患者的剩余寿命)的时间 段，所述用抑制剂的治疗是以足以将患者血液中的抑制剂维持在抑制或基本抑制患者中全 身性补体活性的浓度的量和频率来进行的。在一些实施方案中，可以将补体抑制剂长期施 用于对其有需要的患者，所述施用是以有效维持血清溶血活性在小于或等于20％(例如19、 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5％)的量和频率进行的。参见例如Hill等 (2005)Blood106(7)：2559。在一些实施方案中，可以对患者以有效维持血清乳酸脱氢酶 (LDH)水平在LDH正常范围的至少20％(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或 5％)内的量和频率施用补体抑制剂。参见Hill等(2005)，同上文。在一些实施方案中，对患 者以有效维持血清LDH水平在小于550IU/L(例如小于540、530、520、510、500、490、480、470、 460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、 280IU/L、或小于270IU/L)的量和频率施用补体抑制剂。为了在患者中维持全身性补体抑 制，可以对患者长期施用补体抑制剂，例如每周一次、每两周一次、每周两次、每天一次、每 月一次、或每三周一次。

药物组合物可以包含治疗有效量的人补体成分C5抑制剂(例如抗-C5抗体或其抗 原结合片段)。本领域的一个普通技术人员能够部分基于所施用的抑制剂的效果、或所述抗 体和一个或多个额外活性剂的组合效果(如果使用了多于一个制剂)，而容易地确定此类有 效量。人补体成分C5的抑制剂(例如抗-C5抗体)的治疗有效量也可以根据如下因素而变化： 如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，以及抗体(及一个或多个额外的活性剂)在个体中 引发想要的响应的能力，例如至少一个条件参数的改善，例如至少一个aHUS症状的改善。例 如，治疗有效量的人补体成分C5抑制剂(例如抗-C5抗体)能抑制(降低其严重程度或清除其 发生)和/或预防血小板减少症、微血管病性溶血性贫血、肾衰竭、和/或本领域已知或本文 描述的aHUS症状的任一项。治疗有效量还可以是这样的量，其中组合物的任何毒性或有害 作用都不及治疗有益效果。

本文使用的术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或类似术语意在表示制剂(例如 人补体成分C5抑制剂)的量，所述量会引发想要的生物学或医学反应(例如一个或多个aHUS 症状的改善)。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有治疗有效量的人补体成分C5抑制 剂。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有治疗有效量的与补体成分C5蛋白结合的抗 体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，组合物含有两个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、 10、11个或更多个)不同的人补体成分C5抑制剂，从而该组合物以其总体是治疗上有效的。 例如，组合物可以含有与人C5蛋白结合的抗体和与编码人C5蛋白的mRNA结合并促进其降解 的siRNA，其中所述抗体和siRNA各自处于这样的浓度，在所述浓度处在其进行组合时是治 疗上有效的。在一些实施方案中，组合物含有所述抑制剂及一个或多个第二活性剂，从而该 组合物以其总体是治疗上有效的。例如，所述组合物可以含有与人C5蛋白结合的抗体以及 另一个对治疗或预防aHUS有用的制剂。

此类组合物的毒性和疗效可以通过已知的制药学程序在细胞培养物或实验动物 (aHUS的动物模型)中确定。这些程序可以用于例如确定LD₅₀(对于50％的群体致死的剂量) 和ED₅₀(对于50％的群体在治疗上有效的剂量)。毒性和治疗性效果剂量比是治疗指数，并且 其可以以比值LD₅₀/ED₅₀形式表达。表现出高治疗指数的组合物，或该组合物的抑制剂(例如 抗-C5抗体)是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的组合物，但应当小心设计递送系 统，其将此类化合物靶向至受影响组织的部位，并将对正常细胞的潜在损害降到最小，由此 降低副作用。

获取自细胞培养物测定法和动物研究的数据可用于配制用于在人中使用的剂量 范围。合适的aHUS动物模型是本领域已知的，并且描述于例如Atkinson等(2007)Journal ofExperimentalMedicine204(6)：1245-1248中。此类抑制剂的剂量通常在抑制剂(例如 抗-C5抗体或其抗原结合片段)的循环浓度的范围内，所述范围包括具有极少毒性或无毒性 的ED₅₀。所述剂量可以在这个范围内变化，其取决于所采用的剂型和使用的施用途径。对于 如本文所述使用(例如用于治疗或预防aHUS)的人补体成分C5抑制剂(例如抗-C5抗体)，首 先可以从细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。可以对剂量进行配制以在动物模型中达到 循环血浆浓度范围，所述范围包括IC₅₀(即达到对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)，如 细胞培养物中所确定的那样。这种信息可用于更精准地确定在人中有用的剂量。血浆水平 可以通过例如高效液相层析来测量。

在一些实施方案中，人补体成分C5抑制剂需要的剂量可以基于受试者血液中的人 C5蛋白浓度来确定。例如，具有较高浓度的循环人C5蛋白水平的受试者可能需要比具有较 低水平的循环人C5的受试者更高的人C5抑制剂剂量。用于在来自受试者的来源于血液的流 体样品中确定人补体成分C5浓度的方法是本领域已知的，且描述于例如Rawal等(1998)J BiolChem273(27)：16828-16835中。

在一些实施方案中，所述方法可以连同其他针对aHUS的治疗一起进行。例如，可以 在肾切除(例如双侧肾切除)、透析、血浆置换、或血浆输注的同时、之前、或之后将组合物施 用于受试者(参见例如Noris等(2005)“Non-shigatoxin-associatedhemolyticuremic syndrome.”In：ZipfelP(ed).ComplementandKidneyDisease.Basel：Birkhauser- Verlag，65-83)。

如本文所用，“受试者”可以是任何哺乳动物。例如，受试者可以是人、非人的灵长 类(例如猴、狒狒、或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、家兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠、或 小鼠。在一些实施方案中，受试者是幼体(例如人幼体)。

如本文所用，“需要预防的”、“需要治疗的”、或“对其有需要的”受试者意指这样的 受试者，通过适当的医疗人员(例如医生、护士、或护理人员(对人而言)；兽医(对非人的哺 乳动物而言))的判断，所述受试者会合理地受益于所提供的治疗(如用包含人补体成分C5 抑制剂的组合物治疗)。

如本文所用，“具有患上aHUS风险的”受试者是具有患上该种病症的一个或多个 (例如2、3、4、5、6、7、或8个或更多个)风险因素的受试者。aHUS的风险因素是医学领域公知 的，且包括：例如患上该种病况的素因，即该种病况的家族史或患上该种病况的遗传素因， 如例如补体因子H(CFH)、膜辅因子蛋白(MCP；CD46)、C4b结合蛋白、补体因子B(CFB)、或补体 因子I(CFI)中的一个或多个突变。参见例如Warwicker等(1998)KidneyInt53：836-844； Richards等(2001)AmJHumGenet68：485-490；Caprioli等(2001)AmSocNephrol12： 297-307；Neuman等(2003)JMedGenet40：676-681；Richards等(2006)ProcNatlAcad SciUSA100：12966-12971；Fremeaux-Bacchi等(2005)JAmSocNephrol17：2017-2025； Esparza-Gordillo等(2005)HumMolGenet14：703-712；GoicoecheadeJorge等(2007) ProcNatlAcadSciUSA104(1)：240-245；Blom等(2008)JImmunol180(9)：6385-91；及 Fremeaux-Bacchi等(2004)JMedicalGenet41：e84。还参见Kavanagh等(2006)，同上文。 风险因素还包括：例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)感染、怀孕、癌症、暴露于 抗癌剂(例如奎宁、丝裂霉素C、顺铂、或博来霉素)、暴露于免疫治疗剂(例如环孢霉素、 OKT3、或干扰素)、暴露于抗血小板剂(例如噻氯匹定或氯吡格雷)、HIV感染、移植、自身免疫 病、和联合的甲基丙二酸尿症及高胱氨酸尿症(cblC)。参见例如Constantinescu等(2004) AmJKidneyDis43：976-982；George(2003)CurrOpinHematol10：339-344； Gottschall等(1994)AmJHematol47：283-289；Valavaara等(1985)Cancer55：47-50； Miralbell等(1996)JClinOncol14：579-585；Dragon-Durey等(2005)JAmSocNephrol 16：555-63；和Becker等(2004)ClinInfectDis39：S267-S275。因此，具有患上aHUS的风 险的人可以是例如具有aHUS家族史的人和/或具有HIV感染的人。从上文可见，“具有患上 aHUS的风险的”受试者不是一个感兴趣种类内的所有受试者。

“疑患有aHUS的”受试者是具有该病况的一个或多个症状的受试者。这种病况的症 状是医学领域技术人员所熟知的，包括：例如严重高血压、蛋白尿、尿毒症、昏睡/疲乏、应激 性(irritability)、血小板减少症、微血管病性溶血性贫血、和肾功能损伤(例如急性肾衰 竭)。从上文段落可以明确看出，“疑患有aHUS的”受试者不是一个感兴趣种类内的所有受试 者。

aHUS可以是遗传性的、获得性的、或特发性的。当同一家族的两个或更多个(例如 3、4、5、或6个或更多个)成员相隔至少六个月被疾病影响且排除了暴露于常见诱发剂时，或 是当受试者中鉴定出了一个或多个aHUS相关基因突变(例如CFH、MCP/CD46、CFB、或CFI中的 一个或多个突变)时，可以考虑aHUS是遗传性的。例如，受试者可以患有CFH相关aHUS、CFB相 关aHUS、CFI相关aHUS、或MCP相关aHUS。多达30％的遗传性aHUS是与CFH中的突变相关的， 12％与MCP中的突变相关，5-10％与CFI中的突变相关，而低于2％与CFB中的突变相关。遗传 性aHUS可以是多重的(即家族的；两个或更多个受影响的家族成员)或单独的(即家族中的 单个发生)。当能鉴定出根本的环境因素(例如药物、系统性疾病、或不产生志贺样外毒素的 病毒或细菌媒介)时，可以考虑aHUS是获得性的。当没有明显的(遗传的或环境的)触发物 时，可以考虑aHUS是特发性的。

在一些实施方案中，所述方法可以包括将受试者鉴定为患有aHUS、疑患有aHUS、或 具有患上aHUS的风险的受试者。除使用本文所述的aHUS生物标志物概况分析外，还可以进 行实验室测试来确定人受试者是否患有血小板减少症、微血管病性溶血性贫血、或急性肾 功能不全。医学专业人员能根据如下项的一项或多项来诊断血小板减少症：(i)血小板计数 低于150,000/mm³(例如低于60,000/mm³)；(ii)血小板存活时间缩短，反映了循环中增强的 血小板破坏；及(iii)外周涂片中观察到巨大血小板，其与血小板生成的继发性激活是一致 的。医学专业人员能根据如下项的一项或多项来诊断微血管病性溶血性贫血：(i)血红蛋白 浓度低于10mg/dL(例如低于6.5mg/dL)；(ii)血清乳酸脱氢酶(LDH)浓度升高(＞460U/L)； (iii)高胆红素血、网状细胞过多症(reticulocytosis)、循环的游离血红蛋白、及触珠蛋白 浓度低或检测不到；及(iv)检测到碎片化的红细胞(裂红细胞)，其外周涂片中有锯齿形 (burr)或盔形(helmet)细胞的典型外表，并具有阴性的Coombs测试。参见例如Kaplan等 (1992)“HemolyticUremicSyndromeandThromboticThrombocytopenicPurpura，” InformaHealthCare(ISBN0824786637)及Zipfel(2005)“ComplementandKidney Disease，”Springer(ISBN3764371668)

C3和C4的血浓度也可用作补体激活或失调的测量。此外，还可以通过将受试者鉴 定为带有aHUS相关基因(如CFI、CFB、CFH、或MCP(同上))中的一个或多个突变，对受试者的 病况进行进一步表征。用于检测基因中的突变的合适方法包括，例如DNA测序和核酸阵列技 术。参见例如Breslin等(2006)ClinAmSocNephrol1：88-99及GoicoecheadeJorge等 (2007)ProcNatlAcadSciUSA104：240-245。

在一些实施方案中，可以将人补体成分C5抑制剂(例如抗-C5抗体或其抗原结合片 段)作为单一治疗施用于受试者。或者，如上文所述，该抑制剂可以与另一治疗(例如另一个 针对aHUS的治疗)作为组合治疗施用于受试者。例如，组合治疗可以包括对受试者(例如人 受试者)施用一个或多个额外的制剂(例如抗高血压剂)，所述额外的制剂对患有aHUS、或具 有患上aHUS的风险的受试者提供治疗益处。在一些实施方案中，人补体成分C5抑制剂和一 个或多个额外的活性剂在同时施用。在其他实施方案中，所述抑制剂在时间上第一个施用， 而所述一个或多个额外的活性剂在时间上第二个施用。在一些实施方案中，所述一个或多 个额外的活性剂在时间上第一个施用而所述抑制剂在时间上第二个施用。

人补体成分C5抑制剂可以替换或扩大既往或当前施用的治疗。例如，在用抗-C5抗 体或其抗原结合片段治疗时，一个或多个额外活性剂的施用可以终止或减少，例如以较低 的剂量施用。在一些实施方案中，可以维持既往治疗的施用。在一些实施方案中，维持既往 治疗直至人C5抑制剂水平达到足以提供治疗效果的水平。两种治疗可以组合施用。

如本文定义的，监测受试者(例如人患者)在aHUS方面的改善，意指评估受试者在 疾病参数方面的变化，例如疾病的一个或多个症状的改善。此类症状包括本文所述aHUS症 状的任一种。在一些实施方案中，评估在开始治疗后至少1小时、例如至少2、4、6、8、12、24、 或48小时、或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更多天、或至少1周、2周、4周、10周、13 周、20周或更多周进行。可以在一个或多个如下时期中评估受试者：开始治疗前；治疗过程 中；或在施用了治疗的一个或多个组分之后。评估可以包括评估对进一步治疗的需求，例如 评估是否应当改变剂量、施用频率、或治疗持续时间。其还可以包括评估对增加或减少所选 的治疗形式的需求，例如增加或减少本文所述的针对aHUS的治疗的任一种。

试剂盒

还提供包含对实施本文所述方法有用的各种试剂和材料的试剂盒。用于本文所述 的测量、诊断、评估和/或评价的程序可以由诊断性实验室、实验性实验室、或从业者个体进 行。本发明提供可用于任何或所有这些设置的试剂盒。

在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含用于(除其他之外)根据本文提供的方 法来表征或加工生物样品(例如生物流体)、测量生物标志物水平(例如蛋白或核酸水平)、 在受试者中诊断aHUS、或在受试者中监测治疗响应的材料和试剂。在一些实施方案中，本发 明的试剂盒包含至少一个或多个特异性检测一个或多个aHUS生物标志物蛋白(例如选自表 1的那些)的蛋白水平的试剂，以及任选地，用于使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以包 括例如本文所述的阵列的任一种。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括合适的对照样品(例如来自正常健康个体的 生物流体或包含已知对照量的具体目的分析物的溶液)。在一些实施方案中，本发明的试剂 盒可以包括用于根据本文所述一个或多个方法使用所述试剂盒的说明书，并可以包括用于 加工获取自受试者的生物样品(例如生物流体)和/或进行测试的说明书或用于解释结果的 说明书。

下文的实施例意在进行阐释，而非限制本发明。

实施例

为了更好地理解aHUS的病理学，发明人在用补体抑制剂(抗-C5抗体依库丽单抗) 治疗之前和在开始补体抑制剂治疗之后的一些时间点收集了来自患有aHUS或疑患有aHUS 的患者的生物流体(全血、血清、血浆、和尿液)的样品。本研究的一个目的在于定义一系列 能用于监测患者对补体抑制剂治疗的响应性的临床上可定义的参数以及疾病及其进展或 消除的标志物。发明人鉴定了一些蛋白，其表达和/或活性与aHUS疾病状态和/或aHUS患者 对补体抑制剂治疗的响应性相关。所述蛋白是涉及补体和/或细胞内皮活化、炎症、肾损伤、 和凝固或与之相关的蛋白(参见表1)。

对于这项研究，总计招募了41名确诊为aHUS的成人受试者(27名女性和12名男性) 以及正常健康成人志愿者。所有患者在筛选时基于如下特征的一个或多个确认了aHUS的诊 断：血小板计数低于150x10⁹/L；血红蛋白水平低于正常的下限；LDH水平大于或等于正常 上限的1.5倍；血清肌酐水平大于或等于正常的上限；且ADAMTS13活性水平大于5％。所有患 者测试为志贺毒素阴性。

招入之时的平均患者年龄为40.3岁。68％的患者为女性；2人(4.8％)是黑种人或 非裔美国人；1名患者(2.4％)是亚裔。6名患者(14.6％)报告有aHUS家族史。20人(48.7％) 具有至少一个鉴定出的补体调节蛋白突变或测试为自身抗体阳性，所述自身抗体结合至补 体调节蛋白。30名患者(73.2％)展现出第一次aHUS临床表现。6名患者(14％)直接启用依库 丽单抗而未使用血浆置换/输注(PE/PI)。24名患者(58.5％)在基线处(依库丽单抗治疗前) 在进行透析。9名患者(22％)既往经受过肾移植。27名患者(66％)的血小板计数低于 150x10⁹/L。32名患者(78％)的血清LDH水平大于正常的上限。这个群体中患者的平均触珠 蛋白(Hp)水平为0.6±0.4g/L；而这个患者群体中的平均血清肌酐水平为411±264.6μmol/ L(N＝40)。

在研究的招募阶段(治疗前)以及随后的治疗各次药物施用处收集生物流体。以如 下进度表对受试者施用依库丽单抗：每周一次900mg施用4周；1200mg作为第五剂；其后每两 周1200mg施用长达55周作为2期临床试验的一部分。

实施例1。材料与方法

尿液样品

将新收集的尿液立即与蛋白酶抑制剂混合。用市售的试剂盒如下文简述测量了收 集自受试者的尿液中一些分析物的浓度，所述分析物包括NGAL、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、 簇蛋白、TIMP-1、β2-微球蛋白、C5b9、C5a、和肌酐。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：DLCN20)在尿液中测 量NGAL水平。简言之，用试剂盒提供的校准稀释液RD5-24按照1∶3稀释尿液样品。一式两份 地将50μL的每种样品或试剂盒标准对照物(NS0表达的重组人脂笼蛋白-2)添加至测定平板 的孔，每个孔含有100μL的试剂盒提供的测定稀释液RD1-52。在冰箱中4℃温育两小时后，用 每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次。向每孔添加200μL的用酶(辣根过氧化物酶)标记的抗- NGAL缀合物并在冰箱中4℃温育两小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次并通过向每孔 添加200μL的试剂盒提供的TMB底物溶液(用于抗-NGAL缀合物的酶的底物)并在室温暗处温 育30分钟进行显色。TMB是一种用于辣根过氧化物酶的底物，其常用于ELISA中。ELISA孔中 底物和固定化的缀合至抗体的辣根过氧化物酶(HRP)之间的反应产生蓝色的溶液。在达到 想要的颜色强度后，通过添加终止液(酸性)来终止反应，其使溶液颜色从蓝色变为黄色。从 而，通过向每孔添加50μL试剂盒提供的终止液从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸 光度。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：DSCTC0)测量半胱氨 酸蛋白酶抑制剂C水平。简言之，用试剂盒提供的校准稀释液RD5-24按照1∶3稀释尿液样品。 一式两份地向测定平板的孔添加50μL的每种样品或试剂盒标准对照物(重组人CysC)，每个 孔含有100μL的试剂盒提供的测定稀释液RD1-52。在冰箱中4℃温育两小时后，用每孔200μL 的洗涤液将孔洗涤4次。向每孔添加200μL的用酶标记的抗-CysC缀合物并在冰箱中4℃温育 两小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次并通过向每孔添加200μL的试剂盒提供的TMB底 物溶液(用于抗-CysC缀合物的酶的底物)并在室温暗处温育30分钟进行显色。通过向每孔 添加50μL试剂盒提供的终止液从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：DCLU00)测量簇蛋白 水平。简言之，用试剂盒提供的校准稀释液RD5T按照1∶3稀释尿液样品。一式两份地将50μL 的每种样品或试剂盒标准对照物(重组人簇蛋白)添加至测定平板的孔，每个孔含有100μL 的试剂盒提供的测定稀释液RD1-19。在设定为500rpm的定轨摇床中室温温育两小时后，用 每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次。向每孔添加200μL的用酶标记的抗-簇蛋白缀合物并在设 定为500rpm的定轨摇床中室温温育两小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次并通过向每 孔添加200μL的TMB底物溶液并在室温暗处温育30分钟进行显色。通过向每孔添加50μL终止 液从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：DTM100)测量TIMP-1 水平。简言之，用试剂盒提供的校准稀释液RD5P按照1∶2稀释尿液样品。一式两份地将50μL 的每种样品或试剂盒标准对照物(重组人TIMP-1)添加至测定平板的孔，每个孔含有100μL 的试剂盒提供的测定稀释液RD1X。在设定为500rpm的定轨摇床中室温温育两小时后，用每 孔200μL的洗涤液将孔洗涤3次。向每孔添加200μL的用酶标记的抗-TIMP-1缀合物并在设定 为500rpm的定轨摇床中室温温育两小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤4次并通过向每孔 添加200μL的TMB底物溶液并在室温暗处温育30分钟进行显色。通过向每孔添加50μL终止液 从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：DBM200)测量β2M水 平。简言之，用试剂盒提供的样品稀释液按照1∶10稀释尿液样品。一式两份地将20μL的每种 样品、试剂盒对照物、或试剂盒标准物添加至孔，每个孔含有100μL的含有用酶标记的抗-β 2M缀合物的溶液。在室温温育1小时后，用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤6次。通过向每孔添 加100μL的TMB底物溶液并在室温暗处温育15分钟进行显色。通过向每孔添加100μL终止液 从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用市售的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN；产品编号：KGE005)测量肌酐水 平。简言之，用水按1∶20稀释尿液样品，并一式两份地将50μL的样品、试剂盒对照物或试剂 盒标准物添加至孔，其含有100μL的试剂盒提供的碱性苦味酸盐溶液。室温温育30分钟后， 在490nm处测量吸光度。

用市售的试剂盒(BDBiosciences，SanJose，CA；产品编号：558315)和optEIA试 剂套组B(BDBiosciences，SanJose，CA；产品编号：550534)测量C5b-9水平。简言之，将抗- C5b-9捕获抗体按1∶250稀释于包被缓冲液中，将其的100μL添加至96孔Maxisorp板(Nunc； 产品编号：439454)的每个孔并在冰箱中4℃温育过夜。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤3次 并通过向每孔添加200μL试剂盒提供的测定稀释液将其在室温封闭1小时。用每孔200μL的 洗涤液将孔洗涤3次并一式两份地向孔添加100μL的尿样品或试剂盒标准物。在室温温育2 小时后，用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤3次。将100μL试剂盒提供的C5b-9工作检测抗体溶 液添加至每个孔并室温温育1小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤7次，并通过向每孔添加 100μL的TMB底物溶液并在室温暗处温育30分钟进行显色。通过向每孔添加50μL终止液从而 在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用市售的试剂盒(BDBiosciences，SanJose，CA；产品编号：557965)测量C5a水 平。简言之，一式两份地向含有50μL试剂盒提供的ELISA稀释液的孔添加100μL的尿样品或 试剂盒标准物。在室温温育2小时后，用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤5次。将100μL试剂盒提 供的C5a工作检测抗体溶液添加至每个孔并室温温育1小时。用每孔200μL的洗涤液将孔洗 涤7次，并通过向每孔添加100μL的TMB底物溶液并在室温暗处温育30分钟进行显色。通过向 每孔添加50μL终止液从而在温育后终止反应，并在450nm处读取吸光度。

血浆

如下文所述制备血浆样品。将血液采集于含有EDTA的10mLBD^TMP100管(Becton Dickinson)中。在不晚于采集后60分钟在冷冻离心机(设定维持在4-8℃)中将全血以 3000rpm离心10分钟。然后在离心后从样品获取血浆。弃去发生溶血的样品。

如下文简述，用市售的试剂盒测量了采集自受试者血液的血浆级分中一些分析物 的浓度，所述分析物包括：Ba、凝血酶原片段1+2、凝血调节蛋白、vWF、sC5b-9、和C5a。

用市售的试剂盒(Quidel，SanDiego，CA；产品编号：A033)测量Ba水平。简言之，用 洗涤液将测定平板的孔洗涤3次。用试剂盒提供的标本稀释液将血浆样品按1∶1000稀释，并 一式两份地将100μL稀释的血浆样品、试剂盒对照物和标准物添加至孔。室温温育60分钟 后，用每孔200μL的洗涤液将孔洗涤5次。将100μL用酶标记的抗-Ba抗体缀合物添加至每个 孔并在室温温育60分钟。在用洗涤液洗涤5次后，向每个孔添加100μL的TMB底物并在避光条 件下室温温育15分钟。通过向每孔添加100μL终止液来终止反应，并在450nm处读取吸光度。

用EnzygnostF1+2试剂盒(SiemensHealthcare；产品编号：OPBD03)测量凝血酶 原片段1+2水平。简言之，用样品缓冲液将血浆样品按1∶2稀释，并将50μL稀释的样品、或标 准物(含有已知浓度的重组人凝血酶原片段1+2)添加至孔。37℃温育30分钟后，用每孔200μ L的洗涤液将孔洗涤3次。将100μL用酶标记的抗-凝血酶原片段1+2抗体缀合物添加至每个 孔并在37℃温育15分钟。在3次另外的洗涤后，向每个孔添加100μL的生色团底物并在避光 条件下室温温育15分钟。通过向每孔添加100μL终止液来终止反应，并在450nm处读取吸光 度。

用TMELISA试剂盒(AmericanDiagnostica，Stamford，CT；产品编号：837)来评估 EDTA血浆中凝血调节蛋白(TM)的水平。简言之，用样品缓冲液按1∶4稀释血浆样品，并将200 μL经稀释的样品或标准物(含有已知浓度的重组TM)添加至孔。在室温温育60分钟后，用200 μL/孔的洗涤液将测定平板的孔洗涤4次。添加用酶标记的抗-TM抗体的溶液(每孔200μL)并 在室温温育30分钟。洗涤4次后，向每个孔添加200μL的底物并在避光条件下将孔室温温育 20分钟。用100μL的0.5MH₂SO₄来终止反应，并在450nm处读取吸光度。

利用特异性针对vWF胶原蛋白结合位点的捕获抗体(AmericanDiagnostica；产品 编号：885)，通过ELISA试剂盒来确定EDTA血浆中的冯维勒布兰德因子(vWF)活性水平。用测 定稀释液按1∶20来稀释血浆样品和试剂盒对照物，并一式两份将100μL经稀释的样品和对 照物添加至孔。在室温温育60分钟后，用洗涤液将孔洗涤5次，并向每个孔添加100μL用酶标 记的抗-vWF缀合物。在室温将孔温育15分钟并用洗涤液洗涤5次。向每个孔添加100μL的TMB 底物(其在被酶切割时产生可检测的信号)。在避光条件下将孔室温温育15分钟，然后向每 个孔添加100μL试剂盒提供的终止液。在添加终止液30分钟内在450nm处读取吸光度。

用人C5b-9ELISA套组(BDBiosciences，SanDiego，CA；产品编号：558315)和BD optEIA试剂套组B(BDBiosciences；产品编号：550534)来确定sC5b-9的循环水平。简言之， 将抗-C5b-9捕获抗体按1∶250稀释于试剂盒提供的包被缓冲液中，将其的100μL添加至96孔 Maxisorp板(Nunc)的孔并在4℃温育过夜。在洗涤液中洗涤3次后，用200μL试剂盒提供的测 定稀释液将孔在室温封闭1小时。用洗涤液再洗涤3次后，添加100μL的血浆样品(按1∶100稀 释于测定稀释液中)或标准物(含有已知浓度的经纯化的sC5b-9)，并在室温温育2小时。用 洗涤液将孔洗涤3次，并将100μL的工作检测液(其含有用生物素标记的抗-C5b-9检测抗体 和用链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶，按1∶250稀释于测定稀释液中)添加至每个孔。室 温温育1小时后，用洗涤液将孔洗涤7次，并向每孔添加100μL的底物TMB溶液。在避光条件下 于室温对反应显色30分钟。在向每孔添加50μL终止液后，在450nm处确定吸光度。

利用BDoptEIA试剂套组B(BDBiosciences；产品编号：550534)，用夹心ELISA来 确定C5a的循环水平。所有温育都在存在futhan(BDBiosciences；产品编号：550236)的条 件下进行。简言之，将抗-C5a捕获抗体在试剂盒提供的包被缓冲液中稀释至2μg/mL，将其的 100μL添加至96孔maxisorp板(Nunc)的孔，然后在4℃温育过夜。在洗涤液中洗涤3次后，用 200μL测定稀释液将孔在室温封闭1小时。用洗涤液再洗涤3次后，添加50μL的血浆样品(按1 ∶5稀释于测定稀释液中)或标准物(含有已知浓度的C5a)，并在室温温育1小时。用洗涤液将 孔洗涤4次，并将100μL的工作检测液添加至每个孔(其含有用生物素标记的抗-C5a检测抗 体和用链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶，按1∶250稀释于测定稀释液中)。室温温育1小时 后，用洗涤液将孔洗涤7次，并向每孔添加100μL的底物TMB溶液。在避光条件下于室温对反 应显色30分钟。在向每孔添加50μL终止液后，在450nm处确定吸光度。

血清

按下文所述加工血清样品。将血液采集于10mLVacutainer血清分离管(SST)中。 将管颠倒5次并允许血液在室温凝结至少30分钟，但不超过2小时。开着制动器以1800rcf 对管进行离心。弃去发生溶血的样品。

用人细胞术珠阵列(CytometricBeadArray，CBA)Flex套组试剂盒(CBAFlex Set；BectonDickinsonBiosciences，SanDiego，CA)对血清中多个分析物进行定量确定， 并通过流式细胞仪(FACSLSRII，BectonDickinson)根据制造商的说明来获得。Flex套组 捕获珠是具有独特荧光强度的单一珠群体并且包被有特异性针对可溶蛋白的捕获抗体。为 每个珠群体分配一个字母数字位置名称，表示其在BDCBAFlexSet系统中相对于其他珠 的位置。可以将具有不同位置的珠在测定法中进行组合，以生成多重测定法。在FlexSet测 定法中，将捕获珠、PE缀合的检测试剂、和标准物或测试样品一起温育以形成夹心复合体。

简言之，将每个分析物的标准物混合，并用测定稀释液进行连续稀释。制备用于每 个分析物的捕获珠，并以用于血清/血浆的捕获珠稀释液来将其合并。适当稀释血清样品并 连同标准物一起与混合的捕获珠以100μL的总体积室温温育1小时。混合检测藻红蛋白(PE) 试剂用于所有分析物，并添加至管(50μL)。在暗处室温温育2小时后用洗涤缓冲液洗涤样 品，并在沉淀物于洗涤缓冲液中重建后通过流式细胞仪来获取样品。

将1∶4稀释于试剂盒提供的测定稀释液中的血清样品与如下珠套组一起温育(其 中指定的生物标志物蛋白表示与珠缀合的捕获抗体)：IFN-γ(珠E7；产品编号：558283)； IL-12p70(珠E5；产品编号：558283)；IL-1β(珠B4；产品编号：558279)；IL-6(珠A7；产品编 号：558276)；IL-8(珠A9；产品编号：558277)；CXCL-9(珠E8；产品编号：558286)；CXCL-10(珠 B5；产品编号：558280)；MCP-1(珠D8；产品编号：558287)；VEGF(珠B8；产品编号：558336)；和 sCD40L(珠C7；产品编号：560305)。将如下珠套组与按1∶50稀释于试剂盒提供的稀释液中的 血清样品一起温育：ICAM-1(珠A4；产品编号：560269)；VCAM-1(珠D6；产品编号：560427)； TNFR1(珠C4；产品编号：560156)；E-选择蛋白(珠D9；产品编号：560419)；P-选择蛋白(珠D7； 产品编号：560426)；和CCL5(珠D4；产品编号：558324)

实施例2：结果

进行中的补体活化标志物

如下表2概括的，相对于来自健康志愿者的生物流体样品中的浓度，大多数aHUS患 者中补体成分Ba和sC5b9的血浆浓度以及C5a和sC5b-9的尿浓度是上升的。也参见图1。

表2

aHUS生物标志物蛋白 基线处升高的n/N(％) P-值 血浆Ba 35/35(100.0) ＜0.0001 血浆sC5b-9 37/38(97.4) ＜0.0001 尿C5a 26/29(89.7) 0.0007 尿sC5b-9 23/27(85.2) 0.0025

*“N”表示对其评估了给定生物标志物的患者总数，而“n”表示具有升高的生物标 志物蛋白水平的那些“N”患者的数目。

这些结果表明aHUS患者中正在进行显著的系统性旁路途径补体活化。

在用依库丽单抗治疗后，这些aHUS生物标志物的平均水平(浓度)是降低的(图1A- C)。尿C5a和sC5b-9的平均浓度在开始治疗后1-2.5周是显著降低的，并维持如此。尿C5a水 平的平均百分比降低在治疗后第3周为大于40％，且到第6周超过70％(图1D)。尿sC5b-9水 平到第3周降低了超过60％(图1E)。这些标志物最终正常化。血浆Ba水平在用依库丽单抗治 疗后4-6周左右也显著降低(p＝0.0053)，说明依库丽单抗随时间降低经典补体途径的起始 或放大(图1C)。然而，血浆Ba水平的平均百分比降低在第6周时约为10％，而到第12周超过 30％(图1F)。

经治疗的aHUS患者随时间经历了正常化的补体生物标志物蛋白水平的百分比示 于图2A-C中。例如，如图2B中所示，50％的经治疗的aHUS患者到开始用依库丽单抗治疗后 2.5周表现出正常化的尿sC5b-9水平。到开始治疗后17周，79％的经治疗的aHUS患者表现出 正常化的sC5b-9水平。然而，大多数患者中的Ba水平没有标准化(图1C和2C)。这些数据表明 即使用依库丽单抗来治疗，在一些患者中的进行中的补体活化也是低水平的。

血小板和止血激活的标志物

如下表3中所概括的，相对于来自健康志愿者的生物流体样品中的浓度，大多数 aHUS患者中sCD40L的血清浓度和凝血酶原片段1+2及D-二聚体的血浆水平是显著升高的。 也参见图3A-B。

表3

aHUS生物标志物蛋白 在基线处升高的n/N(％) P-值 sCD40L 36/38(94.7) ＜0.0001 凝血酶原片段F1+2 36/38(94.7) ＜0.0001 D-二聚体 34/36(94.4) ＝0.0002

*“N”表示对其评估了给定生物标志物的患者总数，而“n”表示具有升高的生物标 志物蛋白水平的那些“N”患者的数目。

sCD40L的释放通常与血小板代谢和活性有关。凝血酶原片段F1+2在凝血酶原转变 为凝血酶的过程中产生，而D-二聚体是指征纤维蛋白溶解的纤维蛋白降解产物。

在用依库丽单抗治疗后，这些aHUS生物标志物的平均水平(浓度)是降低的。F1+2 和D-二聚体血浆水平的平均水平在开始治疗后1-2.5周是显著降低的(p分别为＝0.0078和 0.0083)，并保持如此。如图3C中所示，F1+2的平均百分比降低到第3周约为15％，而到第12 周超过50％。D-二聚体水平的平均百分比降低在第6周时约为40％，但到第12周超过60％。 这些数据表明依库丽单抗治疗对凝固和纤维蛋白溶解途径具有立即的效果。如图4A-B中所 示，32％的经治疗的aHUS患者到开始治疗后第26周表现出F1+2水平正常化，而46％的患者 具有正常化的D-二聚体水平。相比之下，sCD40L水平在整个研究过程都是保持升高的。

内皮细胞损伤和/或活化的标志物

如下表4中所概括的，相对于来自健康志愿者的生物流体样品中的浓度，在aHUS患 者中凝血调节蛋白和vWF的血浆浓度和VCAM-1的血清浓度是显著升高的。也参见图5A-C。

表4

aHUS生物标志物蛋白 在基线处升高的n/N(％) P值 凝血调节蛋白 33/34(97.1) ＜0.0001 VCAM-1 36/38(94.7) ＜0.0001 冯维勒布兰德因子抗原 15/38(39.5) ＜0.02

*“N”表示对其评估了给定生物标志物的患者总数，而“n”表示具有升高的生物标 志物蛋白水平的那些“N”患者的数目。n.s.表示不显著。

aHUS患者的生物流体中高浓度的凝血调节蛋白和VCAM-1表示显著的内皮细胞活 化。凝血调节蛋白响应于C3a而释放，这进一步凸显了aHUS患者中正在进行的补体活化。vWF 浓度也是显著升高的。vWF具有一些生理作用，包括血小板粘附和凝固，并且还是内皮损伤 和活化的标志物。

在用依库丽单抗治疗后，这些aHUS生物标志物的平均水平(浓度)是降低的(图5A- C)。凝血调节蛋白和VCAM-1的平均水平自基线到开始治疗后第17周是显著降低的(p分别为 ＝0.0007和＜0.0001)(参见图6C和6D)。到第26周，VCAM-1和vWF的水平也已降低。然而，虽 然到开始治疗后第17周约70％的经治疗的aHUS患者中vWF正常化(图6B)，但凝血调节蛋白 和VCAM-1水平保持为升高的。有趣的是，10％的具有正常化凝血调节蛋白水平的患者(图 6A)中，仅有一名患者具有正常化的凝血调节蛋白和vWF水平二者。这些数据说明依库丽单 抗治疗对于纠正内皮细胞损伤和活化而言具有快速而强劲的积极效果。

炎症标志物

表5(下文)示出了一系列血浆和/或血清中检测到的分析物并说明了aHUS患者的 百分比，所述aHUS患者中各分析物在用补体抑制剂治疗前是升高的。

表5

aHUS生物标志物蛋白 在基线处升高的n/N(％) P值 血清CXCL10 23/38(60.5) P＜0.0001 血清CXCL9 33/38(86.8) P＜0.0001 IL-18 19/38(50.0) P＜0.0001 MCP-1 34/38(89.5) P＜0.0001 TNFR1 38/38(100.0) P＜0.0001 VEGF 25/38(65.8) P＜0.0001 IL-6 21/34(61.8) P＝0.0019 CCL5 4/38(10.5) P＝0.0045 IFN-γ 5/34(14.7) P＝0.0353 IL-8 22/38(57.9) n.s.(P＝0.0640) ICAM-1 2/34(5.9) n.s IL-1β 1/38(2.6) n.s IL-12 p70 2/34(5.9) n.s

*“N”表示对其评估了给定生物标志物的患者总数，而“n”表示具有升高的生物标 志物蛋白水平的那些“N”患者的数目。

**标有“血清”的两个分析物的浓度是在血清中测得的。表里所有其他分析物的浓 度是在血浆中测得的。n.s.表示不显著。

在用依库丽单抗治疗前，aHUS患者具有升高水平的循环炎性细胞因子和趋化因 子，包括，例如CXCL-10、CXCL-9、IL-18、TNFR1、MCP-1、VEGF、IL-6、和IL-8。然而，在开始治疗 后，TNFR1是最早显著降低的炎性标志物(到第6周，p＝0.0012)(图7A)。在所有后续随访处， TNFR1的平均浓度保持在比基线显著更低，但仅在6％的aHUS患者中正常化(图7B)。类似地， CXCL10的平均水平到第26周是显著降低的，但并未在所有aHUS患者中都正常化(31％的患 者未正常化)。到第26周，IFN-γ的平均水平在约50％的患者中正常化；然而，与正常对照相 比，血清IL-8(p＝0.01)、CXCL-9(p＝0.01)、IL-18(p＜0.0001)和VEGF(p＜0.0001)的平均 水平在大多数aHUS患者中保持为升高的，并且与基线没有显著差异。血清IL-6自基线在第 26周时是显著降低的(p＝0.04)，并且与正常对照相比在第26周时保持为升高的。

相比之下，CCL-5的平均水平到开始治疗后第17周及其后是显著升高的(在第12- 17周和第26周，p分别为0.0072和0.0021)。在小鼠中CCL5响应于血管损伤而上调，其促进选 择性T细胞浸润，作为血管伤口愈合响应的一部分。参见例如Rookmaaker等(2007)AmJ PhysiolRenalPhysiol293(2)：F624-630。这些数据说明依库丽单抗治疗在许多aHUS患 者中对于炎症而言具有快速而强劲的积极效果，但在这些患者中可能存在低水平的炎症， 即使在治疗期间。

肾小管和肾小球损伤标志物

表6A(下文)示出了采集自患者的尿液中检测到的一系列分析物，并示出了aHUS患 者的百分比，所述aHUS患者中各分析物在用补体抑制剂治疗前是升高的。

表6A

生物标志物 在基线处升高的n/N(％) P值 β-2微球蛋白(β2M) 20/28(71.4) P＜0.0001 簇蛋白 24/29(82.8) P＜0.0001 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 18/29(62.1) P＝0.0002 TIMP-1 22/29(75.9) P＝0.0003 FABP-1 22/29(75.9) P＝0.0130 NGAL 5/29(17.2) P＝0.0151 NAG 3/23(13.0) P＝0.0413 CXCL10 2/29(6.9) n.s. CXCL9 2/29(6.9) n.s. KIM-1 2/29(6.9) n.s.

*“N”表示对其评估了给定生物标志物的患者总数，而“n”表示具有升高的生物标 志物蛋白水平的那些“N”患者的数目。n.s.表示不显著。

在用依库丽单抗治疗前，通常被肾滤过的低分子量分子在aHUS患者尿液中是升高 的，所述分子包括β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、和NAG。肾小管上皮细胞响应于损 伤而产生的分子也是升高的，如TIMP-1、NGAL和L-FABP。然而，在用依库丽单抗治疗后，CysC (p＝0.0012)(图8A)、簇蛋白(p＝0.0446)、和TIMP-1(p＝0.0353)到开始治疗后1-2.5周是 显著降低的，并且它们在整个研究期间都保持为显著降低的。NGAL(p＝0.0003)(图8C)、L- FABP(p＝0.0366)、和NAG(p＝0.0369)从基线到开始治疗后4-6周是显著降低的，并随后保 持如此。β2M在12-17周(p＝0.0008)以及之后是显著降低的(图8B)。到第26周，所有分析物 的平均尿水平在经治疗的aHUS患者中都已正常化。

这些数据说明依库丽单抗治疗对于纠正许多aHUS患者所经受的肾小管和肾小球 损伤而言具有快速、强劲且持久的积极效果。

总结

下表提供了示例性的aHUS生物标志物的概述(虽然不是穷尽清单)，该aHUS生物标 志物在用依库丽单抗治疗前在aHUS患者中是升高的，但在用依库丽单抗治疗后是显著降低 的。该表(表6B)中还提供了开始用依库丽单抗治疗后aHUS生物标志物发生显著降低的平均 时间。

表6B

接受透析和/或接受肾移植的aHUS患者中的基线aHUS标志物水平

还评估了在用依库丽单抗治疗前接受了透析的aHUS患者中血浆和尿液补体、炎 症、和肾损伤标志物的浓度。如表7(下文)中所示，经历重复透析(例如治疗前6个月内两次 或更多次)的aHUS患者中的血清TNFR1、血浆Ba、C5b9、凝血酶原片段1+2、β2M、簇蛋白、 sC5b9、TIMP-1、NGAL、CysC、和C5a平均浓度与招入本研究前未经历重复透析的aHUS患者相 比是显著升高的(治疗前)。也参见图9A-E。

表7

分析物 有重复透析的较高 57 -->TNFR1(血清) p＝＜0.0001 β2m(尿) p＝0.0009 簇蛋白(尿) p＝0.0020 Ba(血浆) p＝0.0021 C5b-9(尿) p＝0.0042 TIMP-1(尿) p＝0.0070 NGAL(尿) p＝0.0110 CysC(尿) p＝0.020 F1+2(血浆) p＝0.0191 C5b-9(血浆) p＝0.0476 C5a(尿) p＝0.0477

**标有“血清”的一个分析物的浓度是在血清中测得的。标有“尿”的分析物的浓度 是在尿液中测得的，而标有“血浆”的分析物的浓度是在获取自患者的血浆中测得的。

此外，在用依库丽单抗治疗前接受过肾移植的aHUS患者与未接受过肾移植的患者 相比在基线处具有较低的尿C5b-9和尿FABP-1。

对应于(vis-à-vis)TMA标志物的基线aHUS标志物水平

一些患者中的一些aHUS相关生物标志物水平与异常的血栓形成性微血管病(TMA) 标志物相关，如降低的血小板计数、升高的LDH、以及升高的触珠蛋白水平。例如，在基线处 具有降低的血小板计数(每微升血液＜150,000)的aHUS患者表现出升高的尿半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C(P＝0.0276)和尿簇蛋白(P＝0.0401)水平。参见图14A-B。具有升高的LDH水平的 aHUS患者表现出升高的VCAM-1(P＝0.0226)(图14C)、D-二聚体(P＝0.0369)(图14D)、IL- 18、凝血调节蛋白、和TNFR1(见下文)水平。升高的触珠蛋白水平往往存在于具有升高的IL- 18水平的aHUS患者中。

接受血浆治疗的aHUS患者中的基线aHUS标志物水平

在用依库丽单抗治疗前接受过重复血浆治疗的aHUS患者在基线处表现出较高的 尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C平均水平(参见图15)。

生物标志物水平和临床参数之间的相关性

血小板

升高的CCL5水平与较高的血小板计数在基线处是正相关的(p＝＜0.0001；cc(相 关系数)＝0.8106)。升高的sCD40L水平与较高的血小板计数在基线处也是相关的(p＝＜ 0.001；cc＝0.6313)。

此外，在用依库丽单抗治疗后具有正常化的Ba水平的患者显示出比治疗后Ba水平 维持升高的患者显著更高的血小板增多。参见图13.

估算的肾小球滤过率(eGFR)、LDH和尿补体

还观察到了升高的血浆Ba水平和降低的eGFR之间的相关性(p＜0.0001；cc＝- 0.7219)。治疗前aHUS患者血清中TNFR1升高的浓度与乳酸脱氢酶(LDH)水平是相关的(p＝ 0.027；cc＝0.3586)，但与较低的eGFR是更为显著相关的(p＜0.0001；cc＝-0.6134)。此外， 较高的尿补体成分C5a和sC5b-9以及肾损伤标志物(β2M、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、 NGAL、和TIMP-1)水平与较低的eGFR是中等相关的(p＝0.0002至0.0242；cc＝-0.4286至- 0.6714)。

升高的尿sC5b-9、簇蛋白、和TIMP-1水平与蛋白尿是适度相关的(p＝0.0086至 0.0284；cc＝0.40至0.4788)，而升高的血浆Ba水平(p＝0.0017；cc＝0.517)、β2M、簇蛋白、 尿sC5b-9、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与患者尿液中升高的肌酐在用依库丽单抗治疗前是 相关的(p＝0.0440-0.0018；cc＝0.3982-0.6457)。

aHUS的第一次临床发作

还观察到经历其第一次aHUS表现的患者与基线处(依库丽单抗治疗前)显著升高 的血浆D-二聚体水平或尿FABP-1的相关性(参见表8)。

表8

郁积疾病(SmolderingDisease)

6名本项研究中的aHUS患者在招入之时显示出正常化的血液学参数(包括触珠蛋 白、LDH、和血小板水平)。然而，虽然临床表现稳定，这些患者仍然显示出慢性炎症和补体活 化的迹象。患者具有显著升高的血清TNFR1水平(如图10A所示)以及显著升高的凝血调节蛋 白、Ba(图10B)、凝血酶原片段1+2(图10E)、VCAM-1(图10C)、和D-二聚体(图10D)水平。类似 地，在基线处具有正常血小板水平(＞150x10⁹血小板/μL)的患者仍然显示出升高的大多数 生物标志物(例如Ba(图10F)、VCAM-1(图10G)、D-二聚体(图10H)、和F1+2(图10I))水平。总 的看来，这些发现表明了即使对于被认为治疗后处于临床缓解中的aHUS患者亚组而言，也 可能有正在进行的低水平补体活性、凝血病、和炎症。

生物标志物水平和临床结局之间的相关性

血液学响应

具有完全血液学响应的患者显示出在TNFR1、尿簇蛋白、和尿补体水平(C5a和C5b- 9)方面更大幅的降低(图11)。例如，86％的显示出这些aHUS生物标志物蛋白降低的浓度的 患者到用开始依库丽单抗治疗后12-17周达到了完全血液学响应(血小板和LDH的正常化)。 此外，这些患者比未达到完全血液学响应的患者显示出更大的平均血清TNFR1、尿簇蛋白、 尿C5a、和尿C5b-9百分比降低。

还观察到TNFR1降低(例如到第12周与第17周或之后相比)的迅速程度与完全血液 学响应相关(p＝0.0008)。D-二聚体的标准化速率与完全血液学响应显著相关(p＝0.0109； cc＝6.26)。

此外，数据显示在具有正常化血浆Ba浓度的(分别在第12-17周和第26周)、依库丽 单抗治疗的aHUS患者中，在第12-17周(p＝0.0022)和第26周(p＝0.0110)达到了血小板计 数显著更大的增加。血小板的改善也与第4-6周(P＝0.0148；cc＝-0.4087)和第12-17周(P ＝0.0073；cc＝-0.4396)平均F1+2水平的显著降低相关，并且更加适度地与第12-17周(P＝ 0.0470；cc＝-0.3381)的D-二聚体水平降低相关。但是，一个亚组的患者尽管在第4至26周 表现出较大的血小板计数增加，但继续表现出显著升高的凝血酶原片段1+2、凝血调节蛋 白、尿β2M、簇蛋白、TIMP-1、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平，说明根本疾病的活动尚在进 行。

对采集自本研究的数据的分析还揭示了其他生物标志物蛋白浓度变化与血小板 恢复之间的相关性。例如，依库丽单抗治疗的患者中CCL5、MCP-1、和sCD40L的浓度与增加的 血小板计数是正相关的，如下表9所示。

表9

血栓形成性微血管病(TMA)

具有血浆Ba水平的较大降低的、依库丽单抗治疗的aHUS患者更频繁地达到完全 TMA响应(例如血液学参数(例如血小板计数和LDH水平)的正常化和肾功能的保持)。例如， 72.7％的患者到第12-17周达到完全TMA响应，而85.29％的患者到第26周达到完全TMA响 应。如图12中所示，这些患者在血浆Ba浓度方面显示出比未达到完全TMA响应的患者更大的 平均百分比降低(分别为p＝0.0018和p＝0.006)。

治疗后eGFR

还观察到了一些生物标志物的降低和/或正常化与eGFR的改善之间的相关性。例 如，在具有正常化的MCP-1、IL-6、和IFN-γ(在第4-6周)；正常化的VCAM-1、CXCL10、CXCL9、 和Ba(在第12-17周)、和正常化的Ba、尿β2M、尿CysC、vWF、D-二聚体、簇蛋白、CXCL10、CXCL9、 尿FABP-1、和其他(在第26周)(表10)的患者中观察到了eGFR的显著更大的改善(表10)(例 如eGFR≥15mL/min/1.73m²维持至少两次连续测量，以至少4周为间隔获取)。也参见图16。

表10

实施例3：aHUS患者中选择的aHUS生物标志物蛋白的基线水平

在基线处，在依库丽单抗治疗前，在aHUS患者中观察到了显著的补体活化、血管炎 症/损伤、和器官损伤的实质迹象，不管使用血浆置换/血浆输注或血小板计数、Hp或LDH的 正常实验室值。如表11中所示数据证明的，aHUS患者中补体活性、血管炎症、内皮活化和损 伤、凝血(coagulation)、和肾损伤的aHUS生物标志物的浓度与健康受试者相比是显著升高 的。

表11

NHV意指表中所记载的给定的aHUS生物标志物蛋白的正常人的值或浓度。

“creat”意指肌酐，其浓度用于将表中记载的一些生物标志物浓度标准化。CAP意 指补体的旁路途径(见上文)。

“BL”意指“基线”，即用依库丽单抗治疗前。

“N”是对其分析了给定疾病过程和生物标志物的患者总数。“n”是具有升高的给定 生物标志物的“N”患者的数目。

“U”表示分析物是在尿液中测得的。

*P值是用Wilcoxon秩和检验来计算的，其检验组间的差异。

此外，发明人观察到，与未接受血浆置换(PE)或血浆输注(PI)治疗的患者中aHUS 生物标志物的升高水平相比，在接受过或正在接受PE或PI治疗的患者中观察到的基线升高 的一些aHUS生物标志物水平之间没有统计学显著性。例如，接受过PE/PI治疗的患者中Ba、 sTNFR1、sVCAM-1、和D-二聚体的浓度没有降低或正常化(图17A-D)。须注意，图17A-D中呈现 的数据里分析的26名患者仅有3名未接受PE/PI。大多数患者(n＝23)与正常健康志愿者相 比具有升高的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种肾损伤标志物 (肾小球损伤)，未接受PE/PI的患者可能其肾脏的损伤较低并因此在其尿液中具有降低的 肾损伤相关生物标志物蛋白水平。

类似地，在基线处，依库丽单抗治疗之前，具有正常血小板计数的aHUS患者中补体 活化(例如Ba)、炎症(例如sTNFR1)、内皮细胞活化(sVCAM-1)、凝血(D-二聚体)、和肾损伤 (半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C)的蛋白标志物的浓度是升高的。参见图18A-E。并且具有正常Hp 和LDH水平的患者显示出正在进行的补体活化、炎症、内皮细胞活化、凝血和肾损伤迹象(参 见图19A-E)。

考虑到上述结果，与正常健康受试者相比，aHUS患者中反映补体活性、血管炎症、 内皮活化和损伤、凝血及肾损伤的生物标志物浓度是长期升高的。正在接受PE/PI的aHUS患 者显示出显著正在进行的补体活化、血管炎症、内皮活化、凝血和肾损伤的明显迹象。虽然 PE/PI可能在一些患者中短时地维持正常血小板计数和LDH，但上述结果证明根本的补体失 调和TMA过程仍在持续。尽管血小板计数、LDH和Hp是正常实验室值，但这些研究指示了aHUS 患者中存在显著的正在进行的补体活化、血管炎症、内皮活化、凝血和肾损伤。

实施例4：持续依库丽单抗治疗对aHUS生物标志物浓度的影响

发明人观察到，持续的依库丽单抗治疗在aHUS患者中抑制长期升高的补体活化和 末端补体介导的肾损伤，并降低炎症、内皮损伤和血栓形成风险。例如，持续的依库丽单抗 治疗快速而彻底地抑制末端补体活化，如C5a和sC5b-9(例如尿C5a和sC5b-9)二者浓度降低 所指示的那样。参见图20A-B。在基线处，aHUS患者与NHV相比显示出显著的末端补体活化， 不管在一些患者中使用PE/PI或正常血小板计数。实际上，aHUS患者显示出比NHV高45倍的 尿C5a和高305倍的尿sC5b-9水平。然而，在持续依库丽单抗治疗期间，所有aHUS患者都显示 出快速有力的末端补体阻断，伴随致病性末端补体活化产物的完全正常化以及相对于NHV 的水平无差异。

此外，持续的依库丽单抗治疗使肾损伤生物标志物蛋白的浓度正常化(图21A-C)。 在开始依库丽单抗之前，大多数患者具有升高的生物标志物水平，所述生物标志物为：小管 间质损伤和肾功能减退(例如L-FABP-1，比NHV高～48倍)、肾小球滤过(例如半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C，比NHV高～24倍)、近端小管损伤(例如簇蛋白，比NHV高8.6倍)的生物标志物。然 而，用依库丽单抗持续治疗大幅降低FABP-1(降低多达100％)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(降 低多达99％)、和簇蛋白(降低多达98％)的尿浓度。这种降低跨越所有时间点都是显著的 (所有P＜0.0001)并且所有肾损伤标志物的降低的浓度与NHV中的水平没有差异。另外的肾 损伤标志物(例如TIMP-1和β2-微球蛋白)也正常化(参见上文实施例2下的内容)。这些结果 提示，器官局部缺血和损伤可能是完全末端补体依赖性的，并证实了临床数据，该临床数据 证明对补体介导的TMA的持续抑制导致临床上有意义的eGFR改善和透析中止。

持续的依库丽单抗治疗也显著降低补体旁路途径活化(参见图22)。在依库丽单抗 治疗前，所有aHUS患者都显示出显著系统性的C5上游CAP活化，其Ba水平比NHV高5.5倍。然 而，在开始依库丽单抗治疗后，CAP活化的上游生物标志物的浓度(例如Ba水平)降低30％并 且在第4-6周后在所有时间点的降低与NHV中的标志物浓度相比都是显著的(p＜0.005)。但 是用依库丽单抗治疗的aHUS患者中的Ba水平没有正常化，提示CAP活性仍在持续，反映了 aHUS患者中根本的补体失调。然而要明确的是，用依库丽单抗实现的末端补体阻断保护患 者免遭正在进行的CAP活化的临床后果。

此外，用依库丽单抗对aHUS患者的长期治疗导致炎症、内皮活化、和组织损伤相关 生物标志物浓度的显著降低(图23A-C)。100％的aHUS患者在基线处血清sTNFR1水平是升高 的(比NHV水平高18.7倍)。用依库丽单抗持续治疗使sTNFR1显著降低多达94％。这些生物标 志物浓度在第4-6周的降低跨越所有时间点都是显著的(P＜0.0001)。在基线处＞95％的 aHUS患者中可溶的VCAM-1和TM水平与NHV相比分别升高了2倍和3.6倍，证明了依库丽单抗 治疗前显著的内皮细胞活化和损伤。在依库丽单抗治疗期间TM和sVCAM-1浓度也是显著降 低的。第12-17周后，内皮损伤生物标志物浓度的降低跨越所有随后的时间点都是显著的 (TM；P＜0.0001)，但与NHV相比仍是适度升高的。大幅降低的可溶的TM水平可能反映了与膜 结合的TM的恢复，其针对血栓形成的风险是保护性的。

最后，用依库丽单抗的长期治疗快速且显著地降低了血栓形成风险和凝血相关生 物标志物的浓度(图24A-B)。在大于94％的aHUS患者中凝血生物标志物F1+2和D-二聚体的 浓度在基线处是显著升高的(比NHV高5.5倍和9.8倍，分别为P＜0.0001和P＝0.0002)。但F1 +2和D-二聚体在开始用依库丽单抗治疗后2.5周是显著降低的。采用持续的依库丽单抗治 疗，F1+2的浓度降低了多达88％(所有时间点P＜0.05)而D-二聚体的浓度降低了多达99％ (所有时间点P＜0.0001)。然而，这两个标志物相对于其各自在正常健康受试者中的浓度是 保持适度升高的。

结论

根据上文的数据，发明人能够得出一些结论。第一，在基线处，与来自正常健康志 愿者(NHV)的样品中的水平相比，aHUS患者中所有血栓形成性微血管病(TMA)生物标志物的 升高的水平是明显的。在所有患者群体中(包括接受PE/PI的那些或具有正常血小板、Hp或 LDH的那些)，aHUS患者在如下测量值方面显示出相对于NHV显著的升高：末端补体活化(比 NHV水平高45-305倍)；生命器官损伤；补体活化旁路途径(例如，如Ba水平所呈现的，比NHV 水平高5.5倍)；血管炎症；内皮活化和损伤；以及凝血。

对aHUS患者持续的依库丽单抗治疗使高度升高的末端补体活化标志物降低并正 常化。用依库丽单抗对末端补体活化的抑制还使器官损伤标志物大幅降低且正常化。旁路 途径活化的上游生物标志物也显著降低，但没有正常化。并且在经治疗的患者中低水平的 旁路途径活化持续，这反映了aHUS患者中根本的补体失调。这就是说，数据明确指示，用依 库丽单抗的末端补体阻断，保护aHUS患者免遭进行中的旁路途径活化的临床后果。

此外，持续的依库丽单抗治疗还导致：(i)血管炎症标志物显著且持续的降低(降 低多达94％)；(ii)内皮活化标志物的显著降低(降低多达60％)；(iii)内皮损伤标志物显 著且持续降低(降低多达77％)至接近正常水平，显示了末端补体活化和内皮损伤之间明确 的相关性；以及(iv)血栓形成风险生物标志物浓度的显著降低(降低多达99％)，可能降低 了血块形成的潜能并因此降低了这些患者中TMA的发病率。不受任何理论或作用机制的束 缚，发明人得出结论，用依库丽单抗对末端补体活化的抑制必须是持续的，因为aHUS中末端 补体抑制的失去会导致严重放大的末端补体活化的快速增加，随后导致：根本的亚临床内 皮活化的增加、内皮损伤的显著加速、血栓形成风险的显著增加、以及早期和持续的极为严 重的血管局部缺血及生命器官损伤风险。此外，这些数据表明肾损伤、血管炎症、和内皮损 伤及活化整体或部分地依赖于末端补体活性，用依库丽单抗有效且安全地抑制该活性。

当参考本发明的具体实施方案来描述本发明时，本领域技术人员应理解其在没有 背离本发明实质主旨和范围的情况下可以进行多种变化，并且可以对等同内容进行替换。 此外，可以进行许多修改，以使具体的情况、材料、物质的组合物、工艺、或一个或多个工序 步骤适应本发明的目标、主旨和范围。所有此类修改视为在本发明的范围内。